專利名稱：編碼杜氏鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的基因，具體地說涉及從杜氏鹽藻(Dunaliellasaline)中分離的編碼八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)的新基因。
背景技術(shù)：
β-胡蘿卜素在人體內(nèi)是維生素A的前體，廣泛用于食品、化妝品的添加劑及藥品和保健品方面。目前市場上對β-胡蘿卜素的需求主要通過三孢布拉霉發(fā)酵、從養(yǎng)殖的鹽藻中直接提取以及化學合成滿足，但仍然是供不應求。杜氏鹽藻(Dunaliella salina)簡稱鹽藻，是一種單細胞綠藻，能在適宜的條件下累積大量的β-胡蘿卜素，其含量最高可超過干重的10％，是公認的產(chǎn)β-胡蘿卜素最好的天然資源。八氫番茄紅素是β-胡蘿卜素合成途徑中的前體物質(zhì)，是第一個無色的類胡蘿卜素分子。八氫番茄紅素脫氫酶的功能是催化八氫番茄紅素發(fā)生連續(xù)的脫氫反應，形成可以成環(huán)的番茄紅素或其中間體，。
綠藻中，現(xiàn)已分離出該基因的物種有巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)(GBAN Y14807)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)(GBAN X86783)，并且報道的只是該基因的mRNA序列。另外還報道了萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PDS的EST序列發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供從鹽氏杜氏藻中分離獲得的八氫番茄紅素脫氫酶基因的cDNA序列。
本發(fā)明通過與鹽藻親緣關(guān)系較近的三種綠藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis；Chlamydomonas reinhardtii)和五種植物(Arabidopsis thaliana，zea mays，Lycopersicon esculentum，Capsicumannuum，Oryza sative)，以及噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)的八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)的氨基酸序列進行對比分析，推測可能的保守區(qū)，在保守區(qū)的位置直接按照Dunaliella bardawil的核苷酸序列設計6條特異引物，利用RT-PCR的方法擴增出鹽藻PDS cDNA的部分序列。進而通過RACE-PCR技術(shù)獲得包括起始密碼子的上游序列。
附圖的簡要說明

圖1為本發(fā)明采用的RACE-PCR原理圖。
發(fā)明的
具體實施例方式
通過與鹽藻親緣關(guān)系較近的兩種綠藻(Dunaliella bardawil，Haematococcus pluvialis)和五種植物(Arabidopsis thaliana，zea mays，Lycopersicon esculentum，Capsicum annuum，Oryza sative)的八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)的氨基酸序列進行對比分析，推測可能的保守區(qū)，在保守區(qū)的位置直接按照Dunaliella bardawil的核苷酸序列設計如下6條特異引物上游引物PDS921-F1，5’-CTTTGGTGCTTACCCCAACA-3’，PDS921-F2，5’-GAGCAGGATGAGCTGAC-3’，PDS921-F3，5’-TGGCGAAGGCCCTGAACT-3’；下游引物PDS921-R1，5’-GCAGGAAACGGTTCAGTG-3’PDS921-R2，5’-CTTCATGATGTCCACTGGCA-3’PDS921-R3，5’-TCACCCGCCAGGTAGAAG-3’。
從對數(shù)后期的鹽藻中提取總RNA，用BD Clontech powerscript反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA作為PCR模板擴增出鹽藻PDS cDNA的部分序列。反應程序為94℃預變性5min進入循環(huán)過程；94℃變性30sec，47℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環(huán)。最后以72℃延伸10min。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析。
取不同時間段培養(yǎng)的鹽藻RNA進行如上反應。引物組合PDS921-F1/R2能擴增出一致性較好，特異性較強的一650bp的條帶，凝膠回收后連接到pGEM-T easy(Promega)載體上，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞。對陽性克隆進行測序，并用BLAST程序?qū)π蛄羞M行同源性分析。該片段與Dunaliella bardawil PDS的氨基酸和核苷酸序列的一致性分別達到92％和88％，初步確定它是的鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶cDNA片段。
根據(jù)已知的該段序列設計了一條基因特異性下游引物(5’-GGGCTGGGATGTCTGGGAACTCAA-3’)進行5’-RACE。其原理是先是利用真核生物mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以Oligo(dT)18VN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶PowerscriptMMLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標準第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的5‘末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有寡核苷酸序列Oliogo(dG)的通用接頭引物(5’-GGGTCTAGAGAATTCGGATCCAGGGGG-3’)配對后，轉(zhuǎn)換為以該引物序列為模板繼續(xù)延伸。用該引物序列作為上游引物，用上述的基因特異引物作為下游引物，以第一鏈cDNA為模板，進行降落PCR循環(huán)，把目的基因5’末端的cDNA片段擴增出來。
經(jīng)類似的克隆和測序后作BLAST分析，發(fā)現(xiàn)這段長394bp的5’末端cDNA序列包含起始密碼子。將上述兩段序列拼接后獲得一段長1047bp的鹽藻PDS cDNA序列。
PDS的基因序列如SEQ ID.1所示。
03序列~1SEQUENCE LISTING<110>華南理工大學<120>編碼杜氏鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶的基因<130>200502<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1037<212>cDNA<213>杜氏鹽藻(Dunaliella salina)<400>1atgcaggtta tgcaaggcag ggcacacgcg caggccgctt cttttaacag caagcctgtc 60cagcagaggc gcacgcagcg gaaagtaggc aggtcccgcc tgcaggtgta cgccagggat 120ttcccagctc ctcagttcga tggcacggag acgtaccagg aggccgtggc cctgtccaca 180aagctgcaaa atgccccccg gccagtaaag ccacagcgtg tcgtcattgc tggagccggc 240ctggctggcc tacccgctgc caagtacctt tctgaacgct ggccacatcc ccgtcgtgct 300ggaggcccgc gatgtgctgg ggggcaaggt ggccgcatgg aaggacgaag atggggactg 360gtatgagact ggcctgcaca tctttttcgg cgcatacccc aacatgcagc ggctgttcaa 420ggagctcaac atctctgaca ggttacagtg gaagagccac tctatgattt ttgccatgca 480agacaagcct ggagagttct cgccttttga gttcccagac atcccagccc catggaacgg 540tgtcattgcc atcctacgca acaatgagat gctgtcgtgg cctgagaaga tccagtttgc 600tgttggcctg ctgccggcca tcatcttcgg ccagaagtat gtggaagagc aggatgaact 660gacagtaact cagtggatgc agaagcaggg cgtgcccagc cgagtaaacg atgaggtctt 720cattgccatg gccaaggccc tcaacttcat caaccccgat gagctgtcca tgactgtcgt 780gctgacagcg ctgaaccgct tcttgcaaga gcgacatgga agcaagatgg cctttcttga 840tggtgctcct ccagagcgct tgtgccagcc catggtggac tacttcactt ccaggggtgg 900agagctaaag atgaacgcac gcatcaagca aatcgtgctc aatgaggaca acagcgtcaa 960gcacttcgag ctgctgaacg gagagattgt tgagggagat gcgtacatgt ctgcaatgcc 1020aggtggacat catgaag 103權(quán)利要求
1.一種分離的核苷酸，編碼八氫番茄紅素脫氫酶，其具有SEQ IDNO.1所示序列。
2.權(quán)利要求1所述的核苷酸，其特征在于其從杜氏鹽藻中分離。
3.由權(quán)利要求1的核苷酸編碼的氨基酸序列。
4.含有權(quán)利要求1所述核苷酸的表達載體。
5.含有權(quán)利要求1所述核苷酸的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供從杜氏鹽藻(Dunaliella salena)中分離的編碼八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)的新基因，為利用基因重組技術(shù)獲得高效產(chǎn)β－胡蘿卜素工程菌或是對天然鹽藻進行生物改造以提高β－胡蘿卜素的產(chǎn)量奠定基礎。
文檔編號C12N9/04GK1670212SQ200510033238
公開日2005年9月21日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日
發(fā)明者姜建國, 朱躍輝 申請人:華南理工大學