專利名稱：編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及甘薯(Ipomoea batatas)中表達的編碼八氫番茄紅素合成酶(Ipomoeabatatas phytoene synthase)的cDNA序列。
背景技術(shù)：
β-胡蘿卜素(β-Carotene)的生物合成主要發(fā)生于高等植物、藻類、真菌和細菌體內(nèi)，動物體內(nèi)不能從頭合成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素是維生素A(Vitamin A)的前體，在人體內(nèi)可根據(jù)需要轉(zhuǎn)化為維生素A。它具有營養(yǎng)、著色的雙重作用，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會認定的A類優(yōu)秀有營養(yǎng)的食品添加劑(foodadditives)。近年來，越來越多的醫(yī)學研究表明，β-胡蘿卜素可抗多種癌癥，特別是可降低肺癌發(fā)病率。β-胡蘿卜素在淬滅自由基，增強人體免疫力，預防心血管疾病等保護人類健康方面起著重要的作用。
天然β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體比例高，目前化學合成法還無法合成β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體，而順式異構(gòu)體已被臨床證明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能遠遠高于全反式異構(gòu)體。
類胡蘿卜素合成是一個十分龐大的次生代謝途徑，β-胡蘿卜素的合成從牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)開始，依次經(jīng)八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶和番茄紅素β-環(huán)化酶的催化，最終合成β-胡蘿卜素，八氫番茄紅素合成酶是β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列。
在本發(fā)明中，“分離的”cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在產(chǎn)生本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列時，可以將編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成甘薯八氫番茄紅素合成酶基因的表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
獲得有關(guān)的序列后，用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進行連接而獲得編碼本發(fā)明甘薯八氫番茄紅素合成酶的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。
表2列出了本發(fā)明的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列與辣椒八氫番茄紅素合成酶cDNA(GenBank Accession No.X68017)序列的同源比較圖。
下面結(jié)合具體步驟，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些步驟僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列步驟中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆》、《實驗室手冊》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
步驟1編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列的克隆1.組織分離(isolation)紅心甘薯品種金山72來源于福建農(nóng)林大學作物學院薯類研究室，在大田種植80天，取幼嫩塊根，用液氮速凍。
2.總RNA的分離(total RNA isolation)和檢測取根部，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，電泳圖譜呈現(xiàn)出3條清晰可區(qū)分的條帶，其中28SRNA∶18SRNA比值約為2∶1，表明總RNA基本上未降解，可用于編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列的克隆。
3.全長cDNA序列的克隆(Cloning of Full-length cDNA)進行全長cDNA序列克隆，分四個階段進行(1)RT-PCR根據(jù)黃水仙、玉米、番茄、胡蘿卜、辣椒的編碼八氫番茄紅素合成酶的核酸保守序列，設(shè)計保守引物，保守序列的正向與反向引物分別為SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2。采用RT-PCR的方法(TaKaRa試劑盒)，得到保守序列psy con(422bp)，連接到T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，獲得的保守序列與已知番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(C.annuum)、柑桔(Citrus unshiu)的八氫番茄紅素合成酶基因的同源性分別為83％、83％、82％，初步認為它是一個編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的一個片段。
(2)3’-RACE反轉(zhuǎn)錄總RNA，得到第一鏈cDNA。
第一輪PCR(引物為GR3(SEQ ID NO.9)+SEQ ID NO.3)第二輪PCR(GR3N(SEQ ID NO.10)+SEQ ID NO.4)得到psy3(551bp)其它過程如同(1)所示。
測序結(jié)果已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列與已知番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(C.annuum)、柑桔(Citrus unshiu)的編碼八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列的同源性分別為83％、83％、82％，故可進一步確認它是一個編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的一個片段。
(3)5’-RACE第一輪PCR(GR5(SEQ ID NO.11)+SEQ ID NO.5)第二輪PCR(GR5N(SEQ ID NO.12)+SEQ ID NO.6)得到psy5(615bp)其它過程如同(1)所示。
(4)PCR擴增甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的編碼區(qū)通過組合使用上述方法，拼接候選的編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的全長核苷酸序列，在獲得該序列(至少包含完整的開放讀框)信息的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計正向引物psyF(SEQ IDNO.7)和反向引物psyR(SEQ ID NO.8)，以總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的Pyrobest酶，進行PCR擴增，PCR條件為94℃ 5min，隨之以94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 2min進行30個循環(huán)，最后以72℃延伸10min。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段長度為1,363bp。
因此，組合上述4種方法得到的結(jié)果，獲得了編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的全長cDNA序列(表1)。
BLAST的結(jié)果證明從甘薯中新得到的基因確為八氫番茄紅素合成酶cDNA。由于已知的同源八氫番茄紅素合成酶能夠催化GGPP合成八氫番茄紅素，故推測該cDNA具有相同的功能。
步驟2甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘薯八氫番茄紅素合成酶全長cDNA的長度為1,500bp，開放讀框位于55-1368位核苷酸，詳細序列見表1。將甘薯八氫番茄紅素合成酶的全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸同源性檢索，結(jié)果甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA與辣椒(Capsicum annuum)的八氫番茄紅素合成酶cDNA(GenBank Accession No.X68017)的在核苷酸水平上有76％的相同性，可以認為兩者在功能上有很高相似性。
步驟3甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的功能分析在該步驟中，將編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列構(gòu)建入植物表達載體之中，并轉(zhuǎn)化煙草，以鑒定其功能。
1.植物表達載體的構(gòu)建依據(jù)甘薯八氫番茄紅素合成酶全長cDNA序列(表1)，設(shè)計擴增出完整閱讀框的引物，分別在正反引物上引入限制性內(nèi)切酶位點正反引物分別引入XbaI和KpnI酶切位點。以步驟1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，保證甘薯八氫番茄紅素合成酶的閱讀框完全正確。分別用內(nèi)切酶XbaI和KpnI進行37℃酶切3h，回收目的片段1,363bp；載體p2300用XbaI和KpnI內(nèi)切酶37℃酶切3h，分別回收目的片段。將經(jīng)酶切的甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的目的片段與經(jīng)相應內(nèi)切酶切過的p2300載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)20h，進行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。
2.植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)取一份感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，加入含甘薯八氫番茄紅素合成酶cDNA的植物表達載體約1μg，輕輕混勻；(2)于液氮中速凍2分鐘，37℃溫育5分鐘；(3)加入500μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃輕搖2-4小時，消除感受態(tài)；(4)分別取50-200μl菌液，分別涂布于含適當抗生素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
(5)鑒定呈陽性的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種到含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素的20ml液體YEB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)30個小時至對數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋20-30倍。
3.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及再生(1)取無菌煙草葉片，切除葉片邊緣與中脈，于Ms+1.0mg/L NAA固體培養(yǎng)基中28℃預培養(yǎng)2天；(2)重新取出材料，放入無菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過的帶有目的基因的農(nóng)桿菌中，浸泡15分鐘，然后在有28℃搖床中低速搖15分鐘；(3)取出小葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液，于MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)兩天；(4)把小葉片，用加500mg/L Cb的無菌水洗兩次，無菌濾紙吸去多余菌液后，轉(zhuǎn)入含100mg/LKm和500mg/L Cb分化培養(yǎng)基M1中，28℃光下培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長出芽，其間每15天繼代一次；(5)將長至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2Ms上誘導生根。
(6)經(jīng)鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因煙草后，繼續(xù)培養(yǎng)成苗。
4.轉(zhuǎn)基因煙草葉片類胡蘿卜素的提取(1)取各轉(zhuǎn)基因煙草葉片，迅速冷凍干燥，制成凍干粉，置真空干燥箱中避光保存，并盡快測定。
(2)準確稱取凍干粉1.000g于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮∶乙醇＝3∶2)45mL，搖勻，蓋上瓶塞，用超聲波提取20分鐘，過濾于50mL容量瓶中并定容。取20mL濾液置分液漏斗中，加入10mL石油醚混勻，加入10mL蒸餾水進行分配，取石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，剩余水加入10mL石油醚進行再分配，合并2次石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40-45℃蒸干，用2.0mL異丙醇溶解，過濾后上機測定。
5.高效液相色譜法測定轉(zhuǎn)基因煙草葉片類胡蘿卜素(1)β-胡蘿卜素標樣的制備β-胡蘿卜素標淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動相至刻度，此時濃度為0.004mg/ml。
(2)番茄紅素標樣的制備番茄紅素標淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動相至刻度，此時濃度為0.004mg/ml。
(3)測定方法流動相乙腈∶三氯甲烷(92∶8)。檢測波長雙波長測定，470nm(0-min)和450nm(8-13min)。流速1.0mL/min。柱溫35℃。觀測樣品在470nm與450nm處有吸收峰的大小變化。
本發(fā)明涉及的記號及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1TGGTGT/cAGGC/aGG/aACAGATGA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸
(iii)序列描述SEQ ID NO.2CTTCCTCTTCTA/g/c/t GCATCTTCT/gCC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3CATTCTCAGAGACGTAGGCGAAGA(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4CTAGACGGGGGAGGGTCTATTTAC(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.5AGGGCGGTTGGAGTTATATGCGAT(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.6AGTCTCGTACCAGTCTCCGTCAT
(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度28bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.7GCTCTAGACACCTCAGCTCAAGAATGTC(8)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.8CAGAATGCTTTCAGCTTCTTCAGTAC(9)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長度25bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.9GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG(10)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.10CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(11)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征
(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(12)SEQ ID NO.12的信息(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.12GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
表1編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列<110>福建農(nóng)林大學<120>編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>1500<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<221>gene<222>(1)…(1500)<400>Full length sequence of phytoene synthase gene from Ipomoea batatas1GAAAACAAAA TCTTGGAAGT AGTTATATAG AAACTATTTC ACCTCAGCTC AAGAATGTCT61 AGTGCCTTGC TGTGGGCTGT TTCTCCCTCT TCTGAGCTAT CGAATGGCAC TGGAATCTTT121 TATTCGGTGA GGGAGGGAAT CCGGATTGTG GATTCGTCGA GGTTCCTTGG CAGGAACAGG181 AGTTTGGTGT ACAAAGGCAG GGCTAAGAAG GGTAAGAAAC AAAGATGCAC TTTGGCATCT241 TTCAATGCAG ACTCGAGGTA TCTTTGCTCG GGAGGGTCGA GCTTGAAGAA TGGAGGGAAA301 TCCTCTGTGC TTTCGAATGC GGTGGTTAGC CCAGCCGGGG AAATGGCGAT GTCATCTGAG361 CAAAAGGTGT ACGATGTAGT GTTGAAGCAG GCTGCTTTGG TGAATAGGAG GTTGAGATCC421 ATAGATAATT TGGAGGTGAA GCCCGATATA GCCCTTCCGG GCGATTTGGG CGTGTTGAGT481 GAAGCTTATG ATCGATGCGG TGAAGTATGT GCAGAGTATG CTAAGACGTT TTATTTGGGA541 ACCATGCTAA TGACACCTGA GAGAAGAAGA GCTATCTGGG CGATATATGT GTGGTGTAGG601 CGGACAGATG AGCTCGTTGA CGGGCCTAAT GCATCGCATA TAACTCCAAC CGCCCTGGAC661 AGATGGGAGG CTCGGCTGGA AGACGTATTC AGAGGGCGCC CGTTTGATAT GCTCGACGCT721 GCACTATCAG ATACAGTATC CAGGTTTCCA GTTGATATTC AGCCCTTTAG GGATATGATT781 GAAGGAATGC GAATGGACCT CTGGAAATCG AGATACGATA ACTTTGATGA GCTATACCTG841 TACTGTTATT ACGTTGCTGG TACAGTTGGT TTGATGAGTG TCCCGGTTAT GGGCATTGCG901 CCCGAATCAA AGGCAACTAC AGAGAGTGTC TATAATGCCG CTTTGGCTTT AGGCATCGCT961 AATCAACTAA CCAACATTCT CAGAGACGTA GGCGAAGATG CTAGACGGGG GAGGGTCTAT1021 TTACCTCAAG ATGAATTAGC TCAAGCGGGG CTCTCTGATG AGGATATATA TGCTGGAAAA
1081 GTTACTGATA AGTGGAGGAA CTTCATGAAG AAGCAAATCA AGAGAGCAAG GAAGTTCTTC1141 GACGAGGCCG AGAGAGGCGT GACTGAACTT AGCTCCGCTA GTCGATGGCC AGTGTGGGCG1201 TCGCTGCTGT TGTACCGCAA GATTCTCGAC GAGATCGAAG CCAACGACTA CAACAACTTC1261 ACAAGGAGAG CCTATGTAAG CAAGCCAAAG AAACTGCTTG CATTGCCTAT TGCATATGCA1321 AAAGCTGTGA TTCGACCATC AACAACTGCT TCCCCTCTGG CAAAAGCTTG AACACAAATT1381 ATTATACTGT GTAATACTGT ACTGAAGAAG CTGAAAGCAT TCTGTACATT ACAACTTTGT1441 AATATTGCAA TGTAAAATCA ACAGTAGATA GTGAATTCAG TTCCTCAAAA AAAAAAAAAA
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241 TTCAATGCAGACTCGAGGTATCTTTGCTCGGGAGGGTCGAGCTTGAAGAATGGAGGGAAA||| | | | |||| | |||||| | | |||| |||||154 ..CAAAGGTGGAGTTTTGGTTCTTACTT.GGGAGGAGCACAAACTGGAAGTGGACGGAAA301 TCCTCTGTGCTTTCGAATGCGGTGGTTAGCCCAGCCGGGGAAATGGCGATGTCATCTGAG| ||||| | ||| | |||| || || || || |||||| |||||||||| ||211 TTTTCTGTACGTTCTGCTATCGTGGCTACTCCGGCTGGAGAAATGACGATGTCATCAGAA361 CAAAAGGTGTACGATGTAGTGTTGAAGCAGGCTGCTTTGGTGAATAGGAGGTTGAGATCC| | ||| || ||||| || |||| |||||| || |||||||| || | |||||||271 CGGATGGTATATGATGTGGTTTTGAGGCAGGCAGCCTTGGTGAAGAGACAGCTGAGATCG421 ATAGATAATTTGGAGGTGAAGCCCGATATAGCCCTTCCGGGCGATTTGGGCGTGTTGAGT| ||| | || || |||||| |||||| | ||||||| ||||||| ||||||||331 ACCGATGAGTTAGATGTGAAGAAGGATATACCTATTCCGGGGACTTTGGGCTTGTTGAGT481 GAAGCTTATGATCGATGCGGTGAAGTATGTGCAGAGTATGCTAAGACGTTTTATTTGGGA||||| |||||| | || ||||||||||||||||||| || ||||||||||| || |||391 GAAGCATATGATAGGTGTAGTGAAGTATGTGCAGAGTACGCAAAGACGTTTTACTTAGGA
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1081 GTTACTGATAAGTGGAGGAACTTCATGAAGAAGCAAATCAAGAGAGCAAGGAAGTTCTTC|| || ||||| ||||| | |||||||||||| ||||| |||| ||||| ||||||||991 GTGACCGATAAATGGAGAATCTTCATGAAGAAACAAATTCAGAGGGCAAGAAAGTTCTTT1141 GACGAGGCCGAGAGAGGCGTGACTGAACTTAGCTCCGCTAGTCGATGGCCAGTGTGGGCG|||||||| |||| ||| ||||| ||| | ||| | |||||| ||||||| |||| |||1051 GACGAGGCAGAGAAAGGAGTGACCGAATTGAGCGCAGCTAGTAGATGGCCTGTGTTGGCA1201 TCGCTGCTGTTGTACCGCAAGATTCTCGACGAGATCGAAGCCAACGACTACAACAACTTC|| |||||||||||||||| ||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||||1111 TCTCTGCTGTTGTACCGCAGGATACTGGACGAGATCGAAGCCAATGACTACAACAACTTC1261 ACAAGGAGAGCCTATGTAAGCAAGCCAAAGAAACTGCTTGCATTGCCTATTGCATATGCA|||| |||||| ||||| ||||| |||||||| || ||||||| |||||||||||||||1171 ACAAAGAGAGCTTATGTGAGCAAACCAAAGAAGTTGATTGCATTACCTATTGCATATGCA1321 AAAGCTGTGATTCGACCATCAACAACTGCTTCCCCTCTGGCAAAAGCTTGAACACAAATT||| || | | |||||| | | |||| || |1231 AAATCTCTTGTG.....................CCTTCTACAAGAACATGAAATCAGGAT1381 ATTATACTGTGTAATACTGTACTGAAGAAGCTGAAAGCATTCTGTACATTACAACTTTGT||||| || | |||||1270 TTTATATAAATCAAGGCCAA..TGAAGC1441 AATATTGCAATGTAAAATCAACAGTAGATAGTGAATTCAGTTCCTCAAAAAAAAAAAAAA上列編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列下列辣椒八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列(GenBank Accession No.X68017)
權(quán)利要求
1.編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA序列，其特征是從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長cDNA核苷酸序列的長度為1,500bp，其中開放閱讀框位于55-1368位核苷酸，具體如下1 GAAAACAAAA TCTTGGAAGT AGTTATATAG AAACTATTTC ACCTCAGCTC AAGAATGTCT61AGTGCCTTGC TGTGGGCTGT TTCTCCCTCT TCTGAGCTAT CGAATGGCAC TGGAATCTTT121 TATTCGGTGA GGGAGGGAAT CCGGATTGTG GATTCGTCGA GGTTCCTTGG CAGGAACAGG181 AGTTTGGTGT ACAAAGGCAG GGCTAAGAAG GGTAAGAAAC AAAGATGCAC TTTGGCATCT241 TTCAATGCAG ACTCGAGGTA TCTTTGCTCG GGAGGGTCGA GCTTGAAGAA TGGAGGGAAA301 TCCTCTGTGC TTTCGAATGC GGTGGTTAGC CCAGCCGGGG AAATGGCGAT GTCATCTGAG361 CAAAAGGTGT ACGATGTAGT GTTGAAGCAG GCTGCTTTGG TGAATAGGAG GTTGAGATCC421 ATAGATAATT TGGAGGTGAA GCCCGATATA GCCCTTCCGG GCGATTTGGG CGTGTTGAGT481 GAAGCTTATG ATCGATGCGG TGAAGTATGT GCAGAGTATG CTAAGACGTT TTATTTGGGA541 ACCATGCTAA TGACACCTGA GAGAAGAAGA GCTATCTGGG CGATATATGT GTGGTGTAGG601 CGGACAGATG AGCTCGTTGA CGGGCCTAAT GCATCGCATA TAACTCCAAC CGCCCTGGAC661 AGATGGGAGG CTCGGCTGGA AGACGTATTC AGAGGGCGCC CGTTTGATAT GCTCGACGCT721 GCACTATCAG ATACAGTATC CAGGTTTCCA GTTGATATTC AGCCCTTTAG GGATATGATT781 GAAGGAATGC GAATGGACCT CTGGAAATCG AGATACGATA ACTTTGATGA GCTATACCTG841 TACTGTTATT ACGTTGCTGG TACAGTTGGT TTGATGAGTG TCCCGGTTAT GGGCATTGCG901 CCCGAATCAA AGGCAACTAC AGAGAGTGTC TATAATGCCG CTTTGGCTTT AGGCATCGCT961 AATCAACTAA CCAACATTCT CAGAGACGTA GGCGAAGATG CTAGACGGGG GAGGGTCTAT1021 TTACCTCAAG ATGAATTAGC TCAAGCGGGG CTCTCTGATG AGGATATATA TGCTGGAAAA1081 GTTACTGATA AGTGGAGGAA CTTCATGAAG AAGCAAATCA AGAGAGCAAG GAAGTTCTTC1141 GACGAGGCCG AGAGAGGCGT GACTGAACTT AGCTCCGCTA GTCGATGGCC AGTGTGGGCG1201 TCGCTGCTGT TGTACCGCAA GATTCTCGAC GAGATCGAAG CCAACGACTA CAACAACTTC1261 ACAAGGAGAG CCTATGTAAG CAAGCCAAAG AAACTGCTTG CATTGCCTAT TGCATATGCA1321 AAAGCTGTGA TTCGACCATC AACAACTGCT TCCCCTCTGG CAAAAGCTTG AACACAAATT1381 ATTATACTGT GTAATACTGT ACTGAAGAAG CTGAAAGCAT TCTGTACATT ACAACTTTGT1441 AATATTGCAA TGTAAAATCA ACAGTAGATA GTGAATTCAG TTCCTCAAAA AAAAAAAAAA
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼甘薯八氫番茄紅素合成酶的cDNA核苷酸序列，從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長cDNA的長度為1,500bp，開放閱讀框為1,314bp，詳細序列如表1。八氫番茄紅素合成酶催化兩個GGPP縮合形成八氫番茄紅素，是甘薯β－胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，因此該核苷酸序列有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/52GK1757732SQ20051008084
公開日2006年4月12日 申請日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者鄭金貴, 陳選陽, 劉峰, 許明, 黃志偉 申請人:福建農(nóng)林大學