專(zhuān)利名稱(chēng)：同時(shí)檢測(cè)a、b型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法及其試劑盒，更具體地說(shuō)，涉及一種同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
眾所周知，禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一種烈性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，我國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)際獸醫(yī)局都將其定為A類(lèi)傳染病。禽流感其病理變化因感染病毒毒株毒力的強(qiáng)弱、病程長(zhǎng)短和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類(lèi)、年齡、性別、并發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致。自1878年禽流感在意大利爆發(fā)和流行到如今已有100多年的歷史。禽流感已成為具有重要公共衛(wèi)生意義的傳染病，該病不僅具有發(fā)生突然、傳播迅速、發(fā)病率高、致死率高等特點(diǎn)，而且禽流感病毒是幾乎所有A型流感病毒的基因庫(kù)，其自然宿主的廣泛性及遺傳變異給禽流感的及時(shí)定性診斷和預(yù)防帶來(lái)很大困難。由于候鳥(niǎo)的遷徙和國(guó)際間禽類(lèi)貿(mào)易的日益頻繁，使得該病呈全球性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以往認(rèn)為禽流感病毒對(duì)人群無(wú)致病力，但1997年“香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷蘭H7至2004年亞洲的H5均發(fā)生感染人，甚至導(dǎo)致人員死亡，死亡率約30％左右。其危害性比2003年的SARS還大、還難于預(yù)料。在現(xiàn)有技術(shù)中，長(zhǎng)期以來(lái)禽流感的診斷一直依賴(lài)于病原的分離和鑒定。近年來(lái)相繼建立的禽流感瓊脂擴(kuò)散(AGP)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NI)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELAISA)等血清學(xué)診斷技術(shù)及分子診斷技術(shù)(RT-PCR)，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足不了我國(guó)禽流感及呼吸道疾病的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)診斷與防制的迫切需要。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，是集PCR擴(kuò)增技術(shù)、探針雜交技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移光譜技術(shù)于一體的新興技術(shù)，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，是目前國(guó)際上用在病毒檢測(cè)上最先進(jìn)的檢測(cè)方法之一，具有普通的PCR擴(kuò)增技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)1、特異性高因?yàn)橹挥挟?dāng)探針與待測(cè)模板匹配時(shí)Taq酶才會(huì)啟動(dòng)其5’-3’端的外切酶活性，將探針上的熒光基團(tuán)切割下來(lái)而產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)，因此熒光定量PCR技術(shù)克服了普通PCR由于非特異性擴(kuò)增而導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題；2、敏感度高熒光PCR技術(shù)可檢出極低拷貝數(shù)的核酸，使真正意義上的早期診斷成為現(xiàn)實(shí)；3、高通量、高效率1～2小時(shí)可全自動(dòng)同步完成近百個(gè)樣品的擴(kuò)增及檢測(cè)，且結(jié)果重現(xiàn)性好；4、無(wú)須凝膠電泳，采用全封閉反應(yīng)管及光電傳導(dǎo)系統(tǒng)，無(wú)管道內(nèi)污染。該方法可對(duì)DNA和RNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。
近幾年歐美、日本一些國(guó)家也進(jìn)行RT-PCR和多重?zé)晒舛縋CR的研究。國(guó)內(nèi)未見(jiàn)多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)流感病毒文獻(xiàn)報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)常用的快速檢測(cè)方法為傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷，如傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR技術(shù)易出現(xiàn)假陽(yáng)性、交叉污染、操作步驟多和費(fèi)時(shí)。而雙重?zé)晒舛縋CR具有的操作簡(jiǎn)單、可定量、污染少、檢測(cè)速度快，同時(shí)檢測(cè)A、B型流感病毒。檢出病毒的最小量為10-5TCID50等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受學(xué)者的認(rèn)同和研究?！半p重?zé)晒舛縋CR快速檢測(cè)流感人(禽)病毒和準(zhǔn)確分型”，這一研究不僅在國(guó)內(nèi)屬于首次，而且在國(guó)際上也屬于先進(jìn)水平。在我國(guó)流感快速診斷研究方面仍停留在傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR技術(shù)中，這與我國(guó)作為流感多發(fā)地來(lái)說(shuō)是極不相稱(chēng)，因此，研究開(kāi)發(fā)雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)流感病毒技術(shù)，為使我國(guó)的流感病毒快速診斷技術(shù)盡快的與國(guó)際接軌，適應(yīng)當(dāng)今快速前進(jìn)社會(huì)的發(fā)展，確保人們的生命安全和國(guó)家的利益具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便、污染少、檢測(cè)速度快，并可同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法及試劑盒。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案采用一種同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，過(guò)程包括合成引物和熒光探針，和使用所述的引物、探針及其它聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成份組成熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA或提取RNA，加入前述的反應(yīng)體系中，經(jīng)混合后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)測(cè)定，本發(fā)明的具體方法為(1)針對(duì)A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應(yīng)探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；(2)建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(2-1)建立具有如下組分濃度的50μl反應(yīng)體系10倍反應(yīng)緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉(zhuǎn)錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl；(2-2)確立如下的反應(yīng)條件48℃30分鐘→95℃10分鐘→95℃15秒→60℃1分鐘，其中95℃15秒→60℃1分鐘之間進(jìn)行45次循環(huán)；選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進(jìn)行檢測(cè)；(2-3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線取流感A、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)罡呦♂尪葹?0-6，各濃度梯度RNA同時(shí)進(jìn)行熒光反應(yīng)，計(jì)算并匯出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明還提供同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒方法的試劑盒，其中用于100次試驗(yàn)的試劑盒的構(gòu)成為RT-PCR反應(yīng)緩沖液1.6ml，Taq酶(5U/μl)50μl，RT-PCR酶(200U/μl)10μl，RT-PCR酶稀釋液10μl，二乙基焦碳酸酯水1ml，陽(yáng)性對(duì)照1ml，陰性對(duì)照1ml。試劑盒中的RT-PCR酶溶液是使用時(shí)用RT-PCR酶稀釋液稀釋8倍的現(xiàn)配溶液或稀釋后在-20℃下保存一周內(nèi)的酶溶液。換句話(huà)說(shuō)，RT-PCR酶(200U/μl)使用時(shí)，請(qǐng)用RT-PCR酶稀釋液稀釋成25U/μl(8倍稀釋)后使用。盡量保證現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少，稀釋后的酶溶液在-20℃下保存時(shí)不要超過(guò)一周。
本發(fā)明所述的試劑盒，是經(jīng)包裝并在-20℃或以下保存期為一年或以?xún)?nèi)的試劑盒。換句話(huà)說(shuō)，所述試劑盒的保存期為不超過(guò)一年，并應(yīng)經(jīng)包裝后保存。
本發(fā)明試劑盒中的二乙基焦碳酸酯水，也即焦碳酸二乙酯水或DEPC水，采用行業(yè)內(nèi)通用的DEPC水，是用DEPC處理過(guò)的水。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)1、雙重?zé)晒舛縋CR具有操作簡(jiǎn)單、可定量、污染少、檢測(cè)速度快，同時(shí)檢測(cè)A、B型流感病毒，檢出病毒的最小量達(dá)10-5TCID50。2、技術(shù)效果好建立“多重?zé)晒舛縍T-PCR技術(shù)快速檢測(cè)A型、B型流感病毒”的檢測(cè)試劑盒，可在3-4小時(shí)內(nèi)從被檢測(cè)標(biāo)本中，快速、準(zhǔn)確、特異、安全、簡(jiǎn)便的鑒定出流感病毒的A型、B型，檢出病毒的最小量為分別為2.56×10-5，5.0×10-5個(gè)TCID50，可定量分析，比巢式RT-PCR靈敏度高、靈敏，而且不容易污染，而傳統(tǒng)PCR或半巢式-MPCR檢出病毒的最小量為0.01-0.1TCID50。3、適用范圍廣可適用于各種呼吸道病毒疾病及流感、禽流感的檢測(cè)和鑒別，同時(shí)也可檢測(cè)被禽流感病毒污染，而病毒含量級(jí)少，一般方法不容易檢測(cè)到的禽類(lèi)產(chǎn)品和半成品。


以下是本發(fā)明的

圖1是A、B型流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR靈敏度檢測(cè)圖；圖2是A、B型流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR十倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
參照?qǐng)D1，根據(jù)流感毒株A，B TCID50法的滴定結(jié)果，分別取2.56個(gè)和5.0個(gè)TICD50的病毒RNA，分別十倍梯度稀釋?zhuān)畲笙♂尪确謩e為2.56×10-6，5.0×10-6，將相同稀釋度A、B病毒RNA混合加入同一個(gè)雙重反應(yīng)體系管中，熒光RT-PCR反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中可以看出A型曲線的熒光值較B型的要高，這是由于熒光基團(tuán)FAM與CY5本身的差異所造成的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應(yīng)了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的，雙重反應(yīng)體系中A、B病毒10-6濃度組均成陰性，較單一熒光反應(yīng)減少了一個(gè)數(shù)量級(jí)，原因是反應(yīng)體系增加，使得病毒RNA的相對(duì)濃度下降的緣故。
參照?qǐng)D2，分別以A型、B型流感病毒的TCID50濃度為橫坐標(biāo)，以各自RT-PCT循環(huán)的CT值為縱坐標(biāo)作圖，可以得到雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)對(duì)A型、B型病毒進(jìn)行相對(duì)定量的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。其中A型標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.024，擴(kuò)增效率為114.1％，相關(guān)系數(shù)為0.997，幾項(xiàng)參數(shù)與A型單一熒光反應(yīng)均很接近，說(shuō)明此雙重反應(yīng)檢測(cè)體系對(duì)A型流感病毒的檢測(cè)無(wú)明顯影響；B型標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.149，擴(kuò)增效率為107.8％，相關(guān)系數(shù)為0.998，幾項(xiàng)參數(shù)與B型單一熒光反應(yīng)也都很接近，說(shuō)明此雙重反應(yīng)檢測(cè)體系對(duì)B型流感病毒的檢測(cè)也無(wú)明顯影響。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述A、原理概述在熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)體系中，同時(shí)加入分別與A型、B型流感病毒匹配的兩對(duì)引物及兩條特異性的TaqMan探針。兩條探針的兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，其中兩個(gè)報(bào)告基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不同。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq聚合酶的5′→3′外切酶活性將結(jié)合于模板上的探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，根據(jù)針對(duì)A型、B型流感病毒熒光探針?biāo)l(fā)出的不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)就可以從未知樣本中判斷出流感病毒的類(lèi)型。當(dāng)熒光信號(hào)累積達(dá)到儀器設(shè)置的檢測(cè)閾值時(shí)，對(duì)應(yīng)的RT-PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)CT與對(duì)應(yīng)的病毒模板數(shù)之間成線性關(guān)系，可對(duì)病毒進(jìn)行定量分析。
B、實(shí)施詳情1、材料A型、B型流感病毒由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存；RNA提取試劑盒購(gòu)自ROCHE公司；引物及TaqMan探針均由上海博亞公司合成；熒光定量PCR儀是Stratagene公司的MX4000型。
2、方法2.1利用Primer Express軟件分別設(shè)計(jì)針對(duì)A型、B型流感病毒保守序列的引物及其相應(yīng)TaqMan探針。具體DNA序列如下(1)針對(duì)A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應(yīng)探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1，擴(kuò)增片段大小154bp；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2，
擴(kuò)增片段大小170bp；2.2取A型、B型流感病毒培養(yǎng)液各200μl，用ROCHE公司的RNA提取試劑盒分別提取總RNA，用50μl溶解緩沖液溶解。
2.3檢測(cè)試劑盒50μl反應(yīng)體系包括10倍反應(yīng)緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉(zhuǎn)錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl。
2.4反應(yīng)條件先48℃30分鐘；再95℃10分鐘；最后95℃15秒，60℃1分鐘，循環(huán)45次，然后選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進(jìn)行檢測(cè)。
2.5靈敏度分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取適當(dāng)?shù)味鹊牧鞲蠥、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)罡呦♂尪葹?0-6。各濃度梯度RNA同時(shí)進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，由熒光定量PCR儀計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.6檢驗(yàn)試劑盒的研發(fā)及推廣將反應(yīng)體系中相應(yīng)的引物、探針、酶、寡聚核苷酸、鎂離子等分別按比例進(jìn)行混合及包裝，并在相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行中試及推廣。
3、結(jié)果3.1A型、B型流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)靈敏度根據(jù)流感毒株A，B TCID50法的滴定結(jié)果，分別取2.56個(gè)和5.0個(gè)TICD50的病毒RNA，分別十倍梯度稀釋?zhuān)畲笙♂尪确謩e為2.56×10-6，5.0×10-6。將相同稀釋度A、B病毒RNA混合加入同一個(gè)雙重反應(yīng)體系管中，熒光RT-PCR反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中可以看出A型曲線的熒光值較B型的要高，這可能是由于熒光基團(tuán)FAM與CY5本身的差異所造成的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應(yīng)了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的；相同稀釋度A、B病毒的CT值很接近，提示雖然A、B流感病毒的TCID50值不同，但其病毒拷貝數(shù)是很接近的，這反應(yīng)了A、B流感病毒的致病能力是有一定差異的；雙重反應(yīng)體系中A、B病毒10-6濃度組均成陰性，較單一熒光反應(yīng)減少了一個(gè)數(shù)量級(jí)，原因可能是反應(yīng)體系增加，使得病毒RNA的相對(duì)濃度下降的緣故。
3.2A型、B型流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別以A型、B型流感病毒的TCID50濃度為橫坐標(biāo)，以各自RT-PCT循環(huán)的CT值為縱坐標(biāo)作圖，可以得到雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)對(duì)A型、B型病毒進(jìn)行相對(duì)定量的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。其中A型標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.024，擴(kuò)增效率為114.1％，相關(guān)系數(shù)為0.997，幾項(xiàng)參數(shù)與A型單一熒光反應(yīng)均很接近，說(shuō)明此雙重反應(yīng)檢測(cè)體系對(duì)A型流感病毒的檢測(cè)無(wú)明顯影響；B型標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.149，擴(kuò)增效率為107.8％，相關(guān)系數(shù)為0.998，幾項(xiàng)參數(shù)與B型單一熒光反應(yīng)也都很接近，說(shuō)明此雙重反應(yīng)檢測(cè)體系對(duì)B型流感病毒的檢測(cè)也無(wú)明顯影響。
3.3本發(fā)明試劑盒的構(gòu)成見(jiàn)下表

核甘酸序列表<110>程小雯<120>同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法及試劑盒<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1CAGAGACTTG AAGATGTTTT TGC23<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2CTACGCRGCA GTCCTCGCTC20<210>3<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3FAM-CAAGACCAAT CCTGTCACCT CTGA-BHQ131
<210>4<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4AAATACGGTG GATTAAATAA AAGCAA26<210>5<211>21<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5CCAGCAATAG CTCCGAAGAA A21<210>6<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6CY5-CACCCATATT GGGCAATTTC TATGGC-BHQ23權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，過(guò)程包括合成引物和熒光探針，和使用所述的引物、探針組成熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA或提取RNA，加入前述的反應(yīng)體系中，經(jīng)混合后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)測(cè)定，其特征在于(1)針對(duì)A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應(yīng)探針，具備如下DNA序列A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探針5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探針5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；(2)建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(2-1)建立具有如下組分濃度的50μl反應(yīng)體系10倍反應(yīng)緩沖液5μl，鎂離子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制劑40U，反轉(zhuǎn)錄酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探針250nM，B型探針200nM，A、B型模板RNA各10μl；(2-2)確立如下的反應(yīng)條件先48℃30分鐘；再95℃10分鐘；最后95℃15秒，60℃1分鐘，循環(huán)45次，然后選擇熒光定量PCR儀上FAM和CY5雙色熒光通道進(jìn)行檢測(cè)；(2-3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線取流感A、B病毒培養(yǎng)液抽提RNA，然后將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)罡呦♂尪葹?0-6，各濃度梯度RNA同時(shí)進(jìn)行熒光反應(yīng)，計(jì)算并匯出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.采用權(quán)利要求1所述方法的試劑盒，其特征在于用于100次試驗(yàn)的該試劑盒的構(gòu)成為RT-PCR反應(yīng)緩沖液 1.6mlTaq酶(5U/μl) 50μlRT-PCR酶(200U/μl) 10μlRT-PCR酶稀釋液 10μl二乙基焦碳酸酯水 1ml陽(yáng)性對(duì)照 1ml陰性對(duì)照 1ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒是經(jīng)包裝并在-20℃或以下保存期不超過(guò)一年的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)A型和B型流感病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法及試劑盒，針對(duì)A型、B型流感病毒保守序列的引物及相應(yīng)探針不同DNA序列，分別建立和優(yōu)化包括引物、探針、酶、寡聚核苷酸和鎂離子的A型、B型定量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測(cè)并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，試劑盒包括RT－PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、RT－PCR酶、RT－PCR酶稀釋液、DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。解決了雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系等問(wèn)題，具有操作簡(jiǎn)單、可定量、污染少、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)A、B型流感病毒，檢出病毒的最小量達(dá)10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1865937SQ20051003483
公開(kāi)日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者程小雯 申請(qǐng)人:程小雯