一種蘋果莖溝病毒實時熒光定量pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒分子檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種蘋果莖溝病毒實時熒光定量 PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV)能侵染蘋果、梨、柑橘、杏、李、 櫻桃、獼猴桃、百合等園藝作物，可導(dǎo)致多種病毒病。ASGV侵染蘋果樹體后一般不表現(xiàn)癥狀， 但能引起慢性衰退病，嚴(yán)重時可使產(chǎn)量減少45% -73%，導(dǎo)致果實品質(zhì)下降，對蘋果生產(chǎn)造 成嚴(yán)重影響。
[0003] 目前檢測ASGV的方法以常規(guī)RT-PCR技術(shù)為主。雖然郭立新等（2006)設(shè)計了 Taqman-MGB探針，建立了檢測庫爾勒香梨中ASGV的實時熒光定量PCR方法，但應(yīng)用該方法 未能檢測到蘋果樣品中的ASGV，且該方法沒有制作標(biāo)準(zhǔn)品，無法對樣品中的病毒進(jìn)行絕對 定量檢測，另外Taqman-MGB探針的價格較普通Taqman探針更為昂貴，不利于大范圍推廣應(yīng) 用。
[0004] ASGV的常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)方案包括以下步驟：
[0005] 1、設(shè)計常規(guī)RT-PCR檢測引物；
[0006] 2、提取果樹供試樣品的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0007] 3、以cDNA為模板，利用特異擴(kuò)增引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；
[0008] 4、將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳；
[0009] 5、通過凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行觀察拍照，若觀察到特異擴(kuò)增條帶可證明供 試樣品中含有ASGV，反則沒有。
[0010] 然而，ASGV的常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)存在缺點：
[0011] (1)、操作步驟較為繁瑣，費時費力；
[0012] (2)、需要對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，只有將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳才能 得到檢測結(jié)果，但瓊脂糖凝膠制作過程中需要加入致癌物質(zhì)EB，易污染實驗室環(huán)境，還會對 實驗人員的健康構(gòu)成威脅，同時后處理過程中不同樣品間易發(fā)生交叉污染，造成檢測結(jié)果 的假陽性現(xiàn)象；
[0013] (3)、常規(guī)RT-PCR技術(shù)只能對病毒進(jìn)行定性檢測，無法定量檢測
[0014] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于提供一種蘋果莖溝病毒實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方 法具有可實現(xiàn)供試材料蘋果莖溝病毒的定量檢測、不存在假陽性以及環(huán)境污染、檢測時間 短以及靈敏度高的技術(shù)效果。
[0016] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0017] 本發(fā)明提供了一種蘋果莖溝病毒實時熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0018] I)、以染毒材料的cDNA為模板，以ASGV-cp-F和ASGV-cp-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 所獲擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽 性克隆增菌培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取和鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0019] 2)、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R為引物、以ASGV-Probe為探針 所進(jìn)行的實時熒光定量PCR的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020] 3)、以供試材料的CDNA為模板，按照與步驟2)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實時熒光定量 PCR，得到的Ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，實現(xiàn)供試材料蘋果莖溝病毒的定量檢測；
[0021] 其中，所述 ASGV-cp-F、ASGV-cp-R、ASGV-Probe-F、ASGV-Probe-R 和 ASGV-Probe 的 核苷酸序列分別如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO: 5所示。
[0022] 本發(fā)明提供的這種檢測方法，其采用染毒材料的cDNA為模板，通過特定的引物擴(kuò) 增出產(chǎn)物，該產(chǎn)物再通過載體連接以及轉(zhuǎn)化之后，獲得大量復(fù)制的片段，挑取陽性克隆增菌 培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取和鑒定（酶切鑒定）進(jìn)而獲得陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)該陽性重組 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分子量將其換算成拷貝數(shù)濃度，并梯度稀釋；然后以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)品為模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R為引物、以ASGV-Probe為探針?biāo)M(jìn)行的實 時熒光定量PCR的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（Ct值-拷貝數(shù)濃度）。上述反應(yīng)中，ASGV-Probe-F、 ASGV-Probe-R和ASGV-Probe為特定設(shè)置的特異性擴(kuò)增引物和探針，且在ASGV-Probe的5' 端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
[0023] 以供試材料的cDNA為模板按照與構(gòu)建上述標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件進(jìn)行實時熒光定 量PCR，通過供試材料反應(yīng)的Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接獲得供試材料中的蘋果莖溝病毒的 含量。
[0024] 該方法實現(xiàn)了供試材料中的蘋果莖溝病毒的定量測定，而且檢測結(jié)果可直接通過 電腦軟件讀出，不需要凝膠電泳以及成像檢測等操作，進(jìn)而避免了檢測結(jié)果假陽性的同時 也避免了環(huán)境污染以及EB對操作人員造成的身體危害。另外，該檢測方法整個檢測過程僅 需1小時左右，具有節(jié)約時間以及靈敏度高的優(yōu)點。
[0025] 可選的，在步驟1)中：所述染毒材料的cDNA的制備方法包括：
[0026] 提取感染有蘋果莖溝病毒材料的總RNA，并以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到染毒 材料的cDNA。
[0027] 通過提取感染有蘋果莖溝病毒材料的總RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得染毒材料的 cDNA，該方法操作簡便，易于實現(xiàn)。
[0028] 可選的，在步驟1)中，所述瓊脂糖凝膠電泳中所用的瓊脂糖凝膠的濃度為1-2%。
[0029] 可選的，在步驟1)中：所述載體為PEASY-T3，所述感受態(tài)細(xì)胞為E. coli DH5 α。
[0030] 擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收片段，且為了獲得大量復(fù)制的目標(biāo)片 段，該回收片段利用PEASY-T3連接后轉(zhuǎn)化到Ε. coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，通過挑取陽性克 隆進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取后測序和酶切鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性重 組質(zhì)粒作為陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0031] 可選的，在步驟2)中：
[0032] 所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的0D26Q/0D28Q比值在1. 8-2. 0之間。
[0033] OD26(l/OD28(l比值在I. 8-2. 0之間的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其純度高，因此制成的標(biāo) 準(zhǔn)曲線能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)Ct值與起始模板拷貝數(shù)濃度的關(guān)系。
[0034] 可選的，在步驟2)中：
[0035] 所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度范圍為：1. OX IO8拷貝/ UL?1.0X101 拷貝/ μ L，且所述梯度稀釋的倍數(shù)為10倍。
[0036] 10倍稀釋梯度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和其進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng) 的Ct值的散點坐標(biāo)均勻，更易獲得高相關(guān)系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；而且LOXlO 8拷貝/yL? I. 0X IO1拷貝/ μ L檢測范圍大，提高了供試材料病毒檢測的廣泛性。
[0037] 可選的，在步驟2)中：
[0038] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線以所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以所 述Ct值為縱坐標(biāo)。
[0039] 可選的，在步驟2)中，所述實時熒光定量PCR的過程中，反應(yīng)體系為：
[0040] TransStart Probe qPCR Super Mix 10 μ L，ASGV-Probe-F 和 ASGV-Probe-R 4_5pmol，ASGV-Probe 4_5pmol，模板 I. 0 μ L，雙蒸水補(bǔ)齊至 20 μ L0
[0041] 可選的，在步驟2)中，所述實時熒光定量PCR的過程中，擴(kuò)增程序為：
[0042] 94°C預(yù)變性 30-35s ;94°C變性 4-7s，55°C退火 12-15s，72°C延伸 15-20s，共 35-40 個循環(huán)。
[0043] 該擴(kuò)增程序下，其擴(kuò)增特異性好。
[0044] 可選的，所述實時熒光定量PCR采用Bio-Rad iQ?5實時熒光定量PCR儀進(jìn)行。
[0045] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0046] (1)、通過標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對供試材料中ASGV病毒的定量檢測，而常規(guī)PCR技術(shù)只能