專利名稱：中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病候選基因序列及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明明涉及山葡萄常規(guī)雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖及基因克隆的方法與技術，特別涉及山葡萄抗黑痘病候選基因序列及其應用的方法與技術。
背景技術：
葡萄黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)原產歐洲和北非，是危害歐洲葡萄的重要真菌病害之一。目前，對于黑痘病的防治，主要以化學防治為主，但是，化學防治不僅增加生產成本，造成環(huán)境污染，還可能引起葡萄病害生理小種的變異及病原菌的抗藥性，同時降低葡萄及其加工產品(葡萄酒、葡萄干等)的產量和品質。大量科學研究和生產實踐證明，利用植物自身抗病性，培育抗病、優(yōu)質葡萄新品種是最經濟有效的措施之一。歐洲葡萄抗病能力差，美洲葡萄種及其品種抗病性強，但果實的“狐”味及其顯性遺傳的特點，又限制了其進一步應用；圓葉葡萄與歐洲葡萄雜交效率低。中國是葡萄屬植物重要的起源地之一，我國的野生葡萄資源不僅抗病，而且和歐洲葡萄雜交親和性好，可以有效地將抗病基因與歐洲葡萄品質性狀相結合，引入中國野生葡萄抗病基因育種，不僅受到國內研究者，而且受到國外學者的高度重視，所以中國野生葡萄是迄今公認的抗病育種種質資源。賀普超、王躍進等通過對中國葡萄野生資源的抗病性及其遺傳研究認為，我國野生葡萄對黑痘病表現了高度的抗性，而且向后代遺傳抗黑痘病的能力很強，因而利用中國野生葡萄對黑痘病的抗性基因與歐洲葡萄品種優(yōu)良品質基因有效地結合，培育優(yōu)良抗病葡萄新品種和創(chuàng)造新型葡萄種質既是生產實踐中急需解決的實際問題也是葡萄育種家面臨的重要任務。
植物能對特定的病原微生物進行識別并產生抗性，這是由抗病基因決定的?；驅蚣僬f認為，抗病基因是病原微生物致病基因的受體，能與致病因子復合物通過一系列信號傳導起始抗病反應，如發(fā)生過敏性反應、細胞壁增厚、壞死斑的出現以及防衛(wèi)基因的表達等?？共』蚋鶕幋a的蛋白質結構上的異同，可以將除Hm1外的其他基因分為4大類，即含有核苷酸結合位點(NBS)和富含亮氨酸重復(LRR)的胞內受體蛋白基因；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR結構的跨膜受體蛋白基因以及同時含有胞外LRR和胞內STK結構的跨膜受體蛋白基因，這些不同植物來源的抗病基因在結構上的保守性暗示了利用同源序列法分離抗病基因的潛在可能性。而基于同源序列的基因分離方法目前已逐漸受到重視，其中小麥抗葉銹病基因Lr10的分離是利用同源序列法進行抗病基因分離的首次成功報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于，對中國葡萄屬野生種進行抗病性鑒定，獲得山葡萄(V.amurensis Rupr.)泰山-11、黑龍江實生2個抗病種質的基礎上，采用同源序列克隆法分離山葡萄抗黑痘病候選基因片段，進行序列同源性分析，獲得中國葡萄屬野生種山葡萄的泰山-11抗黑痘病候選3個基因序列和黑龍江實生的1個抗黑痘病候選基因序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供中國葡萄屬野生種山葡萄的泰山-11株系抗黑痘病候選3個基因序列和黑龍江實生株系的1個抗黑痘病候選基因序列在抗黑痘病標記輔助育種、抗黑痘病基因定位與作圖、克隆山葡萄抗黑痘病基因的應用。
為了實現上述目的，本發(fā)明首次采用抗病基因同源序列技術進行中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)候選基因克隆，獲得了抗黑痘病候選基因DNA片段4個，其大小介于468bp～513bp之間。以該核苷酸序列為基礎，可以進行抗黑痘病基因標記輔助育種，用作山葡萄育種中檢測抗黑痘病基因的探針；可以根據這些片段在中國葡萄屬野生種山葡萄與歐洲葡萄雜種后代中的分離情況，進行中國野生葡萄山葡萄抗黑痘病基因定位與作圖；可以根據這些片段設計特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中國葡萄野生種山葡萄抗黑痘病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎。


圖1是中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病特異DNA片段的獲得及在雜交后代中的擴增圖譜；其中M.DGL 2000，1.玫瑰香，2-14.黑龍江實生X玫瑰香雜交F代，15.黑龍江實生，16.泰山-11；圖2～圖5是山葡萄抗黑痘病候選4個基因序列；其中圖2是山葡萄(V.amurensis Rupr.)黑龍江實生的候選基因序列；圖3是山葡萄(V.amurensisRupr.)泰山-11(1)候選基因序列；圖4是山葡萄(V.amurensis Rupr.)泰山-11(2)候選基因序列；圖5是山葡萄(V.amurensis Rupr.)泰山-11(4)候選基因序列；圖6是特異DNA片段在山歐雜種北醇自交后代中的分離情況圖譜，其中M.DNA Marker DGL 2000，1.北醇，2--45.北醇自交后代；圖7是特異DNA片段在山葡萄黑龍江實生X紅地球種間雜交F1代中的分離情況圖譜；其中1-17.黑龍江實生X紅地球種間雜交F1代，M.DNA MarkerDGL 2000。
具體實施例方式
本發(fā)明獲得的中國葡萄屬野生種山葡萄2個株系黑龍江實生、泰山-11抗黑痘病候選基因序列具體操作步驟如下A.采用改進的CTAB法(西北植物學報，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中國葡萄屬野生種山葡萄泰山-11、黑龍江實生2個株系葉片基因組DNA，通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。
B.根據抗病基因N、L6及RPS2位于P-環(huán)(P-loop)上的GVGKTT，及位于基因弱疏水區(qū)上的GLPLAL保守結構域設計簡并PCR引物5‘GGDGTD GGN AAR ACW AC 3’與5‘CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3’(N＝A/C/G/T；R＝A/G；N＝A/T；Y＝C/T；D＝A/G/T)，引物由大連Takara公司合成。在25μl PCR反應體積中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP0.5μl，模板DNA 100ng，引物11.5μl，引物21.5μl，Taq DNA聚合酶1U(5U/μl)，用雙蒸水補被齊體積至25μl，加入25.0μl礦物油。PCR擴增程序為94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃ 2min共35個循環(huán)；72℃，10min。取反應產物6.0μl跑1.5％瓊脂糖凝膠電泳(5V·cm-1)約40min，獲得了一條長度約為500bp的DNA特異帶(圖1，泳道15-16)。
C.用DNA膠回收試劑盒將獲得的一條約500bp左右的DAN條帶回收，連接pGEM-T easy載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養(yǎng)，藍、白斑篩選鑒定挑選白色菌落培養(yǎng)。用UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒回收質粒，用EcoR I酶切鑒定有外源DNA片段插入的陽性克隆。將陽性克隆送大連寶生生物公司測序，測序結果表明，DNA特異片段的大小介于468bp～513bp之間，獲得山葡萄抗黑痘病候選基因序列4個(圖2-圖5)。
以下是發(fā)明人給出的實施例，但并不局限于這些實施例。
實施例1以保存于西北農林科技大學葡萄種質資源圃已進行抗黑痘病鑒定的中國野生葡萄山葡萄黑龍江實生(賀普超等，中國農業(yè)科學，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄玫瑰香種間雜交后代78株及抗病雜種北醇自交后代234株為試材，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，根據獲得的抗黑痘病候選基因序列設計特異引物，進行PCR擴增，據特異DNA片段在雜種材料中的表現情況(圖1，泳道2-14；圖6)，對照上述葡萄材料的抗黑痘病田間鑒定結果，獲得與山葡萄抗黑痘病基因緊密連鎖的DNA標記和抗黑痘病基因DNA片段。
實施例2用保存于西北農林科技大學葡萄種質資源圃的中國葡萄屬野生種山葡萄黑龍江實生、泰山-11、華縣-47等(賀普超等，中國農業(yè)科學，1991；WangY et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄優(yōu)良品種紅地球、無核白等雜交獲得抗黑痘病雜種植株。采用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因組DNA，根據實施例1獲得的與山葡萄抗黑痘病基因緊密連鎖的DNA標記設計引物，對上述葡萄材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產物出現DNA特異片段的雜種材料，為抗黑痘病雜種植株(圖7)，這些可以用做進一步抗病品種選育的材料和種質。
實施例3采用田間自然鑒定、田間接種鑒定對實施例1與實施例2的葡萄雜種材料進行抗黑痘病鑒定，獲得抗病雜種與感病雜種。據實施例2獲得的與抗黑病基因緊密連鎖的DNA標記設計的引物，對上述葡萄雜種材料進行PCR擴增，據DNA片段在雜種后代中的擴增與分離情況(圖6，圖7)，結合田間鑒定結果，利用MAPMAKER軟件進行山葡萄抗黑痘病基因定位與作圖，獲得抗黑痘病基因連鎖圖譜。
實施例4將實施例1獲得的中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病基因DNA片段的序列，用DNASTAR軟件設計特異5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2，用改進的SDS/酚法(果樹學報，張今今等，2003，20(3)178-181)提取中國葡萄屬野生種山葡萄黑龍江實生、泰山-11葉片總RNA，逆轉錄分別合成5’RACE與3’RACE cDNA第一鏈。用5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2分別進行5’RACE與3’RACE PCR擴增。將5’RACE PCR產物與3’RACE PCR產物分別進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳獲得5’RACE與3’RACE全長序列。分別回收5’RACE與3’RACE全長序列并連接T載體?？寺　y序后，進行序列同源性分析，據5’RACE與3’RACE序列重疊區(qū)域合并成完整的cDNA全長序列，從而克隆了中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病基因，獲得抗黑痘病基因序列。
基因序列中國葡萄屬野生種山葡萄黑龍江實生株系抗黑痘病候選基因序列1GGGGTTGGCA AGACAACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGGGAATATA ACAAAAGCAA121 TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181 AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241 ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301 GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361 ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421 CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481 TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG中國葡萄屬野生種山葡萄泰山-11株系抗黑痘病候選3個基因序列山葡萄泰山-11基因序列(1)1GGGGTTGGTA AGACAACACT AGCAAAGTTG ATCTATCACA ATGATGCTGT TGTCAATCAT61 TTCCATTATC GTGCTTTTGG TTTTGAACTT CTCAAAGATG TCAGGAAACA GTTCGGAGAG121 CCAGGCTCTT CGATGTCACC AGAAAAAAGG GCGCAACCAT TCAAAGCTTT CTTGGCTGAT181 AAGAGGTGTC TCATAGTTCT GGATGATGCC CACGATGAAA GTTTCAAGAA TGAAATGATA241 ACAGCACTCC GGGACACATC AAATGGGTGT AGAATGATTT TGACATCTTG GGTTACAGAA301 CTACCATCAA ACCTCCAAAT AGGAAGTCTT TACTATGGAC TAAGACTACG AAGAGATGAT361 GAGAGTTGGG CATTGTTTAC CCATGCAATG AAGATAAGCA TACCCCAAGA ACTGCTAAAG421 TTTAGAAGGG AAATCGTGAG AAGATGTGGA GGATTGCCAC TAGCGTTG山葡萄泰山-11基因序列(2)1GGGGTGGGTA AAACAACACT CGCACGACTG CTTTACAACG ATGACATGGC CAAAAACTTT61 AACCTAAAAG CATGGGTTTG TGTGTCTAAT GTGTTTGATG TGGAAAATAT AACAAAATCA121 ATTTTCAATT CAATGGTAAG TTCTGATGTA GGTGGCTCGT TCCAATAGGT TCAAAAAAAA181 TTGACAGAGG CATTGATAGG GAAAAAGTTT TTACTCATTC TAGACGATGT ATGGAACCAA241 GATTATGGTA GTTGGGATAG CTTGCGCCCT CCTTTTATTG GAGGTACAAA AGGAAGCAAA301 GTCATAGTCA CAACATGCAA TAAAAACGTT GCATTGATGA TGGGAGCTAA GGAGAAGGTT
361 TATGAACTAA AAAATTTATC AAAAGATGCT TGTTGGTCGA TGTTTAAGAA GCATGCGTTT421 GAACATAGAA ATATTGATGA TCATCCAAAC CTAGTGTCTA TTGGTAGGAA ATTTGTTAGC481 AAGTGTGGTG GATTGCCACT AGCGTTG山葡萄泰山-11基因序列(4)1GGGGTTGGTA AGACTACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAGA GTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AAGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTTTTTTAC TCGTTCTAGA CGATGTGTGG241 AACGAAAATT GTGGTCATTG GGATCTTTTG CGGGCTCCTT TTAGTGTAGG GTCCAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTCGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGCTTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG
權利要求
1.中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病候選基因序列，其特征在于，包括中國葡萄屬野生種山葡萄的泰山-11株系抗黑痘病候選3個基因序列和黑龍江實生株系的1個抗黑痘病候選基因序列；所述的中國葡萄屬野生種山葡萄泰山-11株系抗黑痘病3個候選基因序列是山葡萄泰山-11基因序列(1)1 GGGGTTGGTA AGACAACACT AGCAAAGTTG ATCTATCACA ATGATGCTGT TGTCAATCAT61 TTCCATTATC GTGCTTTTGG TTTTGAACTT CTCAAAGATG TCAGGAAACA GTTCGGAGAG121CCAGGCTCTT CGATGTCACC AGAAAAAAGG GCGCAACCAT TCAAAGCTTT CTTGGCTGAT181AAGAGGTGTC TCATAGTTCT GGATGATGCC CACGATGAAA GTTTCAAGAA TGAAATGATA241ACAGCACTCC GGGACACATC AAATGGGTGT AGAATGATTT TGACATCTTG GGTTACAGAA301CTACCATCAA ACCTCCAAAT AGGAAGTCTT TACTATGGAC TAAGACTACG AAGAGATGAT361GAGAGTTGGG CATTGTTTAC CCATGCAATG AAGATAAGCA TACCCCAAGA ACTGCTAAAG421TTTAGAAGGG AAATCGTGAG AAGATGTGGA GGATTGCCAC TAGCGTTG山葡萄泰山-11基因序列(2)1 GGGGTGGGTA AAACAACACT CGCACGACTG CTTTACAACG ATGACATGGC CAAAAACTTT61 AACCTAAAAG CATGGGTTTG TGTGTCTAAT GTGTTTGATG TGGAAAATAT AACAAAATCA121ATTTTCAATT CAATGGTAAG TTCTGATGTA GGTGGCTCGT TCCAATAGGT TCAAAAAAAA181TTGACAGAGG CATTGATAGG GAAAAAGTTT TTACTCATTC TAGACGATGT ATGGAACCAA241GATTATGGTA GTTGGGATAG CTTGCGCCCT CCTTTTATTG GAGGTACAAA AGGAAGCAAA301GTCATAGTCA CAACATGCAA TAAAAACGTT GCATTGATGA TGGGAGCTAA GGAGAAGGTT361TATGAACTAA AAAATTTATC AAAAGATGCT TGTTGGTCGA TGTTTAAGAA GCATGCGTTT421GAACATAGAA ATATTGATGA TCATCCAAAC CTAGTGTCTA TTGGTAGGAA ATTTGTTAGC481AAGTGTGGTG GATTGCCACT AGCGTTG山葡萄泰山-11基因序列(4)1 GGGGTTGGTA AGACTACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAGA GTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181AAGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTTTTTTAC TCGTTCTAGA CGATGTGTGG241AACGAAAATT GTGGTCATTG GGATCTTTTG CGGGCTCCTT TTAGTGTAGG GTCCAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTCGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGCTTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG所述的中國葡萄屬野生種山葡萄黑龍江實生株系抗黑痘病候選基因序列是1 GGGGTTGGCA AGACAACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGGGAATATA ACAAAAGCAA121TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG。
2.中國葡萄屬野生種山葡萄黑痘病候選基因序列，包括中國葡萄屬野生種山葡萄的泰山-11株系抗黑痘病候選3個基因序列和黑龍江實生株系的1個抗黑痘病候選基因序列在抗黑痘病標記輔助育種、抗黑痘病基因定位與作圖、克隆山葡萄抗黑痘病基因的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了中國葡萄屬野生種山葡萄抗黑痘病候選基因序列，包括中國葡萄屬野生種山葡萄的泰山－11抗黑痘病候選3個基因序列和黑龍江實生的1個抗黑痘病候選基因序列。本發(fā)明采用抗病基因同源序列法(Resistantgene analogus，RGAs)獲得中國葡萄屬野生種山葡萄(V.amurensis Rupr.)泰山－11、黑龍江實生2個株系抗黑痘病候選基因DNA片段4個，對這些片段克隆測序后，其大小介于468bp～513bp之間。以這些序列為依據，進行抗黑痘病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗黑痘病基因的探針；根據這些片段在山葡萄與歐洲葡萄雜種后代中的分離情況，進行抗黑痘病基因定位與作圖；或根據這些片段設計特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術(Rapid amplification of cDNA ends，RACE) (Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆山葡萄抗黑痘病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎。
文檔編號C12N15/82GK1683533SQ20051004175
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權日2005年3月7日
發(fā)明者王躍進, 王西平 申請人:西北農林科技大學