專利名稱：：一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌分離的方法，具體說是嗜線蟲致病桿菌的分離方法。
背景技術(shù)：
：隨著全社會(huì)環(huán)保意識(shí)的日益增強(qiáng)，化學(xué)農(nóng)藥大量使用帶來的環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞等副作用受到各國(guó)的高度重視，控制全球化合物的生物積聚的呼吁越來越強(qiáng)烈，化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)、使用面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，對(duì)害物高效、對(duì)非靶標(biāo)生物及環(huán)境安全的“生物合理農(nóng)藥”(Biorationalpesticides)或“環(huán)境相容性農(nóng)藥”(Environmentacceptablepesticides)的研究開發(fā)工作正方興未艾的開展起來，成為一個(gè)最誘人的領(lǐng)域。創(chuàng)制新型“生物合理農(nóng)藥”的一條重要途徑是研究和開發(fā)生物源農(nóng)藥，這是因?yàn)樯镌崔r(nóng)藥在生物體內(nèi)、環(huán)境中容易降解，對(duì)人畜、天敵等非靶標(biāo)生物比較安全，對(duì)環(huán)境友好，它能較好地符合有害生物綜合治(IPM)原則中對(duì)農(nóng)藥的要求。因此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物源農(nóng)藥，特別是微生物源農(nóng)藥的研究開發(fā)與利用日益受到重視。昆蟲病原線蟲(Entomopathogenicnematode)是昆蟲的?；约纳鞌?，一般專指斯氏線蟲科(Steinernematidae)的斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲科(Heterohabditidae)的異小桿屬(Heterohabditis)種類，是一類重要的生物防治因子。二屬分別與嗜線蟲致病桿菌屬(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)共生，共同作用殺死寄主昆蟲。這兩類線蟲由于殺蟲能力強(qiáng)，是最具應(yīng)用潛力的昆蟲病原線蟲。它們之間的共生關(guān)系可以概括為共生菌存在于線蟲的腸道內(nèi)，線蟲攜帶共生菌進(jìn)入寄主昆蟲體內(nèi)，將共生菌釋放到昆蟲的血腔中；共生菌在昆蟲血腔內(nèi)繁殖，產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)，使昆蟲患敗血癥，一般在48小時(shí)內(nèi)死亡；共生菌分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提供線蟲繁殖發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)共生菌產(chǎn)生的抗生素能抑制其它雜菌的污染，為線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖提供理想的環(huán)境。作為一種生物殺蟲劑，昆蟲病原線蟲寄主范圍廣泛，具主動(dòng)搜索能力，對(duì)土棲性、鉆蛀性與隱蔽性害蟲有特殊防效，對(duì)人畜安全，不污染環(huán)境，亦不會(huì)產(chǎn)生抗性，并可工廠化生產(chǎn)，因此已廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林及牧草等害蟲，已引起國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者及商業(yè)部門的高度重視，其應(yīng)用規(guī)模逐漸擴(kuò)大，全球約15家公司進(jìn)行昆蟲病原線蟲的商品化生產(chǎn)。然而成功地利用線蟲防治農(nóng)林及牧草等害蟲僅是極少數(shù)昆蟲，應(yīng)用面積有限，限制其發(fā)展的主要因素是①較高的生產(chǎn)成本；②難以將害蟲控制到經(jīng)濟(jì)閾值水平之下；③施用后持效性差；④難以如化學(xué)農(nóng)藥一樣常溫下保存和運(yùn)輸，不具備內(nèi)吸作用，不能葉面噴施；⑤受環(huán)境因子特別是溫度和太陽輻射的影響較大，因此它的應(yīng)用范圍受到了限制。這使得在昆蟲病原線蟲致病性中起關(guān)健作用的共生細(xì)菌的研究日益受到重視；另外，由于Bt的大量使用和轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白(ICPs)基因cry抗蟲植物的大面積種植，害蟲對(duì)Bt及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的抗性不斷增大，尋找新的殺蟲蛋白和殺蟲基因成為當(dāng)務(wù)之急。昆蟲病原線蟲共生菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類細(xì)菌，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，兼性厭氧、化能異養(yǎng)，革蘭氏染色陰性。包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)，分別與斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)線蟲共生。在自然界，此類細(xì)菌存在于三齡侵染期線蟲的腸道內(nèi)，隨著線蟲對(duì)昆蟲的侵染，共生菌被攜帶到昆蟲體內(nèi)并釋放到寄主血腔中，共生菌大量繁殖，產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)，與線蟲共同作用，殺死寄主昆蟲；另外，共生菌也能分解昆蟲組織，為線蟲和共生菌的生長(zhǎng)和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)。昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌Xenorhabdus和Photorhabdus能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物。到目前為止，已從共生菌中分離鑒定出30多種生物活性成分，這些代謝產(chǎn)物不僅具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的生物活性，如抑菌、殺蟲、殺線蟲、抗?jié)?、抗腫瘤和抗病毒活性。特別是從P.luminescensW14中分離出一種外毒素蛋白復(fù)合體，對(duì)鱗翅目，鞘翅目、蜚蠊目和膜翅目等幾個(gè)目的多種害蟲均表現(xiàn)出很高的口服殺蟲活性，毒性與Btδ-內(nèi)毒素相當(dāng)；殺蟲基因轉(zhuǎn)入煙草、玉米和水稻后，對(duì)煙草天蛾幼蟲和玉米根葉甲幼蟲具有較強(qiáng)的致死和抑制生長(zhǎng)作用；殺蟲蛋白基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)也得到了有效表達(dá)。為生物農(nóng)藥的開發(fā)和抗蟲基因工程提供了新的微生物殺蟲資源和殺蟲基因。昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有較大開發(fā)潛力和廣泛應(yīng)用前景的生物資源。近年來，昆蟲病原線蟲共生菌的生理代謝特征成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。從昆蟲病原線蟲與其共生菌的關(guān)系來看，線蟲的殺蟲活性主要是共生菌起作用；而共生菌是以線蟲為介體，線蟲侵染寄主昆蟲后，將共生菌釋放到血淋巴中，共生菌在血淋巴中大量繁殖，產(chǎn)生毒素和線蟲共同作用殺死昆蟲。毒素的作用部位是血淋巴，因而共生菌均有較高的注射活性，經(jīng)口毒性可能是一種特殊情況。大多數(shù)菌株無經(jīng)口毒性，作為殺蟲劑開發(fā)利用的價(jià)值較低。要挖掘共生菌殺蟲活性的應(yīng)用潛力，還需進(jìn)行廣泛的高毒力菌株的篩選。共生菌的分離方法主要是從線蟲侵染致死的大蠟螟中分離，即把感染了昆蟲病原線蟲死后24h的昆蟲尸體經(jīng)體表消毒后用滅菌剪刀剪開背線(勿觸破腸道)將昆蟲血淋巴涂布于NBTA培養(yǎng)基上，以分離共生菌，或者蟲體用酒精浸后，在酒精燈上點(diǎn)燃，然后在進(jìn)一步分離。利用這種方法分離時(shí)易污染，雜菌較多。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)從線蟲侵染致死的大蠟螟中分離共生菌的方法易污染，雜菌較多的問題，提供一種采用從線蟲中直接分離共生菌的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，將昆蟲病原線蟲Steinernemasp(該線蟲從陜西楊陵篩選獲得，經(jīng)鑒定為斯氏線蟲Steinernemasp)在無菌環(huán)境下，用消毒劑進(jìn)行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA培養(yǎng)基平板上，在一定條件下培養(yǎng)，釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，周圍培養(yǎng)基中的染料被吸收變?yōu)辄S色，經(jīng)反復(fù)純化，得到共生菌，經(jīng)鑒定并命名為XenorhabdusnematophilusYL001。其中所述的NBTA培養(yǎng)基為牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、營(yíng)養(yǎng)瓊脂20g、TTC0.04g、BTB0.025g、水1000ml、PH7.2～7.4。本方法簡(jiǎn)單方便，雜菌較少，分離得到的是初生型共生菌。具體實(shí)施例方式為了清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的直接從昆蟲病原線蟲中分離共生菌的方法，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例11、首先用0.1％甲醛溶液將侵染期昆蟲病原線蟲(IJs)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用無菌水沖洗；2、隨后用0.1％乙汞硫代水楊酸鈉將線蟲浸泡30min，消毒完后用無菌水沖洗3次；3、最后將消毒過的侵染期線蟲加到NBTA鑒別培養(yǎng)基平板上；4、將NBTA鑒別培養(yǎng)基平板在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3-5d，3-5d內(nèi)線蟲釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，經(jīng)反復(fù)純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。5.共生菌的鑒定通過形態(tài)及生理生化特征鑒定，確定共生菌為XenorhabdusnematophilusYL001。表1Steinernemasp共生菌的形態(tài)特征表2Steinernemasp共生菌的主要生化特征表3Steinernemasp共生菌與Xenorhabdus屬不同種特征的比較注+＝90-100％；[+]＝76-89％；d＝26-75％；[-]＝11-25％；-＝0-10％；w＝weakreaction；實(shí)施例21、用10％的次氯酸鈉或1％的升汞將線蟲浸泡30min，然后用無菌水沖洗3次；2、將消毒過的線蟲直接散布在NBTA鑒別培養(yǎng)基平板上；4.將NBTA平板在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3-5d，3-5d內(nèi)線蟲釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，經(jīng)反復(fù)純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。經(jīng)進(jìn)一步鑒定，確定Steinernemasp共生菌為XenorhabdusnematophilusYL001。權(quán)利要求1.一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法，其特征在于，將昆蟲病原線蟲在無菌環(huán)境下，用消毒劑進(jìn)行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA鑒別培養(yǎng)基平板上，在一定條件下培養(yǎng)，線蟲釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，周圍培養(yǎng)基中的染料被吸收變?yōu)辄S色，經(jīng)反復(fù)純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。2.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于消毒劑為甲醛、乙汞硫代水楊酸鈉、次氯酸鈉、氯化汞其中之一。3.如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述甲醛濃度為0.1％，乙汞硫代水楊酸鈉濃度為0.1％，次氯酸鈉濃度為10％，氯化汞濃度為1％。4.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于NBTA培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)條件為，28℃、黑暗條件下培養(yǎng)3-5d。5.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，該方法包括下列步驟A、首先用0.1％甲醛溶液將浸染期的昆蟲病原線蟲(IJs)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用無菌水沖洗；B、隨后用0.1％乙汞硫代水楊酸鈉將線蟲浸泡30min，消毒完后用無菌水沖洗3次，最后將消毒過的線蟲加到NBTA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離；C、用10％的次氯酸鈉或1％的升汞將侵染期昆蟲病原線蟲浸泡30min，然后用無菌水沖洗3次，將消毒過的線蟲直接散布在NBTA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，NBTA培養(yǎng)基平板在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)3-5d，線蟲釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，周圍培養(yǎng)基中的染料被吸收變?yōu)辄S色，即可得到昆蟲病原線蟲共生菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法，將昆蟲病原線蟲在無菌環(huán)境下，用消毒劑進(jìn)行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA培養(yǎng)基平板上，在一定條件下培養(yǎng)，釋放出共生菌，形成藍(lán)綠色菌落，菌落周圍培養(yǎng)基中的染料被吸收變?yōu)辄S色，經(jīng)反復(fù)純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。本方法簡(jiǎn)單方便，雜菌較少，分離得到的是初生型共生菌。文檔編號(hào)C12N1/10GK1724650SQ20051004282公開日2006年1月25日申請(qǐng)日期2005年6月16日優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日發(fā)明者王永宏,許賢,馮俊濤,周一萬,李廣澤,陳安良,張興申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心