專利名稱：一種抗昆蟲血細(xì)胞免疫的線蟲表皮蛋白及基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有抗昆蟲血細(xì)胞免疫功能的來(lái)自格式線蟲 (&e/"miema g/flsn')的表皮蛋白EN01p。本發(fā)明還涉及該蛋白的氨基酸序列及編碼此蛋白 的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
昆蟲病原線蟲是一類自然存在于土壤中的昆蟲天敵，以感染期線蟲通過(guò)昆蟲的氣孔、口 腔和肛門等自然孔口或通過(guò)昆蟲表皮節(jié)間膜進(jìn)入血腔，將腸道內(nèi)攜帶的共生細(xì)菌釋放到昆蟲 血腔，共同抵抗寄主的免疫系統(tǒng)，快速殺死寄主。線蟲-共生菌雖然具有抵抗昆蟲免疫系統(tǒng)的 能力，但寄主血細(xì)胞的快速包被和免疫反應(yīng)仍然能夠殺死線蟲和共生菌，特別是在線蟲釋放 其共生菌之前。因此線蟲能否抑制昆蟲的血細(xì)胞免疫并在昆蟲體腔中存活，是決定線蟲成功 致死昆蟲的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)線蟲抑制昆蟲血細(xì)胞免疫機(jī)制的研究很少，只有Wangand Gaugler從昆蟲病原線蟲S. g/oyw/表皮分離出一種蛋白，該蛋白能顯著提高線蟲抗昆蟲血細(xì) 胞的免疫力，但該研究小組沒(méi)有純化出該蛋白并克隆其基因。因此，對(duì)昆蟲病原線蟲表皮蛋 白純化及基因克隆的研究有助于搞清線蟲抗昆蟲血細(xì)胞免疫的機(jī)制，同時(shí)還有助于拓展該蛋 白在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，為人類充分利用這一蛋白開展有益的嘗試
發(fā)明內(nèi)容
:
本發(fā)明的目的是提供一種抗昆蟲血細(xì)胞免疫的線蟲表皮蛋白，從而拓展該蛋白在農(nóng)業(yè)上 的應(yīng)用。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案是通過(guò)提取純化格式線蟲(S^'恥r加附flg/om')的表皮蛋白，測(cè)
定其肽段序列，再根據(jù)肽段序列克隆表皮蛋白的編碼基因。 本發(fā)明的線蟲表皮蛋白具有抗昆蟲血細(xì)胞免疫的作用。
具體技術(shù)方案如下
(1) 人工培育格式線蟲，收集線蟲；先后用0.5%次氯酸鈉和35%乙醇處理線蟲，提取線蟲 表皮蛋白的粗品；用8%制備型Native-PAGE和Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad)純化表皮蛋 白。
(2) 通過(guò)大蠟螟血細(xì)胞ROS水平檢測(cè)等方法確定表皮蛋白的生物活性。
(3) 采用液譜—電噴霧—質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的肽段序列。
(4) 根據(jù)肽段序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增獲得DNA片段，通過(guò)5'和3' -RACE獲得 表皮蛋白全長(zhǎng)基因。
具體實(shí)施方式
:
下面通過(guò)具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明特點(diǎn)。
實(shí)施例1線蟲的培養(yǎng)與收集
采用人工培養(yǎng)基(主要含豆粉、面粉、雞蛋、動(dòng)物肝臟及高溫淀粉酶等)培養(yǎng)格氏線蟲， 培養(yǎng)時(shí)以體積約為1CMS海綿做載體，盛入500ml錐形瓶，于30。C溫室中培養(yǎng)30天。待線 蟲培養(yǎng)好后收集線蟲，取出培養(yǎng)瓶中的海綿，在通氣的自來(lái)水中浸洗海綿lh，粗紗布過(guò)濾掉 海綿，然后反復(fù)用自來(lái)水清洗濾液，徹底除去培養(yǎng)基殘留物。用終濃度0.5%次氯酸鈉處理收 集的線蟲15min，之后用自來(lái)水徹底洗去次氯酸鈉，然后換成蒸餾水通氣處理48h，最后用細(xì) 紗布過(guò)濾除凈蒸餾水，收集線蟲。
實(shí)施例2線蟲表皮蛋白的提取與純化
將線蟲在預(yù)冷的35%乙醇中浸泡30min，細(xì)紗布過(guò)濾掉線蟲，收集濾液，將濾液冷凍于 -80°C冰箱過(guò)夜，然后冷凍干燥處理至干粉狀態(tài)。取干粉溶于MilliQ水至總蛋白終濃度 2mg/ml，用8%制備型Native-PAGE分離(80V 20min,180V lh30min)，隨后在Mini Whole Gel Eluter(Bio-Rad)上進(jìn)行電洗脫(100mA 25min)，分別收集洗脫組分，再將各組分用 12。/。SDS-PAGE分析純度，并用BCA assay kit(Pierce)測(cè)定各組分濃度，將各組分的蛋白濃 度用MilliQ水調(diào)整為20|jg/ml。
實(shí)施例3大蠟螟血細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測(cè)表皮蛋白活性
用75%的酒精對(duì)大蠟螟五齡幼蟲進(jìn)行表面消毒，剪斷幼蟲前腿，用移液器從斷口處吸取 lOpl血淋巴(約含100000個(gè)血細(xì)胞)，迅速加入到含0.1%的DCFH-DA的格氏昆蟲培養(yǎng)基 (Grace insect culture medium,Sigma G-9771)中，室溫孵育30min。用格氏昆蟲培養(yǎng)基洗滌 孵育后得血細(xì)胞3次，以除去細(xì)胞外的DCFH-DA，隨后在含有10|Jg/mlLPS和20pg/ml表皮 蛋白組分的格氏昆蟲培養(yǎng)基中37°C孵育30min，并采用含有10|Jg/mlLPS和20|Jg/ml無(wú)內(nèi)毒 素BSA (Merck—Calbiochem)的格氏昆蟲培養(yǎng)基作為對(duì)照。用移液槍輕柔洗打吹散細(xì)胞團(tuán)， 取樣觀察。細(xì)胞熒光的定性觀察在01ympusBX51熒光顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行，定量檢測(cè) 則在FACS Vantage流式細(xì)胞儀(BeetonDickinson)中進(jìn)行。熒光圖像和數(shù)據(jù)采集使用的激發(fā) 波長(zhǎng)是488nm，發(fā)射波長(zhǎng)是535nm。結(jié)果表明表皮蛋白的表觀分子量為43 kD的SCP2組分 其活性氧水平比BSA的明顯低，說(shuō)明該組分具有生物活性。
實(shí)施例4大蠟螟體內(nèi)吞噬分析檢測(cè)表皮蛋白活性
首先將表皮蛋白與熒光微球交聯(lián)，將純化的表皮蛋白(ENOlp)和無(wú)內(nèi)毒素BSA分別溶 于MES緩沖液(50mM， pH6.0)中，調(diào)整終濃度為0.1mg/ml。取2|j1羧基修飾的微球珠(3.6 XlOVpl, F—8821， Invi加gen)加入20|jl的蛋白溶液中，混勻后室溫孵育15min。隨后加入 20|jl l-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)-碳化二亞胺(EDAC)，室溫孵育2h。向混合物中加入甘氨 酸至終濃度100mM，室溫孵育30min以終止反應(yīng)。將微球在4000g離心30min，盡除上清， 然后用PBS清洗3次(每次5min)，最后重懸于PBS中調(diào)濃度為2.0乂105個(gè)/卩1。進(jìn)行體內(nèi) 吞噬分析時(shí)，向5齡的大蠟螟幼蟲體內(nèi)注入5Ml交聯(lián)了蛋白的微球珠(每只幼蟲含1乂106個(gè) 微球珠)。注射12h后取幼蟲血淋巴5iJl與5(Hjl的格氏昆蟲培養(yǎng)基混合，滴加到凹面載玻片 的凹陷處，在37°C保濕靜置5min。用50(Hj1含2pg/ml DAPI (6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)的甲醇 清洗載玻片一次，再加入100|jl的2|Jg/mlDAPI,37°C孵育15min，棄去染色液，甲醇清洗一 次，滴加100plPBS保存。熒光觀察在01ympusBX51熒光顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行，激發(fā) 波長(zhǎng)350nm。結(jié)果表明表皮蛋白的表觀分子量為43 kD的SCP2組分被大蠟螟吞噬吸附明顯 少于BSA，說(shuō)明該組分具有抗吞噬作用。
實(shí)施例5采用液譜一電噴霧一質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的肽段序列
純化的SCP2組分經(jīng)SDS—PAGE檢測(cè)，切取單帶經(jīng)胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、V8酶分別酶 解后，采用液譜一電噴霧一質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的5段肽段序列，其序列分 另U為GVVDSWQPHAVR ，SLGVFHEQSR ，YGLDATAVGDEGGFAPNIQDNK ， AAVPSGASTGIHEALELR和GLTSGVATLFK。
實(shí)施例6表皮蛋白基因克隆
根據(jù)生物信息學(xué)方法，尋找與上面5個(gè)肽段最為相近的物種及其蛋白，分別為秀麗隱桿 線蟲、單一異尖線蟲、旋毛線蟲、刺尾蝎水解酶、擬南芥烯醇化酶(enolase)、番茄烯醇化酶、 油菜烯醇化酶等，找到以上物種相應(yīng)蛋白的保守區(qū)域，然后再根據(jù)這些保守序列設(shè)計(jì)引物5'-GAYTCMCGYGGMAAYCCAACYGTTGA-3，和5，- GTSACKGAWCCRATTTGRTT-3'， PCR (94。C3min; 94°C 60s， 50°C 30s， 72°C 70s, 35cycles; 72°C 10min; 4°C °0獲得1071bp 的陽(yáng)性片段;然后再使用TaKaRa公司的試劑盒進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)以獲得包括完整ORF的DNA 片段，3，RACE 設(shè)計(jì)的引物為 5'-TACCGGACTGGTGTCCATCGGCAT-3'和 5，-AGTCGTTCATCAAGGACTATCCCGT-3， ； 5'RACE設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分另U為 S1:5 ，-CGCCAAGAACTTCGATGTGACCGAC-3' 禾口 Al:5，陽(yáng)GACTCCCTTTCCGTGGTGGACAGCC-3， ， 及
S2:5，-ACTTGGCCGATCTCGCCGGAGTGAG誦3， 和 A2:5，-CAGCAGCGCGGAACACACCTAAATC-3，。將上述實(shí)驗(yàn)得到的核苷酸片段進(jìn)行拼接后 獲得一個(gè)大小為1032bp的完整閱讀框的核苷酸序列，將其命名為ewo7基因(SEQ IDNOl)， 其推測(cè)的氨基酸序列(SEQIDNOl)中包含實(shí)施例5中獲得的5個(gè)肽段，確認(rèn)獲得的ewo/ 基因正確。通過(guò)GenBank比對(duì)，獲知此種蛋白與多個(gè)物種的烯醇化酶具有較高的同源性，其 中和簡(jiǎn)單異尖線蟲U"&flyfew'm/ /ex)烯醇化酶的相似性為83%。
提取格式線蟲的RNA，根據(jù)eno/基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR,同樣獲得線蟲的ewo/基 因，進(jìn)一步證明該基因編碼格式線蟲的表皮蛋白ENOlp。
序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
〈120〉 一種抗昆蟲血細(xì)胞免疫的線蟲表皮蛋白及基因序列
<130〉 05-01
〈160〉 1
<170> Patentln version 3. 1 〈210〉 1 〈211〉 1032 〈212〉 DNA
〈213〉 格式線蟲(Steinememaglasri) 〈400〉 1
ATGATCGAGC TTGACGGMC CGAGMCMG TCGAGCCTCG GAGCCMCGC CATCCTCGGC 60
GTGTCGCTCG CCGTCGCCAA GGCCGGTGCC GTGCACMGG GAGTGCCCCT CTACAAGCAC 120
TTGGCCGATC TCGCCGGAGT GAGCMGGTT GTCCTCCCCG TTCCTGCCTT CAACGTCATC 180
MCGGAGGCT CGCACGCCGG AMCMGCTC GCCATGCAGG AGTTCATGAT CCTCCCCGTC 240
GGAGCCAAGA GCTTCMGGA GGCCATGCGC ATGGGATCCG AGATCTACCA CCACCTCMG 300
GCCGAGATCA AGAAGCGCTA CGGACTCGAC GCCACCGCCG TCGGAGATGA GGGAGGATTC 360
GCCCCCAACA TCCAGGACM CMGGAGGGT CTTGACCTCC TCMCACCGC TATCMGCTT 420
GCCGGATATA CCGGACTGGT GTCCATCGGC ATGGACGTCG CCGCCTCCGA GTTCTACMG 480
GAGMCGAGA AGMGTACGA CTTGGACTTC MGMCCCCA ACTCCGACCC CAGCAAGTGG 540
ATCMCGGAG ACGAGCTCGC CGCGCTCTAC CAGTCGTTCA TCAAGGACTA TCCCGTCGTC 600 TCCATCGAGG ACGCCTTCGA CCAGGACGAC TGGGCGMCT
ACCTCCATCC AGCTCGTCGG AGATGATCTC ACCGTCACCA
GCCGTCGACC AGMGGCGTG CMCTGCCTT CTCCTCAAGG
ACCGAGTCCA TCGAGGCCGC CMGCTGTCC CGCGCCAACG
CACCGTTCTG GAGAMCCGA AGACTGCTTC ATCGCTGATC
GGACAGATCA AGACCGGAGC CCCTTGCCGA TCTGAGCGTC
CTTCGCATCG AGGAGGAGCT CGGAGCCGAT GCCGTGTACG CCCCAGATCT M
說(shuō)明書第5/6頁(yè)
GGAGCAAGCT GATGGGCAAC 660 ACCCCAAGCG CATCCAGATG 720 TCMCCAGAT CGGATCCATC 780 GATGGGGCGT CATGGTTTCC 840 TTGTTGTTGG CCTCGCTACT 900 TCGCCAAGTA CAACCAGCTT 960
CCGGAGAGAA CTTCCGCMC 1020
1032
Met lie Glu Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Ser Leu Gly Ala Asn
15 10 15
Ala lie Leu Gly Val Ser Leu Ala Val Ala Lys Ala Gly Ala Val His
20 25 30
Lys Gly Val Pro Leu Tyr Lys His Leu Ala Asp Leu Ala Gly Val Ser
35 40 45
Lys Val Val Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val lie Asn Gly Gly Ser
50 55 60
His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gin Glu Phe Met lie Leu Pro Val 65 70 75 80
Gly Ala Lys Ser Phe Lys Glu Ala MET Arg MET Gly Ser Glu lie Tyr
85 90 95
His His Leu Lys Ala Glu lie Lys Lys Arg Tyr Gly Leu Asp Ala Thr
100 105 110
Ala Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn lie Gin Asp Asn Lys
115 120 125
Glu Gly Leu Asp Leu Leu Asn Thr Ala lie Lys Leu Ala Gly Tyr Thr
130 135 140
Gly Leu Val Ser lie Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys 145 150 155 160
Glu Asn Glu Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asn Ser Asp
165 170 175
Pro Ser Lys Trp lie Asn Gly Asp Glu Leu Ala Ala Leu Tyr Gin Ser
180 185 190
Phe lie Lys Asp Tyr Pro Val Val Ser lie Glu Asp Ala Phe Asp Gin
195 200 205
Asp Asp Trp Ala Asn Trp Ser Lys Leu Met Gly Asn Thr Ser lie Gin 210 215 220
Leu Val Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg lie Gin Met 225 230 235 240
Ala Val Asp Gin Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gin
245 250 255
lie Gly Ser lie Thr Glu Ser lie Glu Ala Ala Lys Leu Ser Arg Ala
260 265 270
Asn Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp
275 280 285
Cys Phe lie Ala A印Leu Val Val Gly Leu Ala Thr Gly Gin lie Lys
290 295 300
Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gin Leu 305 310 315 320
Leu Arg lie Glu Glu Glu Leu Gly Ala Asp Ala Val Tyr Ala Gly Glu
325 330 335
Asn Phe Arg Asn Pro Gin lie 340
權(quán)利要求
1. 一種編碼線蟲表皮蛋白的基因enol，其特征在于它是由格式線蟲(Steinernemaglasri)產(chǎn)生的，其核苷酸序列為1 ATGATCGAGC TTGACGGAAC CGAGAACAAG TCGAGCCTCG GAGCCAACGC CATCCTCGGC61GTGTCGCTCG CCGTCGCCAA GGCCGGTGCC GTGCACAAGG GAGTGCCCCT CTACAAGCAC121 TTGGCCGATC TCGCCGGAGT GAGCAAGGTT GTCCTCCCCG TTCCTGCCTT CAACGTCATC181 AACGGAGGCT CGCACGCCGG AAACAAGCTC GCCATGCAGG AGTTCATGAT CCTCCCCGTC241 GGAGCCAAGA GCTTCAAGGA GGCCATGCGC ATGGGATCCG AGATCTACCA CCACCTCAAG301 GCCGAGATCA AGAAGCGCTA CGGACTCGAC GCCACCGCCG TCGGAGATGA GGGAGGATTC361 GCCCCCAACA TCCAGGACAA CAAGGAGGGT CTTGACCTCC TCAACACCGC TATCAAGCTT421 GCCGGATATA CCGGACTGGT GTCCATCGGC ATGGACGTCG CCGCCTCCGA GTTCTACAAG481 GAGAACGAGA AGAAGTACGA CTTGGACTTC AAGAACCCCA ACTCCGACCC CAGCAAGTGG541 ATCAACGGAG ACGAGCTCGC CGCGCTCTAC CAGTCGTTCA TCAAGGACTA TCCCGTCGTC601 TCCATCGAGG ACGCCTTCGA CCAGGACGAC TGGGCGAACT GGAGCAAGCT GATGGGCAAC661 ACCTCCATCC AGCTCGTCGG AGATGATCTC ACCGTCACCA ACCCCAAGCG CATCCAGATG721 GCCGTCGACC AGAAGGCGTG CAACTGCCTT CTCCTCAAGG TCAACCAGAT CGGATCCATC781 ACCGAGTCCA TCGAGGCCGC CAAGCTGTCC CGCGCCAACG GATGGGGCGT CATGGTTTCC841 CACCGTTCTG GAGAAACCGA AGACTGCTTC ATCGCTGATC TTGTTGTTGG CCTCGCTACT901 GGACAGATCA AGACCGGAGC CCCTTGCCGA TCTGAGCGTC TCGCCAAGTA CAACCAGCTT961 CTTCGCATCG AGGAGGAGCT CGGAGCCGAT GCCGTGTACG CCGGAGAGAA CTTCCGCAAC1021 CCCCAGATCT AA
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因enol編碼的線蟲表皮蛋白EN01p，其氨基酸序列為:1MIELDGTENKSSLGANAIIiGVSLAVAKAGAVHKGVPLYKH41LADLAGVSKVVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMGEFMILPV81GAKSFKEAMRMGSEIYHHLKAEIKKRYGLDATAVGDEGGF121APNIQDNKEGLDLIiNTAIKLAGYTGLVSIGMDVAASEFYK161enekkyd:ldfknpnsdpskwingdeiaalyqsfikdypvv201SIEDAFDGDDWANWSKLMGNTSIQIiVGDDIiTVTNPKRIGM241AVDQKACNCIiMiKVNQIGSITESIEAAKLSRANGWGVMVS281HRSGETEDCFIADLVVGLATGGIKTGAPCRSERLAKYNGIi321LRIEEEIiGADAVYAGENFRNPQI 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的線蟲表皮蛋白ENOlp，用于制備抗昆蟲血細(xì)胞免疫的粗制品或精制品o
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗昆蟲血細(xì)胞免疫的蛋白質(zhì)粗制品或精制品，用于抑制昆蟲血 細(xì)胞免疫的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白，其特點(diǎn)是根據(jù)格式線蟲(Steinernema glasri)表皮蛋白ENO1p的肽段序列克隆到表皮蛋白基因enol，該蛋白具有抗昆蟲血細(xì)胞免疫的功能。本發(fā)明還涉及該蛋白及其多核苷酸的制備方法和用途。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101386849SQ200710145429
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2007年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者華 劉, 慶 姚, 張雨良, 曾洪梅, 楊懷文, 楊秀芬, 袁京京, 邱德文 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所