專(zhuān)利名稱(chēng)：海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景材料在人類(lèi)及動(dòng)植物的基因組中，包括內(nèi)含子、編碼區(qū)及染色體上的任一區(qū)域，均存在著由1-6個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats)，簡(jiǎn)稱(chēng)SSRs，又稱(chēng)之為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)。隨著分子標(biāo)記的不斷發(fā)展和完善，盡管出現(xiàn)了RAPD、RFLP、AFLP等標(biāo)記，但是微衛(wèi)星標(biāo)記有優(yōu)于其它標(biāo)記的諸多優(yōu)點(diǎn)，如隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中，多態(tài)性高；可通過(guò)PCR迅速擴(kuò)增，需要的DNA樣品量較少，并且重復(fù)性好；孟德?tīng)柺竭z傳，共顯性標(biāo)記；引物序列公開(kāi)發(fā)表，易于在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間共用。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。
海灣扇貝自然分布于分布于美國(guó)的東海岸和墨西哥灣沿岸，是一種雌雄同體的雙殼海生貝類(lèi)。由于其生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美，我國(guó)于1982年從美國(guó)引進(jìn)海灣扇貝，首次在世界上形成了海灣扇貝養(yǎng)殖業(yè)，并迅速發(fā)展成為我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖貝類(lèi)，在海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位。然而近十余年來(lái)，海灣扇貝在育苗與養(yǎng)殖過(guò)程中，病害頻發(fā)、個(gè)體小型化，嚴(yán)重影響了海灣扇貝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。產(chǎn)生這些問(wèn)題的原因是多方面的，但也與其種質(zhì)質(zhì)量有關(guān)。海灣扇貝為雌雄同體，易于發(fā)生自交，加之引種時(shí)間長(zhǎng)、引進(jìn)的種貝數(shù)量少、長(zhǎng)期連續(xù)多代的人工近親繁殖和生產(chǎn)者的逆向選擇等，可能會(huì)引起養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平降低、生產(chǎn)性狀質(zhì)量下降等。因此，深入研究海灣扇貝的種質(zhì)資源，才能夠從根本上解決這些問(wèn)題。同時(shí)利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)分析，對(duì)于海灣扇貝資源保護(hù)、持續(xù)利用和品牌戰(zhàn)略具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用GenBank公布的海灣扇貝ESTs序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件RepeatReporter 1.5進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的查找，對(duì)于二堿基重復(fù)大于7次、三堿基重復(fù)大于5次、四堿基重復(fù)大于4次、五堿基重復(fù)大于3次和六堿基重復(fù)大于3次的微衛(wèi)星片斷進(jìn)行快速分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)一步優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過(guò)程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值(PIC)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，得到17個(gè)標(biāo)記微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系(表1)，用于海灣扇貝種質(zhì)及群體遺傳學(xué)分析；然后再進(jìn)一步選取不同養(yǎng)殖條件下的海灣扇貝對(duì)篩選成功的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。


圖1位點(diǎn)AIMS020擴(kuò)增兩個(gè)養(yǎng)殖群體的帶譜圖(每個(gè)群體示5個(gè)個(gè)體)圖2位點(diǎn)AIMS026擴(kuò)增兩個(gè)養(yǎng)殖群體的帶譜圖(每個(gè)群體示5個(gè)個(gè)體)具體實(shí)施方式
位點(diǎn)的篩選及其用于種質(zhì)資源評(píng)價(jià)位點(diǎn)的確定。
1、微衛(wèi)星位點(diǎn)來(lái)源及引物的設(shè)計(jì)利用微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter 1.5對(duì)GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行微衛(wèi)星DNA的查找，對(duì)于二堿基重復(fù)大于7次、三堿基重復(fù)大于5次、四堿基重復(fù)大于4次、五堿基重復(fù)大于3次和六堿基重復(fù)大于3次的微衛(wèi)星DNA進(jìn)行快速分離得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列。采用軟件BioEdit對(duì)含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的ESTs序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，選取不重復(fù)的序列進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物。
國(guó)外學(xué)者發(fā)展的位點(diǎn)參照Robert等(2005)。
2、引物的設(shè)計(jì)在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和Oligo 6.44設(shè)計(jì)引物；引物設(shè)計(jì)應(yīng)滿(mǎn)足下列條件(1)引物長(zhǎng)度為20-25mer；(2)GC含量大于40％；(3)退火溫度大于45℃(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為80-400bp。
3、引物的優(yōu)化不同的引物根據(jù)不同的Tm值，在溫度梯度PCR儀上做溫度梯度(在Tm值上下各做10度)優(yōu)化。擴(kuò)增反應(yīng)采用Biometra T-Gradient PCR系統(tǒng)，PCR程序?yàn)?5℃下預(yù)變性5分鐘，95℃變性45秒，退火45秒，72℃延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μL含有正、反引物各0.2μM、dNTPs各0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1個(gè)單位的Taq酶，80ng DNA作為PCR模板，該模板是從40個(gè)個(gè)體中任意取5個(gè)個(gè)體的DNA等量混合得到。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，選取雜帶較少、特異性產(chǎn)物亮度較高的PCR反應(yīng)對(duì)應(yīng)的溫度為該引物的最佳退火溫度Ta。
4、標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星位點(diǎn)的確立微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性水平可用多態(tài)信息含量值[PIC(Polymorphism InformationContent)]衡量。一般情況下，多態(tài)信息含量值能反映出某一個(gè)遺傳標(biāo)記所包含的或所能夠提供的遺傳信息的容量，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記可提供豐富的遺傳信息；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記能夠較為合理的提供遺傳信息，而當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差。依據(jù)上述優(yōu)化獲得的Ta值，選取40個(gè)個(gè)體作為群體進(jìn)行多態(tài)性信息含量值的計(jì)算。PCR程序?yàn)樵?5度下預(yù)變性5分鐘，95度變性45秒，Ta(各引物優(yōu)化的最佳退火溫度)退火45秒，72度下延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μL，含有正反引物各0.2μM、dNTPs 0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1個(gè)單位的Taq酶、20ng DNA模板。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，電泳完畢后用溴化乙錠(濃度為0.15μg/mL)染色，紫外觀察成像并對(duì)電泳譜帶利用公式PIC＝1-∑Pi2進(jìn)行計(jì)算，其中Pi是第i個(gè)等位基因的頻率，所有位點(diǎn)的等位基因頻率由軟件POPGENE32計(jì)算得出。根據(jù)PIC值的計(jì)算結(jié)果，去除重復(fù)性、穩(wěn)定性差，PIC小于0.25標(biāo)記，最后共篩選出重復(fù)性、穩(wěn)定性好，PIC值大于0.25的17個(gè)位點(diǎn)，作為海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星評(píng)價(jià)體系，用于海灣扇貝的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。
以下為利用上面得到的評(píng)價(jià)體系進(jìn)行櫛孔扇貝不同地理群體評(píng)價(jià)的實(shí)例及其方法步驟1、提取海灣扇貝DNA本試驗(yàn)選用的海灣扇貝采自黃島和蓬萊兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)選取50只健康的貝做為實(shí)驗(yàn)材料，貝樣活體解剖后取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿(mǎn)冰無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10min。將核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無(wú)菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存用于PCR擴(kuò)增。
2、PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件為40ng海灣扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR程序參數(shù)為95℃變性45秒，Ta退火45秒，72℃延伸45秒，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)(pUC19/HaeIII)。電泳2-3小時(shí)后用溴化乙錠(濃度0.15mg/mL)染色，凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像(代表圖譜見(jiàn)圖1、圖2)，并利用軟件QuantityOne對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量相比照，對(duì)每個(gè)個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的大小確定，從而進(jìn)行快速的、準(zhǔn)確的確定基因型。將譜帶轉(zhuǎn)換成軟件POPGENE 32能夠識(shí)別的數(shù)據(jù)，利用軟件POPGENE 32對(duì)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。其結(jié)果可以反應(yīng)出不同地理群體(種群)的Hardy-Weinberg平衡性、雜合度、等位基因頻率等遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，從而應(yīng)用于海灣扇貝不同地理群體(種群)的種質(zhì)資源分析。因此，以17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系的建立，為相關(guān)研究室之間數(shù)據(jù)的比對(duì)和交流提供了基礎(chǔ)，也有望為保護(hù)和持續(xù)利用海灣扇貝種質(zhì)資源，建立集約型、健康型養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，堅(jiān)持品牌戰(zhàn)略提供技術(shù)支持。

表1.用于海灣扇貝(Argopecten irradians)種質(zhì)資源分析的微衛(wèi)星標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是利用GenBank公布的海灣扇貝ESTs序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter 1.5進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的查找和微衛(wèi)星片斷進(jìn)行快速分離；在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)一步優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；然后再對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過(guò)程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系。
2.一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是得到含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的步驟為利用GenBank公布的海灣扇貝ESTs序列，利用自行設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter 1.5進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的查找，對(duì)于二堿基重復(fù)大于7次、三堿基重復(fù)大于5次、四堿基重復(fù)大于4次、五堿基重復(fù)大于3次和六堿基重復(fù)大于3次的微衛(wèi)星片斷進(jìn)行快速分離。
3.一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物步驟為在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5和Oligo 6.44設(shè)計(jì)引物；引物設(shè)計(jì)應(yīng)滿(mǎn)足下列條件(1)引物長(zhǎng)度為20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度大于45℃(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為80-400bp。
4.一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征是對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過(guò)程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系。
5.一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用，其特征是上述的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組成的標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系應(yīng)用于不同養(yǎng)殖群體的海灣扇貝綜合種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。
全文摘要
一種海灣扇貝標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其方法是利用利用GenBank公布的海灣扇貝ESTs序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件Repeat Reporter1.5查找并分離微衛(wèi)星DNA；然后在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，并優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；再對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在擴(kuò)增過(guò)程中的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性信息含量值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確認(rèn)其中的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)價(jià)體系，應(yīng)用于海灣扇貝種質(zhì)及群體遺傳學(xué)分析；利用上述的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記組成的評(píng)價(jià)體系再進(jìn)一步選取不同養(yǎng)殖條件下的海灣扇貝進(jìn)行種質(zhì)資源評(píng)價(jià)。本方法有望為保護(hù)和持續(xù)利用海灣扇貝種質(zhì)資源，建立集約型、健康型養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和品牌戰(zhàn)略提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q3/00GK1793358SQ20051004479
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者胡景杰, 包振民, 汪小龍, 戰(zhàn)愛(ài)斌, 惠敏, 陸維 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)