專(zhuān)利名稱(chēng)：快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于貝類(lèi)DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)飛速發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)，尤其是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用，為個(gè)體的遺傳特征和種群遺傳結(jié)構(gòu)等分子遺傳學(xué)研究提供了有力的工具，其中具有代表性的標(biāo)記系統(tǒng)——微衛(wèi)星標(biāo)記越來(lái)越受到青睞。微衛(wèi)星(Microsatellite)，亦稱(chēng)簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSRs)，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(多數(shù)為1～6個(gè))為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。由于微衛(wèi)星DNA廣泛存在于基因組中，并且極具多態(tài)性、穩(wěn)定性高、特異性高、共顯性遺傳、檢測(cè)快捷，引物序列公開(kāi)發(fā)表，易于在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間共用等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛地用于遺傳疾病的診斷、遺傳連鎖圖的構(gòu)建、基因的定位與克隆、親權(quán)分析、群體遺傳多樣性研究、種質(zhì)鑒定、進(jìn)化生物學(xué)研究等領(lǐng)域。
微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用一般需要經(jīng)過(guò)以下四步1)獲得微衛(wèi)星序列，2)微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，3)PCR擴(kuò)增目的DNA，4)用適當(dāng)?shù)氖侄螜z測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。其中第一步是限速步驟，同時(shí)也是最為復(fù)雜、最為耗時(shí)費(fèi)力的步驟。自20世紀(jì)80年代中期微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)始受到廣泛關(guān)注以來(lái)，人們大多采用傳統(tǒng)的構(gòu)建小型DNA文庫(kù)、利用SSR探針篩選陽(yáng)性克隆的方法。但這種方法效率較為低下，尤其是在微衛(wèi)星含量不是很豐富的物種，這種現(xiàn)象表現(xiàn)的尤為明顯。統(tǒng)計(jì)表明，在貝類(lèi)中利用上述篩選方式得到的陽(yáng)性克隆率僅為0.1～6.4％，平均1.96％。因此，傳統(tǒng)的篩選方式造成了人力和物力的極大浪費(fèi)。近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)和信息網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展，從公用數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的序列中篩選微衛(wèi)星DNA成為簡(jiǎn)單廉價(jià)的方式，但是大多數(shù)物種，尤其是研究起步較晚的海洋和水產(chǎn)生物，在公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息不足以滿(mǎn)足篩選的需要或者根本沒(méi)有任何序列信息。
不同的篩選方式以及其效率成為學(xué)者們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)，不同的學(xué)者亦試用不同的篩選力法和策略以提高篩選效率，國(guó)內(nèi)外不同的學(xué)者和實(shí)驗(yàn)室也相繼報(bào)道了包括雜交篩選法(Hybridization Selection)、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of SequencesContaining Repeats)法和RAPD—微衛(wèi)星探針Southern雜交法等方法，但在貝類(lèi)應(yīng)用中都存在著共同的缺點(diǎn)陽(yáng)性克隆率較低，效率較為低下。本發(fā)明富集文庫(kù)—菌落原位雜交快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法多種貝類(lèi)應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性和重復(fù)性極好，并且陽(yáng)性克隆率可以達(dá)到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個(gè)位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，以彌補(bǔ)已有技術(shù)的不足。
本發(fā)明是按照以下步驟完成的1)提取貝類(lèi)的基因組DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?)利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性?xún)?nèi)切酶方法獲得貝類(lèi)基因組DNA片斷，并構(gòu)建富集文庫(kù)；3)將富集文庫(kù)中的含有插入片斷的大腸桿菌菌落原位雜交，然后放射自顯影確定陽(yáng)性克隆；4)陽(yáng)性克隆測(cè)序并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因組DNA。
本方法可靠性和重復(fù)性極好，并且陽(yáng)性克隆率可以達(dá)到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個(gè)位點(diǎn)，可以在一周之內(nèi)獲得大量微衛(wèi)星標(biāo)記的有效的技術(shù)方法。


圖1富集文庫(kù)—菌落原位雜交快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的技術(shù)方法的流程及原理示意圖。
圖2菌落原位雜交結(jié)果示圖。其中黑色斑點(diǎn)為陽(yáng)性克隆放射自顯影留下的印記。
具體實(shí)施例方式1、提取貝類(lèi)的基因組DNA，方法如下貝樣活體解剖后取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯方/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿(mǎn)冰無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10min。將核酸沉淀于管底。70％7醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無(wú)菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
2、富集文庫(kù)的構(gòu)建，方法如下
1)貝類(lèi)基因組DNA片斷獲得。在構(gòu)建富集文庫(kù)時(shí)，貝類(lèi)基因組DNA片斷的獲得可分別采用以下兩種方法①AFLP片斷的獲得AFLP分析參考Vos等(1995)的方法。引物和接頭由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一個(gè)單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含5μl連接產(chǎn)物，0.2mmol/L的引物(EOO，序列為5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；MOO序列為5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR結(jié)束后，10個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合乙醇沉淀，加入20uL三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
亦可用以下方式獲得貝類(lèi)基因組DNA片斷，即②限制性酶切片斷的獲得(以HaeIII為例，可根據(jù)基因組特點(diǎn)選擇其它四堿基平端限制性?xún)?nèi)切酶)，具體方法為取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個(gè)單位的限制性?xún)?nèi)切酶HaeIII酶切3個(gè)小時(shí)。酶切后T4連接酶連上接頭，連接反應(yīng)為30μl，其中含有酶切產(chǎn)物20μ1，接頭(接頭組成為21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3’和25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3’)50ng，1×T4連接緩沖液，T4連接酶2U，反應(yīng)在16℃下反應(yīng)12小時(shí)。連有接頭的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得多個(gè)拷貝，PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產(chǎn)物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環(huán)前預(yù)變性3min；最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR結(jié)束后，10個(gè)反應(yīng)體系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95度變性5分鐘待用。
2)基因組片斷的富集。①雜交膜的準(zhǔn)備取濃度為100μM的探針[以(GA)20和(CA)20為例]各0.5μl點(diǎn)在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾干后80℃烘烤2個(gè)小時(shí)固定探針。將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預(yù)雜交72小時(shí)。然后將膜在1％的SDS中沸浴10min，去除沒(méi)有結(jié)合好的探針。②雜交將變性好的基因組DNA片斷加入到600μl的雜交液中，加入預(yù)雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。③洗脫洗膜采用如下嚴(yán)謹(jǐn)度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下水浴下洗脫2次，每次15分鐘；用600uL的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。將500μl的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個(gè)小時(shí)以上(或者過(guò)夜)，4℃12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，將沉淀用-20℃預(yù)冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水。
3)富集產(chǎn)物的克隆取洗脫片斷溶液2μl作為恢復(fù)PCR(Recovery PCR)的模板，反應(yīng)為20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30分鐘，其它PCR反應(yīng)成分和條件同3.1)①和3.1)②。反應(yīng)結(jié)束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克降采用Takara公司的pMD18-T載體試劑盒，連接反應(yīng)參照Takara公司pMD18-T載體試劑盒說(shuō)明。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固體LB平板上。
3、菌落原位雜交篩選陽(yáng)性克隆的方法為1)菌落重排與轉(zhuǎn)膜將轉(zhuǎn)化后的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)至合適大小。培養(yǎng)好菌落轉(zhuǎn)至NC膜上(Immobilon-NC TransferMembranes，Millipore)，然后膜在空氣中干燥10分鐘。然后NC膜放入變性緩沖液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣干燥10分鐘。中和緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的NC膜空氣干燥后放入80℃烘烤2小時(shí)固定質(zhì)粒。
2)探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記采用Amersham公司的Gene Images 3’-OligolabellingModule試劑盒。標(biāo)記反應(yīng)在37℃下標(biāo)記70分鐘，80uL反應(yīng)體系中含有100μM的探針1μl，F(xiàn)luorescein-11-dUTP 5μl，1×緩沖液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase)。標(biāo)記好的探針?lè)湃?20℃冰箱中備用。
3)雜交雜交系統(tǒng)采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit試劑盒。將烘烤好的NC膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的液體封阻(Liquid Block，試劑盒提供)，0.5％(W/V)分子量為500000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500000)]中預(yù)雜交1小時(shí)。然后將雜交液去除，加入足量的雜交液和標(biāo)記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過(guò)夜。
4)洗脫將雜交過(guò)夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然后在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。
5)抗體—抗原反應(yīng)于放射自顯影將膜放入到含有稀釋20倍的液體封阻中封阻至少30分鐘，然后將膜放入到抗體液中反應(yīng)30分鐘，抗體液含有1000倍稀釋的抗體(試劑盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。處理完NC膜后，在暗室中壓上X-膠片，感光1h，進(jìn)行顯影及定影。
6)陽(yáng)性克隆的確定以及陽(yáng)性克隆的測(cè)序按照原先確定的方位，將X—膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進(jìn)行對(duì)照，在相同的位置上挑出陽(yáng)性克隆，搖菌送商業(yè)公司用M13引物測(cè)序。
4、在測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片斷。引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設(shè)計(jì)采用以下嚴(yán)謹(jǐn)度(1)引物長(zhǎng)度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-250bp。
下面以櫛孔扇貝為例通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明1、DNA的提取取櫛孔扇貝閉殼肌約0.1克，加入500μlSTE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl 10％的SDS(10％)，以及5μl 20mg/ml的蛋白酶K，56度處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿(mǎn)冰無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。將核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無(wú)菌水和少量RNase A，4度直到DNA全部溶解，紫外分光光度計(jì)定量備用。
2.富集文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)于富集文庫(kù)的構(gòu)建，本發(fā)明敘述2種不同的方法AFLP片斷富集文庫(kù)和Hae III限制性酶切片斷富集文庫(kù)。
(1)AFLP片斷的獲得AFLP分析參考Vos等(1995)的方法。引物和接頭由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一個(gè)單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含5μl連接產(chǎn)物，0.2mmol/L的引物(EOO和MOO)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR結(jié)束后10個(gè)反應(yīng)體系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
(2)限制性酶切片斷的獲得取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個(gè)單位的限制性?xún)?nèi)切酶HaeIII酶切3個(gè)小時(shí)。酶切后T4連接酶連上接頭，連接反應(yīng)為30μl，其中含有酶切產(chǎn)物20μl，接頭(接頭組成為21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3’和5’磷酸化的25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3’)50ng，1×T4連接緩沖液，T4連接酶2U，反應(yīng)在16℃下反應(yīng)12小時(shí)。連有接頭的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得多個(gè)拷貝，PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產(chǎn)物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環(huán)前預(yù)變性3min；最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR結(jié)束后，10個(gè)反應(yīng)體系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。
(3)Hybond N+膜的制備取濃度為100μM的探針(GA)20和(CA)20各0.5μl點(diǎn)在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾干后80℃烘烤2個(gè)小時(shí)固定探針。
(4)預(yù)雜交將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預(yù)雜交3天。然后將膜在1％的SDS中沸浴10min，去除沒(méi)有結(jié)合好的探針。
(5)雜交和洗膜將變性好的PCR產(chǎn)物加到600μl的雜交液中，加入預(yù)雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。洗膜采用如下嚴(yán)謹(jǐn)度1)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下洗脫2次，每次15分鐘；2)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；3)用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。將500μl的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個(gè)小時(shí)以上(或者過(guò)夜)，4℃12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，將沉淀用—20℃預(yù)冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水。
(6)克隆富集片度取洗脫片斷溶液2μl作為恢復(fù)PCR(Recovery PGR)的模板，反應(yīng)為20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克隆采用Takara公司的pMD18-T載體試劑盒，連接反應(yīng)參照Takara公司pMD18-T載體試劑盒說(shuō)明。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固體LB平板上。
3菌落原位雜交(1)菌落轉(zhuǎn)膜將轉(zhuǎn)化后的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)至合適大小。培養(yǎng)好菌落轉(zhuǎn)至NC膜上(Immobilon-NC Transfer Membranes，Millipore)，然后膜在空氣中干燥10分鐘。然后NC膜放入變性緩沖液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣干燥10分鐘。中和緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的NC膜空氣干燥后放入80℃烘烤2小時(shí)固定質(zhì)粒。
(2)探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記采用Amersham公司的Gene Images 3’-Oligolabelling Module試劑盒。標(biāo)記反應(yīng)在37℃下標(biāo)記70分鐘，80μl反應(yīng)體系中含有100μM的探針1μl，F(xiàn)luorescein-11-dUTP 5μl，1×緩沖液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase)。標(biāo)記好的探針?lè)湃?20℃冰箱中備用。
(3)雜交雜交系統(tǒng)采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit試劑盒。將烘烤好的NC膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的液體封阻(Liquid Block，試劑盒提供)，0.5％(W/V)分子量為500,000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500,000)]中預(yù)雜交1小時(shí)。然后將雜交液去除，加入足量的雜交液和標(biāo)記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過(guò)夜。
(4)洗膜將雜交過(guò)夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然后在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。
(5)抗體抗原反應(yīng)及X—射線(xiàn)自顯影將膜放入到含有稀釋20倍的液體封阻中封阻至少30分鐘，然后將膜放入到抗體液中反應(yīng)30分鐘，抗體液含有1000倍稀釋的抗體(試劑盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。處理完NC膜后，在暗室中壓上X-膠片，感光1h，進(jìn)行顯影及定影。
(6)陽(yáng)性克隆的挑選按照原先確定的方位，將X—膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進(jìn)行對(duì)照，在相同的位置上挑出陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測(cè)序。
4、陽(yáng)性克隆測(cè)序?qū)㈥?yáng)性克隆用液體LB培養(yǎng)基搖起后送商業(yè)公司用M13引物測(cè)定序列5、引物設(shè)計(jì)在測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片斷。引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設(shè)計(jì)采用以下嚴(yán)謹(jǐn)度(1)引物長(zhǎng)度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-250bp。
通過(guò)上述方法，一次共獲得櫛孔扇貝的陽(yáng)性克隆324個(gè)，測(cè)序結(jié)果顯示全部324個(gè)陽(yáng)性克隆全部含有微衛(wèi)星重復(fù)，其中286個(gè)克隆可以設(shè)計(jì)引物。因此，充分驗(yàn)證了本方法能快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記，即可以實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)獲得大量微衛(wèi)星標(biāo)記的快速有效的方法。
權(quán)利要求
1.快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，其特征在于操作步驟1)提取貝類(lèi)的基因組DNA 4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?)富集文庫(kù)的構(gòu)建；3)菌落原位雜交；4)陽(yáng)性克隆測(cè)序并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因組DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集文庫(kù)-菌落原位雜交快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的技術(shù)方法，其特征在于提取貝類(lèi)的基因組DNA，步驟為貝樣活體解剖后取閉殼肌約0.1克，加入500μl STE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μl)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿(mǎn)冰無(wú)水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10min。將核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100μl的無(wú)菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的技術(shù)方法，其特征在于富集文庫(kù)的構(gòu)建。1)貝類(lèi)基因組DNA片斷獲得在構(gòu)建富集文庫(kù)時(shí)，AFLP片斷獲得的方法為EcoRI和Mse I各一個(gè)單位完全雙酶切300ng基因組DNA，T4連接酶將酶切片段連上接頭。PCR反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含5μl連接產(chǎn)物，0.2mmol/L的引物(E00，序列為GACTGCGTACCAATTC；M00序列為GATGAGTCCTGAGTAA)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，2.5U的Taq DNA聚合酶；PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min；PCR反應(yīng)結(jié)束后，10個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃變性5分鐘待用。2)如權(quán)利要求3所述的貝類(lèi)基因組DNA片斷獲得，限制性酶切片斷的獲得的方法為取約300ng櫛孔扇貝總DNA，在20μl體系中用2個(gè)單位的限制性?xún)?nèi)切酶HaeIII酶切3個(gè)小時(shí)。酶切后T4連接酶連上接頭，連接反應(yīng)為30μl，其中含有酶切產(chǎn)物20μl，接頭(接頭組成為21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA和5’磷酸化的25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA)50ng，1×T4連接緩沖液，T4連接酶6Weiss U，反應(yīng)在16℃下反應(yīng)12小時(shí)。連有接頭的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得多個(gè)拷貝，PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中含有DNA片斷的連接產(chǎn)物6μl，1mM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循環(huán)前預(yù)變性3min；最后一次循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR結(jié)束后，10個(gè)反應(yīng)體系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95度變性5分鐘待用。3)基因組片斷的富集。①雜交膜的準(zhǔn)備取濃度為100mM的探針(GA)20和(CA)20各0.5μl點(diǎn)在直徑約為5mm的Hybond N+雜交膜上，空氣中晾干后80℃烘烤2個(gè)小時(shí)固定探針。將固定好探針的Hybond N+膜放在雜交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸鈉(pH＝7.0)]中37℃預(yù)雜交72小時(shí)。然后將膜在1％的SDS中沸浴10分鐘，去除沒(méi)有結(jié)合好的探針。②雜交將變性好的基因組DNA片斷加入到600μl的雜交液中，加入預(yù)雜交好的Hybond N+膜，37℃雜交1-2天。③洗脫洗膜采用如下嚴(yán)謹(jǐn)度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在60℃下水浴下洗脫2次，每次15分鐘；用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在62℃下水浴30分鐘；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脫液在65℃下水浴30分鐘洗脫雜交片斷。再將500μ1的洗脫液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的異丙醇，-20℃冷凍2個(gè)小時(shí)以上，4℃12,000轉(zhuǎn)離心20分鐘，將沉淀用-20℃預(yù)冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水；4)富集產(chǎn)物的克隆取洗脫片斷溶液2μl作為恢復(fù)PCR(Recovery PCR)的模板，反應(yīng)為20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30分鐘；PCR反應(yīng)結(jié)束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片斷的克隆T載體。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固體LA平板上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，其特征在于菌落原位雜交篩選陽(yáng)性克隆的步驟如下1)菌落重排與轉(zhuǎn)膜將轉(zhuǎn)化后的白斑重新挑起，有序的重排接種至新的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；培養(yǎng)好菌落轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后膜在空氣中干燥10分鐘。然后硝酸纖維素膜放入變性緩沖液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中變性7分鐘，空氣干燥10分鐘。中和緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分鐘。將中和好的硝酸纖維素膜空氣干燥后放入80℃烘烤2小時(shí)固定。2)探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記采用Amersham公司的Gene Images 3’-Oligolabelling試劑盒。標(biāo)記反應(yīng)在37℃下標(biāo)記70分鐘，80μl反應(yīng)體系中含有100mM的探針1μl，F(xiàn)luorescein-11-dUTP 5μl，1×緩沖液(Cacodylate Buffer)，32U的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase)。標(biāo)記好的探針?lè)湃?20℃冰箱中備用。3)雜交雜交系統(tǒng)采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection試劑盒。將烘烤好的硝酸纖維素膜放入雜交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀釋20倍的封阻液，0.5％(W/V)的多聚硫酸葡聚糖]中預(yù)雜交1小時(shí)。然后將雜交液去除，加入足量的雜交液和標(biāo)記好的探針，使雜交液的量為0.125-0.25mL/cm2，探針的濃度為5-10ng/mL，37度振蕩雜交過(guò)夜。4)洗脫將雜交過(guò)夜的硝酸纖維素膜放在5×SSC，0.5％SDS的洗脫液中室溫振蕩洗脫2次，每次5分鐘。然后在含有1×SSC，0.5％SDS的洗脫液中37℃振蕩洗脫15分鐘，含有1×SSC，0.5％SDS的洗脫液中42℃振蕩洗脫15分鐘。5)抗體-抗原反應(yīng)于放射自顯影將膜放入到抗體液中反應(yīng)30分鐘后，在暗室中壓上X光膠片，感光1小時(shí)后顯影及定影。6)陽(yáng)性克隆的確定以及陽(yáng)性克隆的測(cè)序按照原先確定的方位，將X-膠片、硝酸纖維素膜、平板三者進(jìn)行對(duì)照，在相同的位置上挑出陽(yáng)性克隆，用M13引物測(cè)序。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，其特征在于在測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增該位點(diǎn)的微衛(wèi)星片斷。引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設(shè)計(jì)采用以下嚴(yán)謹(jǐn)度(1)引物長(zhǎng)度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度45-65度；(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-250bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速分離、篩選貝類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，首先提取貝類(lèi)的基因組DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗缓罄蒙鲜鎏崛〉腄NA，用已有的AFLP方法或者限制性?xún)?nèi)切酶方法獲得貝類(lèi)基因組DNA片斷，并構(gòu)建富集文庫(kù)；接著將富集文庫(kù)中的含有插入片斷的大腸桿菌菌落原位雜交，然后放射自顯影確定陽(yáng)性克??；最后陽(yáng)性克隆測(cè)序并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因組DNA。本方法可靠性和重復(fù)性極好，并且陽(yáng)性克隆率可以達(dá)到100％，一次篩選可以獲得上百甚至幾百個(gè)位點(diǎn)，可以在一周之內(nèi)獲得大量微衛(wèi)星標(biāo)記的有效的技術(shù)方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1793357SQ20051004479
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者胡景杰, 包振民, 汪小龍, 戰(zhàn)愛(ài)斌, 惠敏, 陸維 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)