專利名稱：花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類生物技術(shù)中的細胞移植技術(shù)，是一種海水魚類花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法。
背景技術(shù)：
嵌合體(chimera)是指由兩種或兩種以上不同遺傳組成的細胞構(gòu)成的個體，這種個體的組織器官由基因型不同的細胞群組成。本發(fā)明做出之前，魚類嵌合體的研究在國外已有相關(guān)報道。未分化的魚類囊胚細胞和胚胎干細胞都可作為細胞移植和制備嵌合體的供體細胞。
1、囊胚細胞作為供體進行細胞移植制備嵌合體。美國的Lin等于1992年將小型模式魚-野生斑馬魚囊胚早期細胞(標(biāo)記了LacZ基因)移植到白化型斑馬魚囊胚中，共顯微注射了418個胚胎，70個胚胎生存到了性成熟階段，其中23個為嵌合體魚，黑色素出現(xiàn)在從背部到腹部的橫帶內(nèi)，將嵌合體魚與白化個體交配，產(chǎn)生了具有黑色素的后代，首次獲得了魚類生殖系嵌合體；1992年，美國的Nilson和Cloud用異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-dextran)標(biāo)記虹鱒囊胚細胞，注射的114個囊胚中，19個胚胎含有熒光素細胞，發(fā)育成嵌合體。日本的Wakamastu等(1994)得到了小型模式魚青鳉的生殖系嵌合體。
2、胚胎干細胞(Embryonic Stem cell，ES細胞)為供體的細胞移植制備嵌合體。在這方面研究中，國內(nèi)外目前僅有2篇相關(guān)報道。德國的Hong等(1998)首次得到小型模式魚青鳉ES樣細胞來源的嵌合體。西班牙的Béjar等(2002)將瞬時表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的金鯛(Sparus aurata)ES細胞顯微注射到金鯛的早期囊胚中，注射前，卵膜用10μg/ml的pronase蛋白酶進行了軟化處理。24小時后，150個注射胚胎中26形成了嵌合體，嵌合分布在血管、聽囊、體節(jié)和內(nèi)臟等器官和組織。
目前除本發(fā)明外，小型模式魚的嵌合體制備比較成功，而大型經(jīng)濟魚類的嵌合體制備僅見于虹鱒和金鯛，其中虹鱒嵌合體制備是以未培養(yǎng)的囊胚細胞作供體，金鯛嵌合體制備是以長期培養(yǎng)的魚類ES細胞為供體，國內(nèi)外尚無花鱸胚胎干細胞(LJES1細胞)移植制備嵌合體的報道。
小型模式魚嵌合體的制備只具有理論意義，無法為生產(chǎn)實踐提供技術(shù)手段；而在制備金鯛ES細胞來源的嵌合體時，金鯛受體囊胚的卵膜用高濃度的蛋白酶pronase進行了軟化處理，易導(dǎo)致胚胎的死亡和畸形，不利于嵌合體的正常發(fā)育；另外，在供體細胞的標(biāo)記上，青鳉ES細胞和金鯛ES細胞都是GFP的瞬時表達，獲得的嵌合體在發(fā)育過程中會丟失綠色熒光的特征，不利于準確觀測供體細胞參與受體生長和分化的情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種有效的、適于LJES1細胞移植和嵌合體制備的方法，使獲得的嵌合體胚胎和魚苗同時具有供體和受體的特征，為證實LJES1細胞發(fā)育全能性提供最直接的證據(jù)，為實現(xiàn)細胞水平到個體水平的定點突變搭建橋梁，為最終建立魚類基因打靶技術(shù)和基因功能研究提供技術(shù)平臺，開辟海水魚類基因工程育種新途徑。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的它的操作程序是受體-囊胚期胚胎的準備、供體細胞的制備、應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體、嵌合體胚胎和魚苗的檢測、培養(yǎng)。
受體的準備發(fā)育至囊胚期(1000個細胞)的花鱸胚胎可作為細胞移植的受體。
供體細胞的制備供體細胞為穩(wěn)定表達GFP的LJES1細胞，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將線性化pCMVEGFP質(zhì)粒DNA(1ug DNA4ul Genejuice)轉(zhuǎn)化至生長狀態(tài)良好的LJES1細胞內(nèi)；轉(zhuǎn)化前一天，用完全培養(yǎng)基以15×104/ml細胞接種1ml到每個12孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞70％-80％長滿；轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)6小時后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光在細胞中表達，以含0.6ug-0.8ug/ml嘌呤霉素(puromycin)的培養(yǎng)基篩選3-4個星期，得到穩(wěn)定表達LJES1細胞克??；擴大培養(yǎng)，細胞移植前收集細胞，加入TM溶液(100mM NaCl，5mM KCl，5mM Hepes，pH7.1)制成單細胞懸液作為細胞移植的供體。
應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體進行細胞移植制備嵌合體使用顯微注射方法。用長而相對柔軟的撥卵針，撥動單排直線排列在特制瓊脂凹槽中的受體囊胚，使動物極移至上方；同時用顯微注射針吸取上述20-50個供體細胞注射到受體囊胚中，全部操作在解剖鏡下進行。
撥卵針為自行拉制的柔軟的玻璃針，使用日本Narishige公司PC-10拉針儀，采用一步拉針法(90℃)，拉制內(nèi)徑為1.0mm的毛細玻璃管而成。
瓊脂凹槽在90mm塑料培養(yǎng)皿中倒入2％熔化瓊脂，厚度3-5mm，膠面上放置有機玻璃莢膜，待瓊脂冷卻后取出莢膜即成；瓊脂凹槽規(guī)格60mm×1-1.5mm×1-1.5mm。
顯微注射針顯微注射針為自行拉制，使用日本Narishige公司PC-10拉針儀，采用兩步拉針法(99℃和76℃)，拉制內(nèi)徑為1.0mm的毛細玻璃管，用游絲鑷斷針，使針尖銳利，斷面為小于30°的銳角，內(nèi)徑在15-20um。
嵌合體胚胎和魚苗的觀測、培養(yǎng)將注射后的胚胎在無菌海水中培養(yǎng)，24小時熒光顯微鏡下觀察胚胎是否具有綠色熒光的表達及分布位置。表達綠色熒光的胚胎即為嵌合體，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)，孵化后的魚苗用新鮮過濾海水培養(yǎng)，每隔24小時對其進行熒光觀測，并用PCR方法驗證GFP基因的整合。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比，具有以下特點1、本發(fā)明所用的供體細胞為穩(wěn)定表達GFP的LJES1細胞，嵌合體中來自供體的特征不會隨著生長發(fā)育而丟失。
2、多數(shù)海水魚類卵和胚胎的特性相同，均是浮性，卵膜為雙層，外膜致密堅韌，不易被酶類消化掉。本發(fā)明由于在注射針的拉制和顯微注射手法上具有獨特之處，無需對胚胎卵膜進行任何軟化處理，注射針可容易進入海水魚類囊胚內(nèi)，注射針對受體的損傷較小，利于在高鹽海水中存活，嵌合體的成活率和孵化率高，本發(fā)明所用實驗手段對生產(chǎn)實踐更具有指導(dǎo)意義。
3、應(yīng)用本方法進行LJES1細胞移植制備的嵌合體其成功率、成活率和孵化率分別為58％、56％和79％，與已有的魚類嵌合體制備的報道相比，本發(fā)明和金鯛嵌合體的制備具有最大的可比性。首先，供體細胞都是長期傳代的胚胎干細胞；其次都是大型經(jīng)濟海水魚類，卵和胚胎的特性相似。本發(fā)明在制備嵌合體的成功率、成活率和孵化率方面均高于金鯛，充分證明本發(fā)明在方法和技術(shù)上更適用于大型海水魚類的細胞移植和嵌合體制備，具有更強的實用性。
4、本發(fā)明在操作上較為簡單快捷，易于掌握。


圖1顯微注射針，圖2特制的瓊脂凹糟(箭頭所指之處)，圖3撥卵針，圖4供體細胞注射到受體囊胚中。
具體實施例方式下面通過實施例以LJES1細胞移植制備嵌合體詳述本發(fā)明的方法內(nèi)容它的操作程序是受體-花鱸囊胚期胚胎的準備、供體細胞的制備、應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體、嵌合體胚胎和魚苗的檢測、培養(yǎng)。
受體-花鱸囊胚的培養(yǎng)花鱸親魚注射LHRH-A33-5μg/kg或HCG300-500IU/kg(均為寧波市激素制品有限公司產(chǎn)品)人工催產(chǎn)，采用干法授精，花鱸受精卵經(jīng)海水激活后于17℃培養(yǎng)8h即發(fā)育至囊胚期(1000個細胞)，挑選浮在液面的優(yōu)質(zhì)花鱸囊胚作為細胞移植受體。
供體細胞的制備供體細胞為穩(wěn)定表達GFP的LJES1細胞，將10-18代LJES1細胞轉(zhuǎn)化之前，在完全培養(yǎng)基中正常傳代至少2-3次，轉(zhuǎn)化前一天將生長狀態(tài)良好的細胞用胰蛋白酶(0.05％Trypsin+0.53mM EDTA·4Na)消化，用完全培養(yǎng)基以15×104/ml細胞接種1ml到每個12孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞70％-80％長滿，24℃過夜培養(yǎng)16-20小時。完全培養(yǎng)基配方為是由DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、15％的胎牛血清(FBS)、50mM 2-巰基乙醇(2-ME)、2.5ng/ml成纖維生長因子(bFGF)、lng/ml白血病抑制因子(LIF)、花鱸胚胎抽提液(PEE)、和1％的同種魚血清(FS)構(gòu)成，培養(yǎng)基的最終pH均為7.2-7.4。用不含血清和抗體的DMEM培養(yǎng)基將細胞洗兩遍，并換上不含血清和抗體的DMFM培養(yǎng)基，同時，將適量高質(zhì)量的線性化pCMV-EGFP質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體分別溶于不含血清和抗體的DMEM培養(yǎng)基中，然后將兩者混合，比例為4ul的Genejuice和1ug的DNA(DNA∶Genejuice＝1∶4)，形成DNA-脂質(zhì)體混合物。然后將混合物逐滴加到培養(yǎng)基表面，振動培養(yǎng)板，使其均勻分布在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6小時后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，觀察熒光的表達，并開始篩選。用胰蛋白酶(0.05％Trypsin+0.53mM EDTA·4Na)消化轉(zhuǎn)化的LJES1細胞，將細胞以1∶4的比例轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)6-8小時，細胞完全貼壁后，以含0.6ug-0.8ug/ml嘌呤霉素(puromycin)的培養(yǎng)基篩選，每5-7天換一次培養(yǎng)基，經(jīng)過3-4個星期篩選培養(yǎng)后，穩(wěn)定表達GFP的LJES1細胞形成克隆，選取熒光表達強烈的單細胞克隆，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)。以此細胞作為供體，細胞移植前1小時用1×PBS洗滌細胞，胰酶消化、離心收集細胞，加入TM溶液(100mM NaCl，5mM KCl，5mM Hepes，pH7.1)制成單細胞懸液備用。
應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體1)顯微注射針的制備顯微注射針為自行拉制的柔軟的玻璃針。采用二步拉針法(99℃和76℃)拉針，拉針儀PC-10為日本Narishige公司產(chǎn)品，用游絲鑷斷針，針尖銳利，斷面為小于30°的銳角，內(nèi)徑在15～20um(見附圖1)。
2)撥卵針的制備為自行拉制的柔軟的玻璃針，使用日本Narishige公司PC-10拉針儀，采用一步拉針法(90℃)，拉制內(nèi)徑為1.0mm的毛細玻璃管而成。
3)瓊脂凹槽的制備在90mm塑料培養(yǎng)皿中倒入2％熔化瓊脂，厚度3-5mm，膠面上放置有機玻璃莢膜，待瓊脂冷卻后取出莢膜即成。瓊脂凹槽規(guī)格60mm×1.3mm×1.3mm。
4)顯微注射顯微注射儀為Narishige公司產(chǎn)品(型號MMO-202ND)，利用負壓將供體細胞小心吸入顯微注射針內(nèi)，受體花鱸囊胚單排直線排列在特制的與胚胎直徑同寬的瓊脂凹槽(見附圖2)內(nèi)，加入少量滅菌海水浸沒胚胎。左手持自制柔軟撥卵針(見附圖3)，將囊胚的動物極撥至上方并固定囊胚，右手同時調(diào)整顯微注射儀的粗調(diào)旋鈕，使注射針接觸到囊胚，然后調(diào)節(jié)微調(diào)旋鈕，使注射針進入到受體動物極內(nèi)(見附圖4)，每個曩胚注入20～50個LJES1細胞，此步操作必須做到迅速、準確，左右手協(xié)調(diào)操作；注射后，將注射針位置調(diào)高，在囊胚即將離開液面時用撥卵針固定胚胎，同時緩緩抽出注射針，使胚胎脫離注射針，切記不能晃動，這樣即完成了細胞移植和嵌合體的制備。全部操作在Leica解剖鏡(型號MZAPO，德國)下進行。
嵌合體胚胎和魚苗的觀測和培養(yǎng)將注射后的胚胎和嵌合體于18℃無菌海水中培養(yǎng)，24小時熒光顯微鏡下(激發(fā)波長為488nm)觀察胚胎是否具有綠色熒光的表達及分布位置。表達綠色熒光的胚胎即為嵌合體，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)，孵化后的魚苗用新鮮過濾海水培養(yǎng)，每隔24小時對其進行熒光觀測；提取魚苗DNA，PCR擴增GFP基因特異片段，驗證GFP基因的整合。結(jié)果如表1所示表1.花鱸胚胎干細胞嵌合體與金鯛胚胎干細胞嵌合體的比較

嵌合部位分別在視囊、聽囊，背神經(jīng)管、卵黃囊和軀干部，涵蓋了內(nèi)、中、外三個胚層。PCR擴增的結(jié)果也證實90％以上的為陽性嵌合體。
用本方法制備的花鱸ES細胞來源的嵌合體其成功率、成活率和孵化率分別為58％、56％和79％，充分證明本發(fā)明在技術(shù)上非常適于海水魚類細胞移植和嵌合體制備。
權(quán)利要求
1.一種花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法，它的操作程序是受體-囊胚期胚胎的準備、供體細胞的制備、應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體、嵌合體胚胎和魚苗的檢測、培養(yǎng)，其特征在于所述的供體細胞的制備供體細胞為穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的花鱸胚胎干細胞LJES1，采用4ul脂質(zhì)體介導(dǎo)法將1ug線性化pCMVEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至生長狀態(tài)良好的LJES1細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化前一天，用完全培養(yǎng)基以15×104/ml細胞接種1ml到每個12孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞70％-80％長滿；轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)6小時后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光在細胞中表達，以含0.6ug-0.8ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選3-4個星期，得到穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的LJES1細胞克??；擴大培養(yǎng)，細胞移植前收集細胞，加入TM溶液，制成單細胞懸液作為細胞移植的供體；所述的應(yīng)用顯微注射技術(shù)進行細胞移植制備嵌合體進行細胞移植和嵌合體的制備使用顯微注射方法；用長而相對柔軟的撥卵針，撥動單排直線排列在特制的瓊脂凹槽中的受體囊胚，使動物極移至上方；同時用顯微注射針吸取上述20-50個供體細胞注射到受體囊胚中，全部操作在解剖鏡下進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法，其特征在于所述的撥卵針為自行拉制的柔軟的玻璃針，使用日本Narishige公司PC-10拉針儀，采用一步拉針法，溫度為90℃，拉制內(nèi)徑為1.0mm的毛細玻璃管而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法，其特征在于所述的瓊脂凹槽在90mm塑料培養(yǎng)皿中倒入2％熔化瓊脂，厚度3-5mm，膠面上放置在有機玻璃莢膜，待瓊脂冷卻后取出莢膜即成；瓊脂凹槽規(guī)格60mm×1-1.5mm×1-1.5mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法，其特征在于所述的顯微注射針顯微注射針為自行拉制，使用日本Narishige公司PC-10拉針儀，采用兩步拉針法，溫度99℃和76℃，拉制內(nèi)徑為1.0mm的毛細玻璃管，用游絲鑷斷針，使針尖銳利，斷面為小于30°的銳角，內(nèi)徑在15-20um。
全文摘要
一種花鱸胚胎干細胞移植制備嵌合體的方法，其操作程序是花鱸囊胚(約1000個細胞)作受體、以穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(GFP)的花鱸胚胎干細胞(LJES1細胞)為供體，通過顯微注射方法將20－50個供體細胞移植到受體囊胚中，無菌海水培養(yǎng)移植胚胎，孵化魚苗用新鮮海水培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長488nm)觀察到表達GFP的胚胎和魚苗即為嵌合體。應(yīng)用本方法制備的嵌合體其成功率、成活率和孵化率分別為58％、56％和79％，明顯高于受體具有相同特性的金鯛的44％、43％和42％，充分證明本發(fā)明在技術(shù)上更適于海水魚類細胞移植和嵌合體制備，具有更強的實用性。
文檔編號C12N5/16GK1769429SQ20051004473
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者沙珍霞, 陳松林, 劉洋, 葉寒青, 田永勝 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所