專利名稱：仙人掌內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。
背景技術(shù)：
仙人掌(Opuntia)在中國作為藥用植物具有悠久的歷史，仙人掌含有有機酸、甾醇、生物堿、黃酮和萜類等成分，具有抑菌、消炎、鎮(zhèn)痛、降血糖等多種藥理作用及多種臨床用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離自中國云南省元江縣元江仙人掌(Opuntiaficusindica Mill.)植物活體中且其發(fā)酵產(chǎn)物具有較強的抑菌活性的微生物----仙人掌內(nèi)生真菌。
本發(fā)明所述的仙人掌內(nèi)生真菌命名為土生曲霉云南變種YM39661(Aspergillus terreus var.yunnanensis nov.var YM39661)，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM 205132。
本發(fā)明所述的仙人掌內(nèi)生真菌系從中國云南省元江縣元江仙人掌(Opuntiaficusindica Mill.)植物活體中分離獲得的?，F(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2005年10月31日，保藏編號為M 205132。
本發(fā)明所述的微生物菌種經(jīng)形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征以及分子生物學18SrDNA基因序列分析，確認其分類學地位屬于土生曲霉的一個新變種，命名為土生曲霉云南變種YM39661(Aspergillus terreus var.yunnanensis nov.varYM39661)。
土生曲霉云南變種YM39661形態(tài)特征與土生曲霉較為相似，但其顯微形態(tài)表明分生孢子梗壁上有很明顯的瘤狀突起，這與土生曲霉的模式菌株及其它記載的變種土生曲霉原變種(A.terreus var.terreus)和土生曲霉金色變種(A.terreusvar.aureus)都存在明顯區(qū)別。因此，該菌株為土生曲霉的一新變種。
以18SrDNA基因序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建形成包括菌株YM39661在內(nèi)的相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果看出，YM39661與土生曲霉(Aspergillus terreus)的18SrDNA序列同源性達到99.7％，有3個堿基的差異。
YM39661的培養(yǎng)基培養(yǎng)特征(圖1、2、3)在查氏瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)7d后，菌落直徑達2.5cm，質(zhì)地致密，菌落平坦，中央部分有白色凸起，分生孢子結(jié)構(gòu)較多，初為淺黃色，老后變深呈黃褐色，菌落反面暗黃色，較淡。
在PDA瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)7d后，菌落直徑達3.8cm，10d達5.0cm，質(zhì)地較薄，中央有凸起，開始有少量同心環(huán)，中央為淡黃色，四周近白色，老后菌落呈土褐色，氣生菌絲較少，背面淡黃色至黃褐色。
在麥芽汁培養(yǎng)基上28℃7d菌落直徑達3.5cm，10天4.5cm，質(zhì)地致密略呈絮狀，菌落較薄，中央部分稍凸起，氣生菌絲少，反面近無色。
YM39661內(nèi)生真菌的形態(tài)特征(圖4、5、6)①無性世代菌絲無色有隔膜。分生孢子梗較長，具有足細胞；分生孢子梗頂端膨大成近球形，頂囊較小，半球形，直徑6-15μm。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子?；?-7μm×2-3μm，瓶形小梗2.7-5.5×1.2-2.0μm；分生孢子頭致密，直柱狀，顏色土黃略顯橙褐色，直徑30-110μm×25-50μm；分生孢子球形，大小約2μm，壁光滑。
另外，在光學鏡下分生孢子梗壁平滑，掃描電鏡下有明顯較密的瘤狀突起，透射電鏡顯示分生孢子梗外壁粗糙。
②有性世代 未發(fā)現(xiàn)。
YM39661內(nèi)生真菌的分子生物學特征采用分子生物學PCR技術(shù)，DNA測序分析，YM39661內(nèi)生真菌18SrDNA基因組由1800個堿基組成。該系列由國際NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫注冊(Accession number是DQ173743)。內(nèi)生真菌YM39661的DNA序列與GenBank中相關(guān)序列比對了1078個堿基，同源性為高于99％。以18SrDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株YM39661與土生曲霉Aspergillus terreus的進化距離最近(圖7)。
YM39661內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)基液體PDA培養(yǎng)基。
培養(yǎng)溫度30℃±2℃。
發(fā)酵時間5-7天。
發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，菌體為少量黃色的細粉末；培養(yǎng)第3天，黃色的細粉末減少，出現(xiàn)黃色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，黃色的細粉末逐漸減少，黃色菌絲球繼續(xù)增多，并且體積變大，發(fā)酵液為橙黃色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量黃色的菌絲球，體積也變大，發(fā)酵液為橙黃色。
YM39661內(nèi)生真菌的發(fā)酵工藝如下菌種→活化→一級種子(固體PDA)→培養(yǎng)(28℃±2℃，3-4天)→接種(接種針一環(huán))→二級種子(液體PDA)→培養(yǎng)(搖床rpm200轉(zhuǎn)/分，28℃±5℃，4-5天)→接種(接種量5％)→發(fā)酵(500毫升玻璃瓶，28℃±5℃，12-15天)→發(fā)酵物。
上述發(fā)酵工藝中，編號YM39661菌種的發(fā)酵條件如下(1)發(fā)酵方式液體發(fā)酵。
(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)。
馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過濾棄馬鈴薯，濾夜加水補足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然(即不對其進行限制，以下相同)。
上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中加入瓊脂15克，即為固體PDA培養(yǎng)基。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基為液體PDA培養(yǎng)基，PH自然。
(4)培養(yǎng)時間菌種活化培養(yǎng)48-72小時，種子搖床培養(yǎng)時間72-96小時，發(fā)酵培養(yǎng)時間5-7天。
(5)培養(yǎng)溫度種子培養(yǎng)溫度28℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃±2℃。
(6)發(fā)酵完畢，發(fā)酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，取發(fā)酵液加入等體積95％(重量百分比)乙醇，浸提48小時后濃縮至干，加入無菌水制成發(fā)酵液樣品，即為抗菌發(fā)酵液。
本發(fā)明首次對仙人掌植物內(nèi)生真菌進行分離，并明確了具有廣譜抗菌活性的土生曲霉云南變種(YM39661)菌株的微生物學地位，同時發(fā)現(xiàn)該菌對16種細菌、3種植物病原真菌以及2種人類皮膚致病真菌具有較為明顯的抑制生長作用。目的是利用植物內(nèi)生真菌資源，以求獲得抗人類疾病新型抗生素類天然藥用成分。
本發(fā)明所述的仙人掌內(nèi)生真菌YM39661抗菌試驗1、病原細菌革蘭氏陽性細菌11種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)；蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)；甲型溶血鏈球菌(Streptococcus hemolyticus)；乙型溶血鏈球菌(Streptococcus hemolyticus)；恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；藤黃八疊球菌(Sardinelutea)。
革蘭氏陰性細菌5種大腸桿菌(Escherichia coli)；普通變形桿菌(Pratevulgaris)；銅綠色假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)；傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)；宋內(nèi)氏痢疾桿菌(Shigella sonnei)。
2、病原真菌皮膚致病真菌2種白色念珠菌(Candida albicans)；石膏樣小孢子菌(Microphyton gypseum)。
植物病原真菌3種灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；棒束孢(Isaria sp.)和玉蜀黍離蠕孢(Bipolaris maydis)。
3、內(nèi)生真菌的培養(yǎng)將仙人掌內(nèi)生真菌Ym39661接入25mL三角瓶中(裝有7mL PDA液體培養(yǎng)基)，置于(28±2)℃搖床上(200r/min)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5d，無菌條件下過濾除去菌絲體，取發(fā)酵液加入7mL 95％的乙醇，浸提48小時后濃縮至干，加入少量無菌水制成發(fā)酵液樣品備用。
4、病原微生物的培養(yǎng)取病原菌的新鮮斜面培養(yǎng)物分別接入少許無菌水，用接種環(huán)攪拌稀釋后制成菌懸液。
5、杯碟法測定抗菌活性細菌用吸管吸0.2mL指示細菌菌懸液于培養(yǎng)皿中，倒入約40-50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，混勻，培養(yǎng)基凝固后表面放入牛津杯，每個牛津杯中加入200μL內(nèi)生真菌發(fā)酵液樣品，置于37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑的大小(詳見附表)。
真菌用吸管吸0.2mL指示真菌菌懸液于倒好培養(yǎng)基的平板上，用無菌涂布棒涂勻，放入牛津杯，每個牛津杯中加入200μL內(nèi)生真菌發(fā)酵液樣品，置于28℃培養(yǎng)48h，測量抑菌圈直徑的大小(詳見附表)。
附表本發(fā)明所述的菌株YM39661對21種病原微生物的抗菌結(jié)果



圖1為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661的菌落圖片(PDA培養(yǎng)基)。
圖2為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661的菌落圖片(麥芽汁培養(yǎng)基)。
圖3為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661的菌落圖片(查氏培養(yǎng)基)。
圖4為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661顯微圖。
圖5為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661掃描電鏡圖。
圖6為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661投射電鏡圖。
圖7為本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
具體實施例方式
土生曲霉云南變種YM39661(Aspergillus terreus var.yunnanensis nov.var YM39661)菌株，是發(fā)酵獲得抗人類疾病新型抗生素類藥用成分的天然微生物藥源。
取YM39661菌種，在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺)，用接種針挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)72-96小時，備用。取出活化后的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的一級種子液體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±2℃下培養(yǎng)72-96小時，即為YM34161一級種子。
采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘備用。取YM39661菌株一級種子，在無菌條件下，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中(接種量按7-10％(v/v)計)。置30℃±2℃搖床(200r/min)培養(yǎng)96-120小時，期間注意檢查有無染菌現(xiàn)象。
發(fā)酵完畢，無菌條件下過濾發(fā)酵液，除去菌絲體，取發(fā)酵液加入等體積95％乙醇，浸提48小時后濃縮至干，加入無菌水即制成抗菌發(fā)酵液樣品。
本發(fā)明所述的土生曲霉云南變種YM39661 18SrDNA基因組由1800個堿基(bp)組成，系列如下1 gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg61 ggaggtagtg acaataaata ctgatacggg gctctttcgg gtctcgtaat tggaatgagt121 acaatctaaa tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg181 taattccagc tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac241 cttgggtctg gctggccggt ccgcctcacc gcgagtactg gtccggctgg acctttcctt301 ctggggaatc ccatggcctt cactggctgt ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa361 gaaaccatgc tcggctctgt gatcatatac tacgatgcat gccttggcga cgatgtcatc421 atttctgccc atcacttcga tccggagagg gagctgagaa cgctaccaca tccaaggaag481 gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg tagtgacaat aaatactgat541 acggggctct ttcgggtctc gtaattggaa tgagtacaat ctaaatccct taacgaggaa601 caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat661 taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg gtctggctgg ccggtccggt721 ctggctggcc ggtccgcctc accgcgagta ctggtccggc tggacctttc cttctgggga781 atcccatggc cttcactggc tgtgggggga accaggactt ttactgtgaa aaaattagag841 tgttcaaagc aggcctttgc tcgaatacat tagcatggaa taatagaata ggacgtgcgg
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權(quán)利要求
1.一種仙人掌內(nèi)生真菌，其特征是命名為土生曲霉云南變種YM39661Aspergillus terreus var.yunnanensis nov.var YM39661，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM 205132。
2.按照權(quán)利要求1所述的仙人掌內(nèi)生真菌，其特征是其18SrDNA基因組由1800個堿基組成，系列如下1 gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg61 ggaggtagtg acaataaata ctgatacggg gctctttcgg gtctcgtaat tggaatgagt121 acaatctaaa tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg181 taattccagc tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac241 cttgggtctg gctggccggt ccgcctcacc gcgagtactg gtccggctgg acctttcctt301 ctggggaatc ccatggcctt cactggctgt ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa361 gaaaccatgc tcggctctgt gatcatatac tacgatgcat gccttggcga cgatgtcatc421 atttctgccc atcacttcga tccggagagg gagctgagaa cgctaccaca tccaaggaag481 gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg tagtgacaat aaatactgat541 acggggctct ttcgggtctc gtaattggaa tgagtacaat ctaaatccct taacgaggaa601 caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat661 taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg gtctggctgg ccggtccggt721 ctggctggcc ggtccgcctc accgcgagta ctggtccggc tggacctttc cttctgggga781 atcccatggc cttcactggc tgtgggggga accaggactt ttactgtgaa aaaattagag841 tgttcaaagc aggcctttgc tcgaatacat tagcatggaa taatagaata ggacgtgcgg901 ttctattttg ttggtttcta ggaccgccgt aatgattaat agggatagtc gggggcgtca961 gtattcagct gtcagaggtg aaattcttgg atttgctgaa gactaactac tgcgaaagca1021 ttcgccaagg atgttttcat taatcaggga acgaaagtta ggggatcgaa gacgatcaga1081 taccgtcgta gtcttaacca taaactatgc cgactaggga tcgggcggtg tttctatgat1141 gacccgctcg gcaccttacg agaaatcaaa gtttttgggt tctgggggga gtatggtcgc1201 aaggctgaaa cttaaagaaa ttgacggaag ggcaccacaa ggcgtggagc ctgcggctta1261 atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacaaa ataaggattg acagattgag1321 agctctttct tgatcttttg gatggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt1381 gtctgcttaa ttgcgataac gaacgagacc tcggccctta aatagcccgg tccgcatttg1441 cgggccgctg gcttcttagg gggactatcg gctcaagccg atggaagtgc gcggcaataa1501 caggtctgtg atgcccttag atgttctggg ccgcacgcgc gctacactga cagggccagc1561 gagtacatca ccttggccga gaggtctggg taatcttgtt aaaccctgtc gtgctgggga1621 tagagcattg caattattgc tcttcaacga ggaatgccta gtaggcacga gtcatcagct1681 cgtgccgatt acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctactacc gattgaatgg1741 ctcggtgagg ccttcggact ggctccaggg ggttggcaac gaccccccag agccgaaagt。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。本發(fā)明所述的仙人掌內(nèi)生真菌命名為土生曲霉云南變種YM39661(Aspergillus terreus var.yunnanensis nov.var YM39661)，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM 205132。本發(fā)明首次對仙人掌植物內(nèi)生真菌進行分離，并明確了具有廣譜抗菌活性的土生曲霉云南變種(YM39661)菌株的微生物學地位，同時發(fā)現(xiàn)該菌對16種細菌、3種植物病原真菌以及2種人類皮膚致病真菌具有較為明顯的抑制生長作用。目的是利用植物內(nèi)生真菌資源，以求獲得抗人類疾病新型抗生素類天然藥用成分。
文檔編號C12N15/31GK1966667SQ20051004862
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者陳有為, 秦盛, 張琦, 李治瀅, 楊麗源, 吳少華, 李紹蘭 申請人:云南省微生物研究所