專利名稱：納米固定化酶體外定向生產(chǎn)tf2a粗提物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)茶黃素-3-沒食子酸酯的方法。
背景技術(shù)：
茶黃素是茶色素中生物學(xué)活性較強(qiáng)的物質(zhì)，其保健功效、提取和分離技術(shù)等受到中外學(xué)者的高度重視。實(shí)驗(yàn)證明，茶黃素具有高抗癌、抗心腦血管疾病、抗菌、抗病毒等多種活性，其作用效果明顯優(yōu)于茶多酚、茶色素。茶黃素被廣泛認(rèn)定為茶葉中活性利用潛力最大的物質(zhì)之一，而其含量低、難于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)是當(dāng)前存在的主要難題。茶黃素中含有多種單體，由于單體間的結(jié)構(gòu)差異，每種單體的生物學(xué)活性也不同。從紅茶中提取的茶黃素粗提物，其各茶黃素單體的含量較平均，目前有針對(duì)性的定向生產(chǎn)以某種茶黃素單體為主要成分的茶黃素混合物的技術(shù)未見相關(guān)專利和報(bào)道。茶黃素-3-沒食子酸酯，簡(jiǎn)稱TF2A(theaflavin-3-gallate)是活性較強(qiáng)的茶黃素單體，具有強(qiáng)的抗氧化活性及其他生物學(xué)活性；制備以TF2A為主體的茶黃素混合物具有良好的應(yīng)用前景。
體外酶促氧化制取茶黃素，是利用多酚氧化酶的氧化特性有目的地定向生產(chǎn)茶黃素。納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末誕生的新興技術(shù)，其廣泛的應(yīng)用推動(dòng)了傳統(tǒng)生物學(xué)研究進(jìn)入全新發(fā)展階段。2002年《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊》報(bào)道，美國(guó)西北太平洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的研究人員成功利用納米材料將酶固定化，而且能夠同時(shí)保留它的活性、穩(wěn)定性，這頂成就為納米材料酶學(xué)應(yīng)用開啟了可能性，也為酶固定化帶來了技術(shù)突破。至今，納米材料在茶多酚氧化酶固定化方面的應(yīng)用未見相關(guān)專利和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上研究中的空白，本發(fā)明提供了一種工藝簡(jiǎn)單，能提供高含量的TF2A的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)茶黃素-3-沒食子酸酯(TF2A)粗提物的方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的提供一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，包括首先制備茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力為0.32～0.34，此方法還依次進(jìn)行以下步驟1)、納米固定化酶制備按照0.70～0.75g/70～75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入納米碳酸鈣粉末，在2～8℃下攪拌1.5～2小時(shí)；將上述混和物全部放入離心容器中，3500～4500轉(zhuǎn)，2～8℃離心15～20分鐘，棄上清；再用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌2～3次，所得沉淀物即為納米固定化酶；2)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液配制成濃度為0.4～0.6mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)所述溶液的pH至4.9～5.1，形成茶多酚溶液；將上述步驟1)中所得的納米固定化酶按照重量體積比為0.008～0.012g/0.8～1.2ml的比例懸浮于pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中，充分?jǐn)嚢枋蛊鋺腋【鶆?，形成納米固定化酶懸浮液；在所述茶多酚溶液中加入納米固定化酶懸浮液形成混合液，所述納米固定化酶懸浮液與茶多酚溶液的體積比0.25～0.3/3.8～4.2；將所述混合液于35-38℃的溫度下，加熱10～12分鐘；將上述加熱后的混合液倒入離心容器，7500～8500轉(zhuǎn)2～8℃離心15～20分鐘，收集上清液，進(jìn)行萃取、真空干燥。
作為本發(fā)明的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法的一種改進(jìn)步驟2)的萃取步驟中，使用的乙酸乙酯體積為所述上清液體積1/4～1/6，然后收集乙酸乙酯層；真空干燥步驟中，干燥溫度為35～45℃。
作為本發(fā)明的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)納米碳酸鈣粉末的顆粒大小為70nm、形狀為紡錘狀。
作為本發(fā)明的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)首先制備茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力為0.34，再依次進(jìn)行以下步驟1)、納米固定化酶制備按照0.75g/75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入納米碳酸鈣粉末，在4℃下攪拌2小時(shí)；將上述混和物全部放入離心容器中，4000轉(zhuǎn)，4℃離心15分鐘，棄上清；再用pH為5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌3次，所得沉淀物即為納米固定化酶；2)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％，表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液配制成濃度為0.5mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，形成茶多酚溶液；所述體積比為0.3/4.0的納米固定化酶懸浮液與茶多酚溶液所形成的混合液于37℃的溫度下，加熱10分鐘；將上述加熱后的混合液倒入離心容器，8000轉(zhuǎn)4℃離心15分鐘，收集上清液，使用體積為上清液體積1/5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取、真空干燥。
本發(fā)明的方法制備而成的茶黃素混合物，四種主要茶黃素單體TF1(theaflavin)，TF2A，TF2B(theaflavin-39-gallate)，TF3(theaflavin-3，39-digallate)的總含量較高；其中TF2A含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。具體的方法及數(shù)據(jù)如下用重蒸水準(zhǔn)確配制TF1，TF2A，TF2B，TF3濃度各為0.1mg/ml的茶黃素單體標(biāo)樣溶液和濃度為0.4mg/ml的本方法制備的茶黃素溶液，進(jìn)行HPLC分析。
HPLC分析條件ODS C-18柱，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl，流動(dòng)相A泵水-乙睛-乙酸96.5-3-0.5(v/v/v)，B泵水-乙睛-乙酸69.5-30-0.5(v/v/v)；線性梯度洗脫，0-55min為0-100％B；55-60min為100％A。
計(jì)算公式為 測(cè)得本發(fā)明的方法生產(chǎn)的茶黃素混合液中四種主要茶黃素單體的濃度之和為64.5％，TF2A含量為43.3％。
用本發(fā)明的制備方法，納米固定化酶的制備方法簡(jiǎn)單，氧化后易回收，所用材料成本低；氧化條件簡(jiǎn)單，氧化時(shí)間短；制備的產(chǎn)品具有良好的定向性，含量較高。


圖1是茶黃素-3-沒食子酸酯，即TF2A的結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其制備步驟如下1)、制備茶多酚氧化酶粗提液制備方法見鐘蘿著《茶葉品質(zhì)理化分析》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989年出版)，通過調(diào)整濃度來調(diào)節(jié)酶溶液的酶活力(測(cè)定方法見黃意歡著《茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，北京農(nóng)業(yè)出版社，1995年出版)(以下酶活力數(shù)值用吸光度表示)，使粗提液中酶活力達(dá)到0.32。具體操作步驟為，稱洗凈茶鮮葉100.00g，置于組織搗碎機(jī)內(nèi)，加入800ml冷丙酮，20g聚乙烯吡咯烷酮，搗碎5min，或用研缽快速磨成漿，然后抽濾，濾渣用80％冷丙酮反復(fù)淋洗，洗至濾出液無色為止。所得的濾渣即丙酮粉，置冰箱備用。將丙酮粉置于研缽中，加入1∶3(重量體積比)的pH5.6檸檬酸緩沖液和少量石英砂，在冰上研磨勻漿20min，然后用積壓法和抽濾得粗酶液，4000rpm離心15min，得清酶液，調(diào)至一定體積，進(jìn)行活性測(cè)定。取酶液1ml，加反應(yīng)混合液3ml[反應(yīng)混合液按pH5.6檸檬酸-磷酸緩沖液0.1％脯氨酸1％鄰苯二酚(10∶2∶3)配制]于離心管中，在37℃下溫浴10min，立即加6mol/L尿素溶液3ml，終止反應(yīng)，4000rpm離心10min，取上清夜，在460nm處比色?？瞻讓?duì)照反應(yīng)液中的鄰苯二酚用緩沖液代替，其他條件相同。酶活性計(jì)算公式進(jìn)行了改進(jìn)，具體為 式中E460反應(yīng)終止時(shí)以空白為對(duì)照在460nm處的吸光度；t反應(yīng)時(shí)間(min)。
2)、納米固定化酶制備按照每72ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.70g納米CaCO3粉末的比例，將茶多酚氧化酶粗提液和納米CaCO3粉末混合后，在2℃下攪拌1.5小時(shí)；將所得的混合物全部放入離心管中，3500轉(zhuǎn)，4℃離心15分鐘，棄上清。再用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌3次，得到的沉淀即為納米固定化酶。選用的納米碳酸鈣粉末的顆粒大小為70nm、形狀為紡錘狀。
3)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液加入0.4mg上述茶多酚的比例，將上述茶多酚和上述檸檬酸磷酸緩沖液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)此溶液pH至4.9，形成茶多酚溶液。將步驟2)中所得的納米固定化酶按照重量體積比為0.008g/1ml的比例懸浮于pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中(即每1ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中放入0.008g的納米固定化酶)，充分?jǐn)嚢枋蛊鋺腋【鶆?，形成納米固定化酶懸浮液。按照0.25/3.8(納米固定化酶懸浮液/茶多酚溶液的體積比)的比例在茶多酚溶液中加入納米固定化酶懸浮液，形成混合液；將此混合液倒入燒杯，放于35℃水浴鍋中加熱12分鐘，然后取出，倒入離心管，7500轉(zhuǎn)，8℃離心15分鐘；收集上清液，將上清液倒入分液漏斗中，加入體積為上清液體積1/5的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯層，45℃真空干燥，得亮黃色粉末，即為主要成分為TF2A的茶黃素粗提物。
用此種方法制備的茶黃素混合物，四種茶黃素單體的濃度之和為67％，TF2A含量為48％。
實(shí)施例2一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其制備步驟如下1)、制備茶多酚氧化酶粗提液如實(shí)施例1所述的方法制作茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力達(dá)到0.34。
2)、納米固定化酶制備按照每75ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.73g納米CaCO3粉末的比例，將茶多酚氧化酶粗提液和納米CaCO3粉末混合后，在8℃下攪拌2小時(shí)；將所得的混合物全部放入離心管中，4000轉(zhuǎn)，2℃離心20分鐘，棄上清。再用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌2次，得到的沉淀即為納米固定化酶。選用的納米碳酸鈣粉末的顆粒大小為70nm、形狀為紡錘狀。
3)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液加入0.6mg上述茶多酚的比例，將上述茶多酚和上述檸檬酸磷酸緩沖液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)此溶液pH至5.1，形成茶多酚溶液。將步驟2)中所得的納米固定化酶按照重量體積比為0.01g/1.2ml的比例懸浮于pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中(即每1.2ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中放入0.01g的納米固定化酶)，充分?jǐn)嚢枋蛊鋺腋【鶆颍纬杉{米固定化酶懸浮液。按照0.3/4.2(納米固定化酶懸浮液/茶多酚溶液的體積比)的比例在茶多酚溶液中加入納米固定化酶懸浮液，形成混合液；將此混合液倒入燒杯，放于37℃水浴鍋中加熱11分鐘，然后取出，倒入離心管，8000轉(zhuǎn)，2℃離心15分鐘；收集上清液，將上清液倒入分液漏斗中，加入體積為上清液體積1/6的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯層，40℃真空干燥，得亮黃色粉末，即為主要成分為TF2A的茶黃素粗提物。
用此種方法制備的茶黃素混合物，四種茶黃素單體的濃度之和為65.9％，TF2A含量為47％。
實(shí)施例3一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其制備步驟如下1)、制備茶多酚氧化酶粗提液如實(shí)施例1所述的方法制作茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力達(dá)到0.33。
2)、納米固定化酶制備按照每74ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.75g納米CaCO3粉末的比例，將茶多酚氧化酶粗提液和納米CaCO3粉末混合后，在4℃下攪拌1.8小時(shí)；將所得的混合物全部放入離心管中，4500轉(zhuǎn)，8℃離心18分鐘，棄上清。再用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌3次，得到的沉淀即為納米固定化酶。選用的納米碳酸鈣粉末的顆粒大小為70nm、形狀為紡錘狀。
3)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液加入0.5mg上述茶多酚的比例，將上述茶多酚和上述檸檬酸磷酸緩沖液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)此溶液pH至5.0，形成茶多酚溶液。將步驟2)中所得的納米固定化酶按照重量體積比為0.012g/0.8ml的比例懸浮于pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中(即每0.8ml的pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中放入0.012g的納米固定化酶)，充分?jǐn)嚢枋蛊鋺腋【鶆?，形成納米固定化酶懸浮液。按照0.28/4.0(納米固定化酶懸浮液/茶多酚溶液的體積比)的比例在茶多酚溶液中加入納米固定化酶懸浮液，形成混合液；將此混合液倒入燒杯，放于38℃水浴鍋中加熱10分鐘，然后取出，倒入離心管，8500轉(zhuǎn)，4℃離心20分鐘；收集上清液，將上清液倒入分液漏斗中，加入體積為上清液體積1/4的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯層，35℃真空干燥，得亮黃色粉末，即為主要成分為TF2A的茶黃素粗提物。
用此種方法制備的茶黃素混合物，四種茶黃素單體的濃度之和為66.8％，TF2A含量為46.3％。
以上所述僅為本發(fā)明的若干個(gè)實(shí)施案例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講，還可以作出許多變型和改進(jìn)，例如攪拌時(shí)間，所有變型及改進(jìn)均應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，包括首先制備茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力為0.32～0.34，其特征在于所述方法還依次進(jìn)行以下步驟1)、納米固定化酶制備按照0.70～0.75g/70～75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入納米碳酸鈣粉末，在2～8℃下攪拌1.5～2小時(shí)；將上述混和物全部放入離心容器中，3500～4500轉(zhuǎn)，2～8℃離心15～20分鐘，棄上清；再用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌2～3次，所得沉淀物即為納米固定化酶；2)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液配制成濃度為0.4～0.6mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)所述溶液的pH至4.9～5.1，形成茶多酚溶液；將上述步驟1)中所得的納米固定化酶按照重量體積比為0.008～0.012g/0.8～1.2ml的比例懸浮于pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液中，充分?jǐn)嚢枋蛊鋺腋【鶆?，形成納米固定化酶懸浮液；在所述茶多酚溶液中加入納米固定化酶懸浮液形成混合液，所述納米固定化酶懸浮液與茶多酚溶液的體積比0.25～0.3/3.8～4.2；將所述混合液于35-38℃的溫度下，加熱10～12分鐘；將上述加熱后的混合液倒入離心容器，7500～8500轉(zhuǎn)2～8℃離心15～20分鐘，收集上清液，進(jìn)行萃取、真空干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其特征在于所述步驟2)的萃取步驟中，使用的乙酸乙酯體積為所述上清液體積1/4～1/6，然后收集乙酸乙酯層；所述真空干燥步驟中，干燥溫度為35～45℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其特征在于所述納米碳酸鈣粉末的顆粒大小為70nm、形狀為紡錘狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，其特征在于首先制備茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力為0.34，再依次進(jìn)行以下步驟1)、納米固定化酶制備按照0.75g/75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入納米碳酸鈣粉末，在4℃下攪拌2小時(shí)；將上述混和物全部放入離心容器中，4000轉(zhuǎn)，4℃離心15分鐘，棄上清；再用pH為5.6的檸檬酸磷酸緩沖液洗滌3次，所得沉淀物即為納米固定化酶；2)、茶多酚的定向氧化取兒茶素含量大于98％，表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的檸檬酸磷酸緩沖液配制成濃度為0.5mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，形成茶多酚溶液；所述體積比為0.3/4.0的納米固定化酶懸浮液與茶多酚溶液所形成的混合液于37℃的溫度下，加熱10分鐘；將上述加熱后的混合液倒入離心容器，8000轉(zhuǎn)4℃離心15分鐘，收集上清液，使用體積為所述上清液體積1/5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取、真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米固定化酶體外定向生產(chǎn)TF2A粗提物的方法，首先制備茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力為0.32～0.34；再依次進(jìn)行納米固定化酶制備和茶多酚的定向氧化這兩大步驟。測(cè)得本發(fā)明的方法生產(chǎn)的茶黃素混合液中四種主要茶黃素單體的濃度之和為64.5％，TF2A含量為43.3％。本發(fā)明的制備方法中，納米固定化酶的制備方法簡(jiǎn)單，氧化后易回收，所用材料成本低；氧化條件簡(jiǎn)單，氧化時(shí)間短；制備的產(chǎn)品具有良好的定向性，含量較高。
文檔編號(hào)C12P17/06GK1737135SQ200510050900
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者沈生榮, 丁兆堂, 于海寧 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)