專利名稱：脂聯(lián)素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達(dá)載體及構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達(dá)載體及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，患病人數(shù)正隨著生活水平的提高、人口老齡化，以及診斷技術(shù)的進(jìn)步而迅速增加。近年的研究表明胰島素抵抗和胰島素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改變，二者相互作用，最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。不僅如此，胰島素抵抗還參與了糖尿病慢性并發(fā)癥如心血管并發(fā)癥、糖尿病腎病等的發(fā)生、發(fā)展，是聯(lián)系糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病的一個(gè)重要樞紐。因此針對(duì)2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制，采用有效的藥物減輕胰島素抵抗、增加胰島素分泌對(duì)于2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療具有重要的意義。在目前尚無(wú)有效的藥物能同時(shí)針對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)方面既胰島素抵抗和胰島素分泌不足進(jìn)行治療。盡管已經(jīng)有胰島素增敏劑如噻唑烷二酮類藥物和許多種類的口服降糖藥物在臨床上應(yīng)用，但這些藥物主要是針對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的某一方面(單純針對(duì)胰島素抵抗或胰島素分泌不足或作用于糖吸收或代謝的某一環(huán)節(jié))進(jìn)行治療，而且它們分別改善胰島素抵抗、促進(jìn)胰島素分泌、降低血糖的能力并不盡如人意，長(zhǎng)期應(yīng)用作用會(huì)逐漸降低，同時(shí)這些藥物所具有的副作用，也極大地限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。即使是胰島素，也因?yàn)橐葝u素抵抗的存在降糖作用大大降低，大劑量應(yīng)用胰島素還可能加重糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)展。鑒于此，國(guó)際上正在積極地尋找新的改善胰島素抵抗、促進(jìn)胰島素分泌的藥物，以期能更有效、安全地治療2型糖尿病。
脂聯(lián)素(Adiponectin)是近年發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞分泌的特異性蛋白，其分泌異常在胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，血清脂聯(lián)素濃度可以預(yù)測(cè)個(gè)體將來(lái)發(fā)生的胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。2型糖尿病患者血漿脂聯(lián)素水平明顯下降，前瞻性縱向研究表明，基礎(chǔ)血漿脂聯(lián)素濃度是2型糖尿病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，高濃度的血漿脂聯(lián)素提示有較小的2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，在以后要發(fā)展為2型糖尿病的個(gè)體，其血漿脂聯(lián)素濃度顯著低于對(duì)照組，2型糖尿病發(fā)病后仍持續(xù)下降，并與胰島素的敏感性下降相平行。脂聯(lián)素基因可能是2型糖尿病的易感基因，脂聯(lián)素基因缺乏的純合子小鼠(Adipo-/-小鼠)表現(xiàn)出中度的胰島素抵抗和糖耐量異常。這些研究表明脂聯(lián)素產(chǎn)生的異常參與了胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，而用重組脂聯(lián)素對(duì)糖尿病和胰島素抵抗動(dòng)物治療后可顯著改善胰島素抵抗，降低血糖。脂聯(lián)素不刺激胰島素分泌，但增強(qiáng)胰島素對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖生成的抑制，使亞生理濃度的胰島素同樣能抑制肝糖輸出。脂聯(lián)素還可降低高脂高蔗糖喂養(yǎng)的小鼠循環(huán)游離脂肪酸和甘油三酯水平，減輕小鼠體重，增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)游離脂肪酸的攝取、氧化和能量消耗，使骨骼肌甘油三酯含量降低，從而增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，增加胰島素敏感性。脂聯(lián)素除了可改善胰島素抵抗，參與調(diào)節(jié)糖、脂代謝外，還拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成。低水平的血漿脂聯(lián)素是糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。此外，伴糖尿病性視網(wǎng)膜病變的2型糖尿病患者的血漿脂聯(lián)素濃度顯著低于不伴視網(wǎng)膜病變的2型糖尿病患者，提示脂聯(lián)素產(chǎn)生的減少也可能參與了糖尿病微血管病變的發(fā)生、發(fā)展。
總之，脂聯(lián)素具有降糖、降脂，增加胰島素敏感性的作用，同時(shí)可拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成，不會(huì)使體重增加，在人體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素抵抗的存在，而且脂聯(lián)素是機(jī)體自身產(chǎn)生的蛋白，對(duì)人體幾乎沒(méi)有副作用，因此脂聯(lián)素有可能成為治療糖尿病的一類新藥，國(guó)際上正在積極地對(duì)其進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)。人脂聯(lián)素共244個(gè)氨基酸，從N-端到C-端依次為信號(hào)序列(1-18aa)，非螺旋區(qū)(19-41aa)，22個(gè)膠原重復(fù)序列(42-107aa)，C-端球狀域(即脂聯(lián)素球狀域，108-244aa)，脂聯(lián)素球狀域?yàn)槠涔δ苡颉Ｓ醒芯空哂靡鹊鞍酌噶呀馊L(zhǎng)的脂聯(lián)素得到含脂聯(lián)素球狀域的片斷，其活性遠(yuǎn)大于全長(zhǎng)的脂聯(lián)素。研究表明，細(xì)菌表達(dá)的脂聯(lián)素球狀域具有很好的生物活性，這為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)脂聯(lián)素提供了有利的條件。
胰升糖素樣肽-1(Glucagons-like Peptide-1，GLP-1)是胰島α細(xì)胞和腸粘膜L細(xì)胞分泌的一種激素，胰島α細(xì)胞和腸粘膜L細(xì)胞先產(chǎn)生胰升糖素原，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)水解成為具有生物活性的GLP-1(7-37)，其中一部分分子C-端的一個(gè)氨基酸被分解，余端被酰胺化為具有生物活性的GLP-1(7-36)酰胺。在體內(nèi)80％的GLP-1以GLP-1(7-36)酰胺的形式存在，少量以GLP-1(7-37)的形式存在，但兩者的生理活性相同。GLP-1的活性域位于N-端，可與胰島β細(xì)胞上的GLP-1受體結(jié)合，增加胰島細(xì)胞內(nèi)腺甘酸環(huán)化酶的活性，促進(jìn)胰島素的釋放，其作用是依賴葡萄糖的，在血糖升高時(shí)，靜脈輸注GLP-1能明顯增加胰島素分泌，隨著血糖水平的下降，葡萄糖刺激的消失，GLP-1促進(jìn)胰島素分泌的作用變小，繼續(xù)輸注GLP-1血糖不會(huì)繼續(xù)下降。在2型糖尿病患者，飲食誘導(dǎo)的GLP-1分泌受損，引起胰島β細(xì)胞分泌胰島素的惡化，從而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。GLP-1還具有增加肝糖原及肌糖原的合成，促進(jìn)脂肪酸合成，抑制胰升糖素的分泌，抑制胃腸動(dòng)力，延緩食物的吸收，抑制胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島細(xì)胞增生，抑制食欲，減輕體重，延緩糖尿病的發(fā)生等作用。
由于GLP-1具有多種藥理作用，正在試用于2型糖尿病的治療。研究表明輸入外源性GLP-1能明顯改善2型糖尿病患者空腹及餐后血糖，從而減少胰島素的用量，甚至停用胰島素，而且不會(huì)發(fā)生低血糖，長(zhǎng)期輸注GLP-1可顯著增加2型糖尿病患者胰島素的1相分泌。GLP-1還可降低甘油三酯水平，增大低密度脂蛋白顆粒體積，改善2型糖尿病伴冠心病患者的內(nèi)皮功能紊亂，延緩2型糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。盡管GLP-1在治療2型糖尿病方面具有很多優(yōu)點(diǎn)，但尚存在難以克服的缺點(diǎn)，GLP-1的體內(nèi)半衰期很短，靜脈輸注的半衰期約為5分鐘，從而使得GLP-1難以在臨床上應(yīng)用，因此，積極尋找有效的方法延長(zhǎng)GLP-1的半衰期具有非常重要的意義。在體內(nèi)GLP-1主要以兩種形式進(jìn)行清除酶清除與器官清除。GLP-1在二肽肽酶IV的作用下失去N-端的兩個(gè)氨基酸殘基成為無(wú)活性的GLP-1(9～36)酰胺。由于二肽肽酶IV具有高度的底物特異性，改變GLP-1的N-端氨基酸組成可增加GLP-1對(duì)二肽肽酶IV的抵抗力。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后獲得的GLP-1類似肽(Glucagons-like Peptide-1 Analogues，GLP-1-A)，對(duì)二肽肽酶IV的抵抗力顯著增加，其體外半衰期延長(zhǎng)到159分鐘，而且和GLP-1(7～37)具有相近的生物活性。但僅有二肽肽酶IV的參與不能解釋GLP-1在體內(nèi)的所有清除機(jī)制，GLP-1在體外血漿中的半衰期為20分鐘，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)許多研究所得出3～11分的體內(nèi)半衰期。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后獲得的GLP-1-A的體外半衰期顯著延長(zhǎng)，但體內(nèi)半衰期并沒(méi)有得到相應(yīng)的改善，提示尚有別的機(jī)制參與了GLP-1的體內(nèi)清除。腎臟在這一過(guò)程中起著重要的作用，GLP-1是小分子肽，易從腎臟濾過(guò)，在腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣有DPP-IV，GLP-1被腎臟濾過(guò)后，可被腎小管上皮細(xì)胞攝取而分解。大鼠腎臟切除后GLP-1的清除率下降，離體研究表明，腎臟一次可將灌注液中超過(guò)80％的GLP-1濾過(guò)而清除。因此，尋找有效的方法延緩GLP-1從腎臟的清除對(duì)于延長(zhǎng)GLP-1的體內(nèi)半衰期具有重要的意義。
在自然界中，許多多結(jié)構(gòu)域(或多功能域)的蛋白質(zhì)是由數(shù)個(gè)多肽鏈片段拼接在一起形成的，由相對(duì)較小的結(jié)構(gòu)域拼裝成較大的多功能蛋白是自然進(jìn)化的一個(gè)重要因素?；蛑亟M技術(shù)的發(fā)展使得人類能把不同基因或基因片段相融合，通過(guò)蛋白表達(dá)得到不同功能的蛋白拼接在一起形成的新型多結(jié)構(gòu)域的人工融合蛋白，目前這種方法已被應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究中，并顯示出較高的價(jià)值。在蛋白融合的過(guò)程中，為了最大限度地保持融合蛋白上各個(gè)蛋白的空間構(gòu)象及生物活性，常把不同的蛋白通過(guò)空間活動(dòng)性較大的接頭相連，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不易形成折疊的富含甘氨酸的短肽常用來(lái)作為接頭。由于脂聯(lián)素的功能域位于C-端，GLP-1的功能域位于N-端，從而可應(yīng)用基因重組技術(shù)將脂聯(lián)素的N-端和GLP-1的C-端通過(guò)一個(gè)空間活動(dòng)性較大的接頭相連，產(chǎn)生一種新的蛋白，該蛋白同時(shí)具有脂聯(lián)素的C-端和GLP-1的N-端，故可具有脂聯(lián)素和GLP-1的兩種功能，新的蛋白由于分子體積增大，不易從腎臟濾過(guò)而清除，可克服單一的GLP-1多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點(diǎn)，同時(shí)如將GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸以甘氨酸代替，則新蛋白的N-端還具有抵抗二肽肽酶IV的能力，可同時(shí)消除GLP-1在體內(nèi)易被清除的兩種因素，顯著延長(zhǎng)GLP-1的體內(nèi)半衰期。由于脂聯(lián)素球狀域的活性大于全長(zhǎng)的脂聯(lián)素，而且細(xì)菌表達(dá)的脂聯(lián)素球狀域具有活性，在該融合蛋白中如進(jìn)一步以脂聯(lián)素球狀域代替全長(zhǎng)的脂聯(lián)素，則可使該融合蛋白中的脂聯(lián)素具有更大的活性。
本發(fā)明在國(guó)內(nèi)、外首次運(yùn)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建含人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因(Adiponectin-GLP-1-A融合基因)的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達(dá)載體)，其中脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域編碼基因而獲得，GLP-1-A編碼基因通過(guò)將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子突變?yōu)楦拾彼崦艽a子而獲得，Adiponectin-GLP-1-A融合基因通過(guò)接頭序列將脂聯(lián)素編碼基因和GLP-1-A編碼基因連接而成，該接頭序列編碼產(chǎn)物為富含甘氨酸的短肽。本發(fā)明為進(jìn)一步用原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌，經(jīng)蛋白純化獲得人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白(Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白)，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，測(cè)定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期，獲得能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內(nèi)代謝紊亂，副作用小的新蛋白，建立表達(dá)具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，提供前期研究。本研究進(jìn)一步所獲得的新蛋白將有可能取代相當(dāng)部分的口服降糖藥物，且降糖作用會(huì)更好、更安全、更符合人體的生理需要，具有極大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的cDNA序列，全長(zhǎng)共567個(gè)bp，1-15bp編碼腸激酶識(shí)別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長(zhǎng)93bp(其中19-21bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT)，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長(zhǎng)45bp，154-564bp編碼脂聯(lián)素，序列長(zhǎng)411bp，565-567bp為終止密碼子，該融合基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO 1。
本發(fā)明的目的之二是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的構(gòu)建方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域編碼基因而獲得，通過(guò)將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT獲得人GLP-1-A基因，在設(shè)計(jì)人GLP-1-A基因引物時(shí)，在人GLP-1-A的上游引物P1上分別設(shè)計(jì)添加編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列、腸激酶識(shí)別序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的互補(bǔ)序列，下游引物P2分別設(shè)計(jì)添加人GLP-1-A基因互補(bǔ)序列、接頭肽編碼序列及編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列；設(shè)計(jì)脂聯(lián)素基因引物時(shí)，在上游引物P3上分別設(shè)計(jì)添加接頭肽編碼序列、編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列及脂聯(lián)素球狀域基因的互補(bǔ)序列，其中P2與P3的限制性酶切位點(diǎn)相同，下游引物P4分別設(shè)計(jì)脂聯(lián)素球狀域基因的互補(bǔ)序列及編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列。通過(guò)PCR分別擴(kuò)增兩個(gè)基因，運(yùn)用酶切技術(shù)，依次將GLP-1-A和脂聯(lián)素基因重組到原核表達(dá)載體中，利用限制性酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因融合獲得人Adiponectin-GLP-1-A融合基因，在該融合基因中，GLP-1-A的編碼基因與脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)編碼一柔性接頭肽的核苷酸序列相連接。GLP-1-A編碼基因引物P1、P2序列見(jiàn)SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂聯(lián)素編碼基因引物P3、P4序列見(jiàn)SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5；脂聯(lián)素編碼基因序列見(jiàn)SEQ.ID NO6，GLP-1-A編碼基因序列見(jiàn)SEQ.ID NO7，柔性接頭肽的核苷酸序列見(jiàn)SEQ.IDNO8。
本發(fā)明的目的之三是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表達(dá)載體(該載體即為脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達(dá)載體)。
本發(fā)明的目的之四是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)提取人脂肪組織總RNA，RT-PCR獲取脂聯(lián)素編碼基因，序列見(jiàn)SEQ.ID NO6。
(2)提取人類基因組DNA，PCR獲取GLP-1-A編碼基因，序列見(jiàn)SEQ.IDNO7。
(3)運(yùn)用酶切技術(shù)，依次將GLP-1-A和脂聯(lián)素編碼基因重組到原核表達(dá)載體PET28a中獲得含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達(dá)載體)。
(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌，證實(shí)此載體能很好地表達(dá)含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的序列見(jiàn)SEQ.ID NO9。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.在世界上首次將脂聯(lián)素和GLP-1-A的編碼基因進(jìn)行融合構(gòu)建獲得Adiponectin-GLP-1-A融合基因。
2.在世界上首次運(yùn)用酶切技術(shù)，構(gòu)建含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A。
3.Adiponectin-GLP-1-A融合基因由一接頭序列連接而成，使得由該融合基因表達(dá)的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白中的脂聯(lián)素和GLP-1-A通過(guò)一接頭肽相連接，有利于最大限度地保持融合蛋白上各個(gè)蛋白的空間構(gòu)象及生物活性。
4.Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域編碼基因而獲得，使得由該融合基因表達(dá)獲得Adiponectin-GLP-1-A融合中的脂聯(lián)素具有更大的生物活性。
5.在Adiponectin-GLP-1-A融合基因中還引入了腸激酶識(shí)別序列，使得該融合基因首先表達(dá)獲得的是含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，即在Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的N-端包括一個(gè)腸激酶識(shí)別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，可在以后的研究中通過(guò)腸激酶作用將其切割去除，使GLP-1-A的N-端游離出來(lái)，獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。
6.本發(fā)明通過(guò)兩種機(jī)制保證將來(lái)獲得的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白上的GLP-1-A有長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。一方面Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的GLP-1-A基因是將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子突變?yōu)楦拾彼崦艽a子而獲得，該突變可以使其表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的抵抗二肽肽酶IV降解的能力；另一方面融合蛋白本身分子量增大，不易從腎臟濾過(guò)而清除，可克服單一的GLP-1多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建融合蛋白的方法延長(zhǎng)GLP-1的體內(nèi)半衰期在世界上屬于首創(chuàng)。
7.用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)此載體能很好地表達(dá)含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，此融合蛋白為世界上首次獲得，為進(jìn)一步經(jīng)過(guò)蛋白純化、腸激酶切割獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，測(cè)定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期提供了良好的前期研究。
8.本發(fā)明的后續(xù)研究如能獲得成功，獲得具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，將在國(guó)內(nèi)、外首次建立表達(dá)具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，獲得既能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內(nèi)代謝紊亂，副作用小的新蛋白，具有極大的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。


圖1 GLP-1-A、脂聯(lián)素編碼基因瓊脂糖凝膠電泳。
圖2 PET28a-Adiponectin-GLP-1-A酶切結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳。
圖3 含腸激酶識(shí)別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白表達(dá)結(jié)果12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖4含腸激酶識(shí)別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例一1.材料和儀器1.1材料大腸桿菌菌株E.coli DH5α，BL21(DE3)由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所提供，原核表達(dá)質(zhì)粒PET28a購(gòu)自德國(guó)novagen公司，RNA抽提液(Trizol)購(gòu)自美國(guó)Gibcol BRL公司，焦碳酸二乙酯、Oligo(dT)15、UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程公司，M-MLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTPs、Taq DNA polymerase、瓊脂糖、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NheI、BamHI、HindIII、XbaI均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，淋巴細(xì)胞提取液購(gòu)自上海恒信化學(xué)試劑有限公司，GeneRulerTMDNA Ladder Mix購(gòu)自德國(guó)Fermentas公司，DNA Marker DL2000、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購(gòu)自日本TaKaRa公司，SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司，6×His Monoclonal Antibody(抗組氨酸單克隆抗體)購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物技術(shù)有限公司，Western Blotting LuminolReagent購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，QIA quick Gel Extraction kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。
1.2主要儀器高速低溫離心機(jī)(Biofuge 28RS)為德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品，細(xì)菌恒溫?fù)u床(Orbital Shaker)為美國(guó)Forma Scientific公司產(chǎn)品，紫外分光光度儀(8453型)購(gòu)自美國(guó)Hewlett Packard公司，GeneAmp PCR system 2400購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司，垂直電泳儀(Mini Protean 3 cell)和電轉(zhuǎn)移儀均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，真空冷凍干燥儀(UVS400A)購(gòu)自美國(guó)Savant Instruments公司，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY88-2型)購(gòu)自寧波新芝科器研究所，ABI377DNA測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)PIERCE公司。
2.引物的設(shè)計(jì)根據(jù)原核表達(dá)載體PET28a和GenBank中公布的人GLP-1(7-37)與脂聯(lián)素的基因序列，設(shè)計(jì)GLP-1-A與脂聯(lián)素編碼基因(通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域獲得)的引物及插入載體的位置。GLP-1-A編碼基因引物P15’-cgcgctagcgacgatgacgataagcatggtgaagggaccttt-3’，P25’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’；脂聯(lián)素編碼基因引物P35’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’，P45’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3。P1將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT(加粗斜體表示)，還包括N端腸激酶識(shí)別序列(下劃線表示，PET28a表達(dá)的蛋白N端含有組氨酸標(biāo)簽，所以引物上設(shè)計(jì)了腸激酶識(shí)別序列，用來(lái)去除融合蛋白N端的組氨酸標(biāo)簽)、NheI酶切位點(diǎn)(GCTAGC，加粗表示)，P2，P3含接頭序列(斜體表示)及BamHI酶切位點(diǎn)(GGATCC，加粗表示)，P4含HindIII酶切位點(diǎn)(AAGCTT，加粗表示)。接頭序列為45個(gè)堿基的核苷酸序列5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’，連接GLP-1-A與脂聯(lián)素兩個(gè)基因，編碼15個(gè)氨基酸，序列為N-(絲氨酸-甘氨酸)7-絲氨酸-C。引物由上海生工生物工程公司合成。GLP-1-A編碼基因引物序列見(jiàn)SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂聯(lián)素編碼基因引物序列見(jiàn)SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5，編碼柔性接頭肽的核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID NO8。
3.脂聯(lián)素編碼基因的RT-PCR擴(kuò)增3.1脂肪組織總RNA的抽提取-80℃保存的人脂肪組織約100mg，在液氮中研成粉末，參考Trizol試劑說(shuō)明書(shū)抽提脂肪組織的總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定分析RNA純度，所有RNAA260/A280比值在1.80以上。
3.2逆轉(zhuǎn)錄以mRNA為模板，Oligo(dT)15為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為取2μg總RNA，1.0μl 10pmol/μl ligo(dT)15，加0.1％DEPC水9μl，總體積10μl，混勻，65℃，變性10min，立即置于冰上，冷卻后加入4μl 5×M-MLV Buffer，1μl 25mM dNTPs，0.5μl RNasin，0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，加0.1％DEPC水至20μl，37℃反應(yīng)1h，所得cDNA用于PCR擴(kuò)增。
3.3擴(kuò)增反應(yīng)體系10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P31μl，10μM P41μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH2O 36.5μl，總體積50μl。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)后68℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V，電泳30min)。用QIA quick GelExtraction kit回收目的基因。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，其中1.DNA mark；2.GLP-1-A；3.脂聯(lián)素，脂聯(lián)素編碼基因序列見(jiàn)SEQ.ID NO6。
4.GLP-1-A編碼基因的PCR擴(kuò)增
4.1人類基因組DNA的提取取人外周靜脈5ml抗凝血，分離人外周血有核細(xì)胞，用UNIQ-10柱式基因組抽提試劑盒提取人類基因組DNA。
4.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P11μl，10μM P21μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH2O 36.5μl，反應(yīng)總體積50μl。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V，電泳30min)。用QIA quickGel Extraction kit回收目的基因。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，GLP-1-A編碼基因序列見(jiàn)SEQ.ID NO7。
5.Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的構(gòu)建5.1 PET28a-GLP-1-A重組質(zhì)粒的構(gòu)建①酶切與連接分別將割膠回收的GLP-1-A編碼基因及PET28a質(zhì)粒用NheI和BamHI在37℃的條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，GLP-1-A編碼基因或PET28a質(zhì)粒6.5μl，NheI 0.5μl，BamHI 0.5μl，反應(yīng)總體積20μl，反應(yīng)3h。然后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，用QIA quick Gel Extraction kit割膠回收酶切后的目的片段，將回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，連接體系為ddH2O 4.5μl，10×buffer 1μl，PET28a酶切回收產(chǎn)物3μl，GLP-1-A編碼基因酶切回收產(chǎn)物1μl，T4 DNA連接酶0.5μl，總體積10μl。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，以擴(kuò)增連接質(zhì)粒。
②鑒定挑取幾個(gè)平板上已經(jīng)長(zhǎng)出的單菌落，分別在含7ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素80μg/ml)的擴(kuò)增管中37℃，300rpm振搖過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用XbaI和BamHI在37℃的條件下雙酶切質(zhì)粒，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質(zhì)粒6.5μl，XbaI 0.5μl，BamHI 0.5μl，總體積20μl，反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，觀察酶切結(jié)果，留取陽(yáng)性克隆的菌液和質(zhì)粒，獲得PET28a-GLP-1-A重組質(zhì)粒。
5.2 Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的構(gòu)建①酶切與連接分別將構(gòu)建好的PET28a-GLP-1-A質(zhì)粒及割膠回收的脂聯(lián)素目的基因用BamHI、HindIII在37℃的條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，PET28a-GLP-1-A或脂聯(lián)素目的基因6.5μl，BamHI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，反應(yīng)3h。然后將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)，割膠回收酶切后目的片段，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，連接體系為ddH2O 14.5μl，10×buffer 2μl，PET28a-GLP-1-A酶切回收產(chǎn)物2μl，脂聯(lián)素目的基因酶切回收產(chǎn)物1μl，T4 DNA連接酶0.5μl，總體積20μl。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，以擴(kuò)增連接質(zhì)粒。
②鑒定挑取幾個(gè)平板上已經(jīng)長(zhǎng)出的單菌落，在7ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素80μg/ml)的擴(kuò)增管中37℃，300rpm振搖過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，分別用BamHI、HindIII(酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質(zhì)粒6.5μl，BamHI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，37℃反應(yīng)3h)及XbaI、HindIII(酶切體系為ddH2O 10μl，10×bufferB 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質(zhì)粒6.5μl，XbaI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，37℃反應(yīng)3h)雙酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，出現(xiàn)426bp及683bp的小片斷，酶切產(chǎn)物符合預(yù)期值，說(shuō)明Adiponectin-GLP-1-A融合基因已成功插入PET28a的預(yù)期酶切位點(diǎn)，獲得了Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達(dá)載體)。見(jiàn)圖2，其中M.DNAmarker；1.PET28a-Adiponectin-GLP-1-A未酶切；2.BamHI/HindIII酶切結(jié)果；3.XbaI/HindIII酶切結(jié)果。經(jīng)PET通用引物通過(guò)ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PET28a-Adiponectin-GLP-1-A進(jìn)行測(cè)序鑒定，表明各基因的插入方向及順序完全正確，所測(cè)序列和預(yù)期完全一致。Adiponectin-GLP-1-A融合基因序列見(jiàn)SEQ.ID NO1，全長(zhǎng)共567個(gè)bp，1-15bp編碼腸激酶識(shí)別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長(zhǎng)93bp，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長(zhǎng)45bp，154-564bp編碼脂聯(lián)素，序列長(zhǎng)411bp，565-567bp為終止密碼子，見(jiàn)SEQ.ID NO1。
6.原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A表達(dá)含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的初步研究取測(cè)序正確的PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)，次日挑取單菌落于7ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振搖過(guò)夜，吸取70μl到7ml LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振搖2h，使菌液在600nm處吸光度(A600)為0.4～0.6，留取誘導(dǎo)前菌液1ml作為對(duì)照，剩下菌液中加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，37℃分別振搖1～6h，分別收集1～6h各時(shí)段細(xì)菌，將每管細(xì)菌量進(jìn)行調(diào)整，直至A600基本一致，將收集的菌液以5,000rpm離心10min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次后，以適量PBS重懸，將菌液取10μl加等量的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5min，13,000rpm，離心1min后上樣，行12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后確定目的蛋白是否表達(dá)及表達(dá)量最大時(shí)間段。結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前的菌液相比，IPTG誘導(dǎo)后在25KD處有較濃的蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致，且IPTG誘導(dǎo)5～6h的蛋白條帶最濃，較誘導(dǎo)前均明顯增多。取誘導(dǎo)后5h菌液1ml冰浴上超聲破碎細(xì)菌，分別留上清及沉淀，將沉淀用與上清等體積的PBS混勻，分別取10μl，加等量的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5min，13,000rpm，離心1min后上樣，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25KD處有較濃的蛋白條帶，以沉淀的電泳條帶為濃，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。見(jiàn)圖3，其中M蛋白marker，1.IPTG誘導(dǎo)后5h沉淀蛋白，2.IPTG誘導(dǎo)后5h上清蛋白，3.IPTG誘導(dǎo)前菌液，4-9.IPTG誘導(dǎo)后1h～6h總蛋白；用抗組氨酸單克隆抗體對(duì)產(chǎn)物行Western Blot分析顯示上清及沉淀中均有特異性的蛋白表達(dá)。見(jiàn)4，其中1.IPTG誘導(dǎo)后5h沉淀蛋白，2.IPTG誘導(dǎo)后5h上清蛋白。由PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表達(dá)載體表達(dá)首先獲得的是含腸激酶識(shí)別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，共188個(gè)氨基酸，包括1-5aa編碼腸激酶識(shí)別序列，6-36aa編碼GLP-1-A(其中第7位氨基酸為突變的氨基酸甘氨酸)，37-51aa編碼連接肽，52-188aa編碼脂聯(lián)素。序列見(jiàn)SEQ.IDNO9?？稍谝院蟮难芯恐羞M(jìn)一步用腸激酶對(duì)該融合蛋白進(jìn)行切割獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。
本發(fā)明涉及的序列SEQ.ID NO1(Adiponectin-GLP-1-A融合基因cDNA序列)SEQ.ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度567個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述
5’-gacgatgacgataagcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatccgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga-3’SEQ.ID NO2(GLP-1-A編碼基因引物P1序列)SEQ.ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cgcgctagcgacgatgacgataagcatggtgaagggaccttt-3’SEQ.ID NO3(GLP-1-A編碼基因引物P2序列)SEQ.ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度65個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’SEQ.ID NO4(脂聯(lián)素編碼基因引物P3序列)
SEQ.ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’SEQ.ID NO5(脂聯(lián)素編碼基因引物P4序列)SEQ.ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3SEQ.ID NO6(脂聯(lián)素編碼基因序列)SEQ.ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度426個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述5’端引入BamH I酶切位點(diǎn)(6bp，方框表示)，3’端引入HindIII酶切位點(diǎn)(6bp，方框表示)。
5’-ggatccgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggta
aattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga -3’SEQ.ID NO7(GLP-1-A編碼基因序列)SEQ.ID NO7的信息(i)序列特征(E)長(zhǎng)度159個(gè)堿基(F)類型核酸(G)鏈性雙鏈(H)拓?fù)渚€性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述5’端引入Nhe I酶切位點(diǎn)(6bp，方框表示)、腸激酶識(shí)別序列(15bp，加粗表示)，3’端引入接頭序列(45bp，加粗表示)，BamH I酶切位點(diǎn)(6bp，方框表示，位于接頭序列內(nèi))，總長(zhǎng)度159bp，其中25-27bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT(加粗斜體表示)。
5’- gacgatgacgataagcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttct -3’SEQ.ID NO8(Adiponectin-GLP-1-A融合基因柔性接頭核苷酸序列)SEQ.ID NO8的信息(i)序列特征(I)長(zhǎng)度45個(gè)堿基(J)類型核酸(K)鏈性雙鏈(L)拓?fù)渚€性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’
SEQ.ID NO9(含腸激酶識(shí)別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白序列)SEQ.ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度188個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(ii)分子型多肽(iii)序列描述Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr LeuGlu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser Gly SerGly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala PheSer Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys IlePhe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn IlePro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val SerLeu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn AsnVal Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly Asp Gln Val TrpLeu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn AspSer Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn
權(quán)利要求
1.人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的cDNA序列，其特征是全長(zhǎng)共567個(gè)bp，1-15bp編碼腸激酶識(shí)別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長(zhǎng)93bp，其中19-21bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長(zhǎng)45bp，154-564bp編碼脂聯(lián)素，序列長(zhǎng)411bp，565-567bp為終止密碼子，該融合基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO 1。
2.人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因構(gòu)建方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域編碼基因而獲得，通過(guò)將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGT獲得人GLP-1-A基因，在設(shè)計(jì)人GLP-1-A基因引物時(shí)，在人GLP-1-A的上游引物P1上分別設(shè)計(jì)添加編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列、腸激酶識(shí)別序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的互補(bǔ)序列，下游引物P2分別設(shè)計(jì)添加人GLP-1-A基因互補(bǔ)序列、接頭肽編碼序列及編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列；設(shè)計(jì)脂聯(lián)素基因引物時(shí)，在上游引物P3上分別設(shè)計(jì)添加接頭肽編碼序列、編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列及脂聯(lián)素球狀域基因的互補(bǔ)序列，其中P2與P3的限制性酶切位點(diǎn)相同，下游引物P4分別設(shè)計(jì)脂聯(lián)素球狀域基因的互補(bǔ)序列及編碼一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，通過(guò)PCR分別擴(kuò)增兩個(gè)基因，運(yùn)用酶切技術(shù)，依次將GLP-1-A和脂聯(lián)素基因重組到原核表達(dá)載體中，利用限制性酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因融合獲得人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因，在該融合基因中，GLP-1-A的編碼基因與脂聯(lián)素編碼基因通過(guò)編碼一柔性接頭肽的核苷酸序列相連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因構(gòu)建方法，其特征是GLP-1-A編碼基因引物P1、P2序列為SEQ.ID NO 2，SEQ.IDNO 3，脂聯(lián)素編碼基因引物P3、P4序列為SEQ.ID NO 4，SEQ.ID NO 5，脂聯(lián)素編碼基因序列為SEQ.ID NO 6，GLP-1-A編碼基因序列為SEQ.ID NO 7，柔性接頭肽的核苷酸序列為SEQ.ID NO 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合融合基因，其特征是含人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含人脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)提取人脂肪組織總RNA，RT-PCR獲取脂聯(lián)素編碼基因，序列見(jiàn)SEQ.ID NO 6；(2)提取人類基因組DNA，PCR獲取GLP-1-A編碼基因，序列見(jiàn)SEQ.IDNO 7；(3)運(yùn)用酶切技術(shù)，依次將GLP-1-A和脂聯(lián)素編碼基因重組到原核表達(dá)載體PET28a中獲得含脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的原核表達(dá)載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A。(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌，證實(shí)此載體能很好地表達(dá)含腸激酶識(shí)別序列的脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白，含腸激酶識(shí)別序列的脂聯(lián)素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的序列見(jiàn)SEQ.ID NO 9。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了人脂聯(lián)素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達(dá)載體及構(gòu)建方法。本發(fā)明運(yùn)用PCR技術(shù)獲得人脂聯(lián)素和GLP－1－A編碼基因，脂聯(lián)素基因通過(guò)擴(kuò)增脂聯(lián)素球狀域基因獲得，通過(guò)將人GLP－1(7－37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子突變?yōu)楦拾彼崦艽a子獲得GLP－1－A編碼基因，運(yùn)用酶切技術(shù)，將GLP－1－A和脂聯(lián)素編碼基因定向克隆到表達(dá)載體，獲得人脂聯(lián)素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌表達(dá)出了含腸激酶識(shí)別序列的人Adiponectin－GLP－1－A融合蛋白，本發(fā)明為進(jìn)一步研究其活性，測(cè)定融合蛋白上GLP－1－A半衰期，得到能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素、能改善胰島素抵抗、副作用小的新蛋白提供良好的前期研究。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1737150SQ20051005084
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者趙同峰, 谷衛(wèi), 詹宇紅, 趙江佩 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)