專利名稱：硒蛋白SelK對相互作用蛋白HCLP1和抑癌基因LZIP的功能調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為利用酵母雙雜交及免疫共沉淀、細(xì)胞免疫熒光等技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了SelK蛋白可以與HCLP1蛋白相互作用，并且這種相互作用促進(jìn)了HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，通過雙熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)揭示了SelK蛋白與HCLP1蛋白的相互作用協(xié)同抑制了抑癌基因LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用，為硒元素對人類生命健康所起的重要作用和癌癥治療提供線索。
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新方法、新基因、新蛋白的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硒(Se)是1817年發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)似硫的元素，在20世紀(jì)50年代以后人們逐漸認(rèn)識到硒是哺乳動物必需的一種微量營養(yǎng)元素，它在生物醫(yī)學(xué)上的意義引起了越來越多的重視。然而，硒元素本身的化學(xué)性質(zhì)或生物通常接觸的少數(shù)幾種硒的無機(jī)化合物不能合理地解釋由硒所引起的生物學(xué)效應(yīng)。1973年發(fā)現(xiàn)的第一批硒蛋白——梭狀芽孢桿菌的甲酸脫氫酶和甘氨酸還原酶系統(tǒng)中的蛋白A以及哺乳動物谷胱甘肽過氧化物酶為我們理解硒缺乏引起的綜合癥提供了線索。隨后，各種硒蛋白相繼在不同生物中發(fā)現(xiàn)，它們的生物學(xué)功能和在分子病理中的作用也不斷得到闡明。隨著已知的硒蛋白數(shù)目不斷增加，我們將對硒在病毒感染、心血管疾病、癌癥預(yù)防及其他類型的疾病中所起的作用有著更深入的認(rèn)識。
硒元素能以兩種基本形式存在于天然蛋白中，第一種是硒作為一種可解離的輔因子通過翻譯后修飾存在于蛋白中，硒的這種蛋白相關(guān)的形式比較稀有，僅在幾種細(xì)菌含鉬酶中發(fā)現(xiàn)；另外，硒能以稀有的氨基酸——硒代半胱氨酸的形式通過共翻譯整合入蛋白中，這種一級結(jié)構(gòu)上含有硒代半胱氨酸的蛋白即硒蛋白(selenoprotein)。硒蛋白廣泛存在于生物界，如細(xì)菌、古細(xì)菌和哺乳動物中均已鑒定多種硒蛋白。硒蛋白在哺乳動物中更常見，自從發(fā)現(xiàn)第一例哺乳動物硒蛋白以來，哺乳動物硒蛋白的數(shù)目迅速增長，到目前為止，人的硒蛋白總數(shù)已增加到25個。
了解最多的哺乳動物硒蛋白家族是谷胱甘肽過氧化物酶家族，硫氧還蛋白還原酶家族，和脫碘酶家族。哺乳動物谷胱甘肽過氧化物酶家族有四個成員cGPx，GPx-GI，pGPx，PHGPX。它的基本功能是保護(hù)細(xì)胞免受氧化攻擊。哺乳動物硫氧還蛋白還原酶分子量為約55-65kD，而且催化許多完全不同的反應(yīng)，它不僅還原氧化型硫氧還蛋白的二硫鍵，而且還原一些其他蛋白的二硫鍵和各種各樣被氧化的低分子量化合物。硫氧還蛋白還原酶作為ROS的重要還原機(jī)制之一，在細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)中發(fā)揮重要作用，而且硫氧還系統(tǒng)調(diào)節(jié)著還原敏感型轉(zhuǎn)錄因子如p53，NFκB的轉(zhuǎn)錄活性。在脊椎動物中鑒定三種碘化甲狀腺素脫碘酶，I型(D1)，II型(D2)和III型(D3)均是硒蛋白。它們催化甲狀腺素(T4，四碘甲腺原氨酸)和碘甲腺原氨酸的脫碘，決定甲狀腺激素的合成和降解。其他大部分硒蛋白，包括硒蛋白SelK功能未知，還有待深入研究。目前硒蛋白在生物中扮演的重要作用已成為生物醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。
我們對于SelK的關(guān)注是在研究另外一個基因功能的過程中開始的。這個基因稱為HCLP1，它編碼一個具有406個氨基酸的蛋白，是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞核蛋白。這個蛋白由六個45～71個氨基酸的重復(fù)基序，即KELCH重復(fù)組成，屬于KELCH蛋白超家族。
KELCH基序是一種古老的元件，首先在果蠅kelch蛋白中發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于進(jìn)化過程的蛋白質(zhì)中。KELCH基序一般重復(fù)4到7次形成kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域，半乳糖氧化酶晶體結(jié)構(gòu)的研究揭示KELCH結(jié)構(gòu)域在空間上形成一個β螺旋槳結(jié)構(gòu)。現(xiàn)今已在人基因組中鑒定71種含有KELCH重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白。根據(jù)KELCHβ螺旋槳的位置和蛋白中其他結(jié)構(gòu)域的存在將KELCH重復(fù)蛋白分為五類，其中BTB/KELCH蛋白構(gòu)成KELCH重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白的72％，而HCLP1整個蛋白分子就形成一個六葉螺旋槳結(jié)構(gòu)。KELCH超家族蛋白分布很廣泛，既有位于細(xì)胞內(nèi)的，也有位于細(xì)胞膜的，還有位于細(xì)胞間質(zhì)的。KELCH超家族蛋白在生物體中發(fā)揮的功能也十分多樣。
HCLP1是一個全新的β螺旋槳蛋白，關(guān)于它在生物體內(nèi)的功能報(bào)道還比較少。我們以HCLP1為“誘餌”蛋白，采用酵母雙雜交技術(shù)篩選人HeLa細(xì)胞cDNA文庫，獲得了一個克隆，其cDNA序列編碼的蛋白為SelK。我們的實(shí)驗(yàn)即是以這兩者相互作用的發(fā)現(xiàn)為線索，探索兩者在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的分子機(jī)理，以及兩者在細(xì)胞方面的功能。我們的實(shí)驗(yàn)可能為硒元素對人類生命健康所起的重要作用提供線索。

發(fā)明內(nèi)容
我們發(fā)現(xiàn)HCLP1和SelK的相互作用，通過這種相互作用增強(qiáng)了HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，從而進(jìn)一步抑制抑癌基因LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用。
硒元素在生物界扮演重要作用，然而硒生物學(xué)功能的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。我們的結(jié)果初步揭示了SelK在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，為硒元素對人類生命健康所起的重要作用提供線索。
1.我們以HCLP1為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選HeLa細(xì)胞cDNA文庫，篩查到與HCLP1發(fā)生相互作用的蛋白SelK。隨后，我們利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了HCLP1與SelK的相互作用是特異的。
2.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，HCLP1蛋白與SelK之間的相互作用改變了HCLP1的亞細(xì)胞定位——促進(jìn)了HCLP1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，而SelK蛋白自身的亞細(xì)胞定位不發(fā)生變化。
3.熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明，HCLP1蛋白與SelK之間的相互作用協(xié)同抑制了抑癌基因LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。
因此，SelK通過與HCLP1的相互作用，增強(qiáng)HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，而且HCLP1蛋白與SelK之間的相互作用協(xié)同抑制了抑癌基因LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。
以上所述及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果也即本發(fā)明的技術(shù)指標(biāo)。


圖1HCLP1和SelK體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Co-immunoprecipitation)1.SelK單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293ET細(xì)胞；2.SelK和HCLP1共轉(zhuǎn)染HEK293ET細(xì)胞；3.SelK單獨(dú)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞；4.SelK和HCLP1共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞圖2HCLP1和SelK在HeLa細(xì)胞中的定位a.pEGFP-SelK單獨(dú)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞；b.pEGFP-HCLP1單獨(dú)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞圖3HCLP1蛋白與SelK之間的相互作用促進(jìn)HCLP1的細(xì)胞質(zhì)定位pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1分別共轉(zhuǎn)染COS7和HeLa細(xì)胞，a和d為SelK在COS7和HeLa細(xì)胞中的定位；b和e為HCLP1在COS7細(xì)胞中的定位；c和f為SelK和HCLP1在COS7和HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)共定位。
圖4HCLP1蛋白與SelK的相互作用協(xié)同抑制了LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用1.用質(zhì)粒pM-LZIP及pGal4Luc、pRL-TK共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞；2.用質(zhì)粒pM-LZIP、pcDNA3.1/V5-HCLP1及pGal4Luc、pRL-TK共轉(zhuǎn)COS7細(xì)胞；3-6.用質(zhì)粒pM-LZIP、pcDNA3.1/V5-HCLP1及pGal4Luc、pRL-TK和不同劑量的pEGFP-SelK共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。
實(shí)施例1.試驗(yàn)所需引物

1.酵母雙雜交篩選HCLP1的相互作用蛋白我們用AS-HCLP1F和AS-HCLP1R這對引物對人HCLP1的cDNA重組質(zhì)粒用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行BamHI和Pst I雙酶切，同時將pAS2-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將載體和片斷重組連接，隨后轉(zhuǎn)化DH5α。從轉(zhuǎn)化的菌落中挑選單菌落，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序驗(yàn)證。結(jié)果表明人HCLP1基因的讀碼框被正確的插入到載體之中。該重組載體在本研究中稱為pAS2-1-HCLP1。我們將pAS2-1-HCLP1轉(zhuǎn)入酵母后分別鋪于SD/Trp-和含有不同濃度3-AT的SD/Trp-His-培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。結(jié)果表明，含有pAS2-HCLP1的酵母Y190轉(zhuǎn)化子不能在SD/Trp-His-+20mM 3-AT培養(yǎng)基生長，LacZ檢測呈陰性。說明pAS2-1-HCLP1轉(zhuǎn)入Y190后沒有自激活現(xiàn)象，可以進(jìn)行下一步的文庫篩選。
我們采用順序轉(zhuǎn)染法，將clontech公司的人HeLa細(xì)胞cDNA文庫轉(zhuǎn)入含有pAS2-1-HCLP1質(zhì)粒的Y190酵母中，轉(zhuǎn)化子全部鋪于SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT培養(yǎng)基上進(jìn)行His+克隆的篩選。30℃倒置培養(yǎng)一周后，選擇培養(yǎng)皿上直徑＞2mm的陽性克隆點(diǎn)種于劃格的新鮮SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT平皿上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)72小時培養(yǎng)后進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測。結(jié)果His+克隆中呈現(xiàn)藍(lán)色的菌落，即His+LacZ+克隆為陽性克隆。
將篩選到的酵母克隆中的質(zhì)粒分別與pAS2-1-HCLP1和pAS2-1空載體共轉(zhuǎn)染酵母SFY526菌株，以確定篩選到的蛋白是否能夠產(chǎn)生自激活現(xiàn)象以及是否能夠與HCLP1蛋白在更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下相互作用。
通過雙轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和對His+LacZ+酵母克隆進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的信息查詢，發(fā)現(xiàn)一個陽性克隆編碼的蛋白為SelK。
2.Co-immunoprecipitation試驗(yàn)為了擴(kuò)增人SelK基因的編碼區(qū)，我們用GFP-SelK F和GFP-SelK R這一對引物對SelK的編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在這一對引物中上游引物使用了SelK基因讀碼框和其下游的20個堿基，5’端引入了Myc標(biāo)簽、BamH I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。下游引物使用了該基因自身的終止密碼子，并引入XbaI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。
將上述引物所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用BamH I和XbaI雙酶進(jìn)行末端切割后，和用同樣的酶處理的pEGFP-C1載體進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化DH5α，并對克隆進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，所獲的陽性克隆進(jìn)一步做了測序驗(yàn)證。同時，我們設(shè)計(jì)引物V5-HCLP1 F和V5-HCLP1 R，回收產(chǎn)物后與BamH I和Xho I雙酶切的pCDNA3.1V5/HisB載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α以獲取重組載體，經(jīng)過酶切鑒定和DNA測序驗(yàn)證，表明HCLP1基因的讀碼框已經(jīng)正確插入載體中，命名該重組的質(zhì)粒為pcDNA3.1/V5-HCLP1。
我們用pEGFP-SelK單轉(zhuǎn)細(xì)胞以及pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1雙轉(zhuǎn)細(xì)胞后，收集了大約1×107個細(xì)胞的裂解物，按照分子克隆原版第三版的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行了Co-immunoprecipitation實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1，說明HCLP1與SelK的相互作用是特異的。
附Co-immunoprecipitation實(shí)驗(yàn)步驟試劑細(xì)胞裂解液20mmol/L HEPES(pH7.5) 150mmol/L NaCl1％NP40 1mmol/L EDTA100mmo/L NaF 10mmol/L焦磷酸鈉20mmol/L β-甘油磷酸鈉1mmol/L釩酸鈉*1mmol/L DTT* 2mmol/L PMSF*10μg/ml Aprotinin**使用時新鮮加入實(shí)驗(yàn)步驟1).細(xì)胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前兩天將75cm2培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1∶3傳入75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至70～80％時，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。質(zhì)粒用量為880μl(40ng/μl)。轉(zhuǎn)染后48hrs收集細(xì)胞。
2).細(xì)胞的裂解每瓶中加入1.5ml冰預(yù)的裂解液，放置冰上裂解1hr。
其間追加一次PMSF，并且間隔10min用細(xì)胞刮攪動一次。細(xì)胞裂解物于4℃14000rpm離心20min后收集上清凍存于-70℃。
3).免疫共沉淀1ml細(xì)胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振搖3hrs以除去非特異吸附的蛋白質(zhì)。12000rpm離心20sec收集上清。將2μl anti-V5的鼠單抗加入上清中，4℃振搖1hr后再追加50μl 50％proteinA agarose，繼續(xù)振搖1hr。隨后用含有1mmol/L釩酸鈉的裂解液1ml洗滌3次，最后再用不含釩酸鈉的裂解液洗滌一次。樣品經(jīng)上樣緩沖液處理，用鼠抗Myc的單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測，ECL法顯色。
3.細(xì)胞免疫熒光定位我們首先如上所述將人SelK的編碼區(qū)序列構(gòu)建到pEGFP-C1中。GFP是綠色熒光蛋白，人SelK基因的編碼區(qū)構(gòu)建到載體中后，即可以人SelK-GFP融合蛋白的方式獲得表達(dá)。同時，我們設(shè)計(jì)引物GFP-HCLP1F和GFP-HCLP1R，回收產(chǎn)物后與Pst I和BamH I雙酶切的pEGFP-N1載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α以獲取重組載體，經(jīng)過酶切鑒定和DNA測序驗(yàn)證，表明HCLP1基因的讀碼框已經(jīng)正確插入載體中，命名該重組的質(zhì)粒為pEGFP-HCLP1用Lipofectamine2000介導(dǎo)的方法，我們將pEGFP-SelK和pEGFP-HCLP1分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。由于GFP與SelK或HCLP1融合表達(dá)，所以，在一定的波長的激光激發(fā)下，可以顯示SelK和HCLP1在細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明，人SelK蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)(圖2a)，HCLP1蛋白定位在細(xì)胞核(圖2b)。
我們將pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1共轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)固定后，用anti-V5(Invitrogen)作為一抗，以羅丹明紅標(biāo)記的兔抗小鼠抗體作為二抗，這樣，就可以在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，通過不同波長的激光激發(fā)，看到兩個蛋白在同一個細(xì)胞中的定位情況。在熒光共聚焦顯微鏡下，人GFP-SelK為綠色，全部定位于細(xì)胞質(zhì)(圖3a和3d)，而HCLP1在細(xì)胞核中無紅色分布，全部定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖3b和3e)，并且兩者的定位相重疊(圖3c和3f)。這說明，HCLP1通過與SelK的相互作用促進(jìn)了HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)了HCLP1的細(xì)胞質(zhì)定位。
附細(xì)胞免疫熒光試劑濃酸∶濃硝酸∶濃鹽酸＝2∶1(V/V)4％多聚甲醛固定液60ml水中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷卻至15℃時用HCl將pH調(diào)至7.0。最后用PBS補(bǔ)充至100ml。
透化液0.5％Triton/PBS封閉液3％BSA/PBS封片劑以預(yù)先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制備90％的甘油實(shí)驗(yàn)步驟1).蓋玻片的處理將蓋玻片分次置入濃酸中浸泡2小時，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理過的蓋玻片投入十倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5min后取出于60℃干燥1hr或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
2).質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按用Lipofectamine2000介導(dǎo)的方法進(jìn)行。
3).細(xì)胞免疫熒光染色(1)細(xì)胞固定轉(zhuǎn)染后48hrs用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10～15min。
(2)PBS漂洗，3×5min。
(3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10min。
(4)PBS漂洗，3×5min。
(5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃過夜。
(6)一抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀釋度稀釋的一抗(如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則同時加入兩種一抗)，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下伏于一抗上，密封于濕盒中，37℃，30min。
(7)PBS漂洗，3×5min。
(8)二抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗(如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則同時加入兩種二抗)，37℃，30min。
(9)PBS漂洗，3×5min。
(10)去離子水漂洗去鹽，2×5min。
(11)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。
4.人HCLP1與SelK的相互作用對LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用的影響我們用M-LZIP F和M-LZIP R這對引物對人LZIP的cDNA重組質(zhì)粒用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切，同時將pM質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和SalI雙酶切，將載體和片斷重組連接，隨后轉(zhuǎn)化DH5α。從轉(zhuǎn)化的菌落中挑選單菌落，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序驗(yàn)證。結(jié)果表明人LZIP基因的讀碼框被正確的插入到載體之中。該重組載體在本研究中稱為pM-LZIP。
文獻(xiàn)表明，人LZIP基因是一種抑癌基因，HCLP1可抑制LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用，而HCLP1與SelK的相互作用可導(dǎo)致HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，HCLP1的轉(zhuǎn)位是否會對LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用有影響不得而知。因此，本研究利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，探討人HCLP1與SelK的相互作用對抑癌基因LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。
我們將pM-LZIP與pGAL4Luc、pcDNA3.1/V5-HCLP1和不同劑量的pEGFP-SelK共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，通過檢測熒光素酶報(bào)告基因的活性來判斷HCLP1與SelK的相互作用對LZIP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。另外，同時轉(zhuǎn)染的pRL-TK載體能夠編碼另一種熒光素酶，此酶的活性用作試驗(yàn)的內(nèi)參照。
結(jié)果如圖4所示，HCLP1蛋白能夠顯著抑制LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用，而隨著SelK劑量的增大，HCLP1和SelK協(xié)同抑制了LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用。
附熒光素酶報(bào)告基因分析的實(shí)驗(yàn)步驟和方法樣品制備1)將細(xì)胞以1×105接種于12孔板，90％匯合時用LIPOFECTAMINE2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2)24-48收集細(xì)胞。PBS洗三遍，吸凈殘余液體，每孔加入150裂解液，室溫放置15-20分鐘，每隔幾分鐘晃動一次，使裂解液完全覆蓋細(xì)胞。
3)收集細(xì)胞裂解液，4℃12，000rpm離心2min，收集上清，-70保存?zhèn)溆谩?br> 報(bào)告基因活性測定使用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System.基本原理實(shí)驗(yàn)所用報(bào)告基因載體為pGL3，編碼firefly熒光素酶。為了衡量每個孔的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)時共轉(zhuǎn)pRL-TK作為內(nèi)對照，該質(zhì)粒編碼Renilla熒光素酶。這兩種酶的底物和反應(yīng)緩沖液不同，可以用同一樣品在同一個試管中測定。firefly熒光素酶反應(yīng)體系為LAR II，Renilla熒光素酶反應(yīng)體系為Stop & Glo Reagent，均由試劑盒提供。
1)預(yù)熱熒光計(jì)，設(shè)定參數(shù)，每次延遲2秒后開始測定，測定時間為十秒。
2)將100μl LAR II加入熒光管，接著加入20μl細(xì)胞裂解液，用槍頭混勻2-3次，放入熒光計(jì)開始讀數(shù)。
3)記錄firefly熒光素酶讀數(shù)，重復(fù)一次。
4)在同一個管中加入100μl Stop & Glo Reagent，混勻，重新放入熒光計(jì)開始測定，重復(fù)一次。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及硒蛋白SelK與HCLP1之間的相互作用的發(fā)現(xiàn)以及二者之間的相互作用對抑癌基因LZIP轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之2個蛋白SelK與HCLP1之間的相互作用，其特征在于，SelK通過與HCLP1的相互作用促進(jìn)HCLP1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，增強(qiáng)了HCLP1的細(xì)胞漿定位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述及之SelK與HCLP1之間的相互作用，其特征在于，通過Luciferase報(bào)告系統(tǒng)分析，SelK和HCLP1能抑制抑癌基因LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用，SelK與HCLP1的相互作用能協(xié)同抑制LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之2個蛋白SelK與HCLP1，其特征在于SelK通過與HCLP1的相互作用，增強(qiáng)了HCLP1的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，協(xié)同抑制抑癌基因LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用，為腫瘤治療提供靶向。
全文摘要
本發(fā)明涉及硒蛋白SelK對相互作用蛋白HCLP1的功能調(diào)節(jié)。以HCLP1為“誘餌”蛋白，采用酵母雙雜交技術(shù)篩選人HeLa細(xì)胞cDNA文庫，獲得與之相互作用的一個蛋白SelK。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明SelK能特異地與HCLP1相互作用。細(xì)胞免疫熒光定位分析表明SelK通過與HCLP1的相互作用，促進(jìn)了HCLP1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，SelK與HCLP1的相互作用協(xié)同抑制了抑癌基因LZIP的轉(zhuǎn)錄激活作用。結(jié)果揭示了硒蛋白SelK對相互作用蛋白HCLP1和抑癌基因LZIP所起的調(diào)節(jié)作用，為硒元素對人類生命健康所起的重要作用和癌癥治療提供線索。
文檔編號C12N15/09GK1840691SQ20051005933
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月29日
發(fā)明者陸彩玲, 周海軍, 彭小忠, 強(qiáng)伯勤, 袁建剛 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所