專利名稱：一種重組全長人腦紅素、其生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及具有神經(jīng)保護(hù)功能的腦紅素(NGB)的制備方法。
背景技術(shù)：
腦紅素(Neuroglobin，NGB)是德國學(xué)者Burmester等于2000年發(fā)現(xiàn)的除了血紅蛋白和肌紅蛋白之外體內(nèi)第三類重要的攜氧珠蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)，廣泛分布于腦組織內(nèi)。人腦紅素有151個(gè)氨基酸，分子量為17千道爾頓。隨后一系列報(bào)道發(fā)現(xiàn)，腦紅素和血紅蛋白、肌紅蛋白一樣能可逆地結(jié)合氧，且與氧有很高的親和力。腦紅素結(jié)合氧的能力介于血紅蛋白和肌紅蛋白之間。發(fā)明人及美國學(xué)者Greenberg等在2002發(fā)現(xiàn)，在多種因素(如缺血、缺氧、組織水腫等)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)氧供應(yīng)不足時(shí)，腦紅素在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)將顯著增高，可促進(jìn)氧向神經(jīng)細(xì)胞的擴(kuò)散，并加速氧在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而大幅度提高氧在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的利用程度，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞在多種損傷情況下的存活能力。對神經(jīng)細(xì)胞而言，如果腦紅素的含量降低，或者沒有腦紅素的表達(dá)的話，神經(jīng)細(xì)胞將喪失對分子氧的利用能力，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。因此，腦紅素可被視為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的“氧吧”，決定了神經(jīng)細(xì)胞對氧的生物利用能力。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)正常含量的腦紅素將促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的正常有氧代謝過程，反之，如果神經(jīng)細(xì)胞中缺乏或者沒有腦紅素的話，即使腦內(nèi)血液供應(yīng)充足，神經(jīng)細(xì)胞也無法獲得足夠的氧以完成正常的功能活動(dòng)。因此，腦紅素是一個(gè)具有神經(jīng)保護(hù)作用的重要功能分子。
文獻(xiàn)記載的人腦紅素的制備，一般采用融合蛋白方式表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物往往含有融合蛋白(例如谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GST)等)部分。這種表達(dá)產(chǎn)物對于進(jìn)行腦紅素的功能研究一般沒有較大的影響，但是由于表達(dá)產(chǎn)物中含有外源蛋白成分，并不能代表天然蛋白質(zhì)。同時(shí)，目前幾乎所有文獻(xiàn)中所報(bào)道的人腦紅素的制備并沒有經(jīng)過氨基酸序列測定確認(rèn)，一般是通過免疫印跡技術(shù)進(jìn)行鑒定，這對于科學(xué)研究是可以接受的，但是對于作為擬投放市場的產(chǎn)品的鑒定是不夠的。另外，文獻(xiàn)中所報(bào)道的用來進(jìn)行科學(xué)研究的大鼠腦紅素或者小鼠腦紅素的制備方式，有通過原核表達(dá)方式實(shí)現(xiàn)的，也有直接從動(dòng)物腦組織中提取分離的。這些制備方法均無法獲得人腦紅素。這些人腦紅素的制備方法所存在的缺陷反過來均可被本專利申請所描述的方法所克服。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)菌表達(dá)獲取的具有生物活性的重組全長人腦紅素(rhNGB)。
本發(fā)明另一目的是提供一種用細(xì)菌表達(dá)獲取具有生物活性的重組全長人腦紅素(rhNGB)的方法。
本發(fā)明再一目的是提供重組全長人腦紅素rhNGB在制備預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明的重組全長人腦紅素rhNGB，是通過包括將工程菌接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)細(xì)菌反復(fù)凍融、菌體裂解、包涵體裂解、層析純化和目的蛋白復(fù)性步驟生產(chǎn)所得到的。
本發(fā)明重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，包括將工程菌接種培養(yǎng)、細(xì)菌反復(fù)凍融、菌體裂解、包涵體裂解、層析純化和目的蛋白復(fù)性等步驟。
上述方法中，所述工程菌為重組pBV220-rhNGB/HB101工程菌；所述工程菌接種培養(yǎng)基為含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；所述包涵體裂解步驟中將所述包涵體冰浴超聲破碎后，于100℃煮沸5min；所述層析純化步驟順序包括凝膠過濾和陰離子交換層析；所述凝膠過濾用Sephacryls-200凝膠層析柱；所述陰離子交換層析采用Amersham Q Sepharose FF強(qiáng)陰離子交換層析柱。
本發(fā)明是在人腦紅素基因編碼區(qū)(Neurosurvivin，NSV)構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離裂解、蛋白質(zhì)復(fù)性純化的工藝，從而獲得了重組全長人腦紅素純品，并對重組全長人腦紅素的生物學(xué)活性進(jìn)行描述，表明全長人腦紅素具有預(yù)防和治療中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用途。檢測證明，用本發(fā)明人腦紅素的生產(chǎn)方法確實(shí)可以得到純度較高具有生物活性的人腦紅素。


圖1為本發(fā)明生產(chǎn)工藝流程圖；圖2為本發(fā)明rhNGB進(jìn)行氨基端測序譜圖；圖3-1為通過PCR技術(shù)獲得rhNGB擴(kuò)增產(chǎn)物后的電泳圖片，其中A DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3-2為rhNGB工程菌株構(gòu)建的示意圖；圖3-3為通過PCR方法鑒定rhNGB陽性克隆的圖片，其中A DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B-G 連接產(chǎn)物PCR鑒定圖3-4為通過酶切方法鑒定rhNGB陽性克隆的圖片，其中A DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B pBV220空載體對照；C-F 連接產(chǎn)物酶切鑒定圖4A為本發(fā)明rhNGB在難治性癲癇患者顳葉病灶中的表達(dá)圖片，圖4B為本發(fā)明rhNGB在難治性癲癇患者海馬組織中的表達(dá)，(免疫組化染色結(jié)果，放大倍數(shù)×100)；圖5A為使用PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠進(jìn)行基因組整合情況鑒定的圖片；圖5B為采用RT-PCR技術(shù)對所獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)rhNGB表達(dá)進(jìn)行檢測的圖片；圖5C為采用免疫印跡技術(shù)對所獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)rhNGB表達(dá)進(jìn)行檢測的圖片；圖6A為通過免疫印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠在單側(cè)局灶性缺血模型后的表達(dá)；圖6B顯示未轉(zhuǎn)染rhNGB基因的同品系小鼠在單側(cè)局灶性缺血模型后，大腦皮層的梗塞面積較大；圖6C顯示轉(zhuǎn)染rhNGB基因的小鼠在單側(cè)局灶性缺血模型后，大腦皮層的梗塞面積較小，說明rhNGB對局灶性腦缺血具有保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在構(gòu)建人腦紅素基因并構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套包括工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離裂解和蛋白質(zhì)復(fù)性純化的工藝，具體生產(chǎn)工藝流程參見附圖1。本發(fā)明中，人腦紅素基因片段命名為Neurosurvivin(NSV)，可以從人胎腦cDNA文庫中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增獲得(一參考文獻(xiàn)Burmester T，Weich B，Reinhardt S，Hankeln T.A vertebrate globin expressed in the brain.Nature.2000 Sep 28；407(6803)520-523)。
一、本發(fā)明重組全長人腦紅素(rhNGB)的制備具體通過以下操作實(shí)現(xiàn)1. 重組pBV220-rhNGB/HB101工程菌的構(gòu)建1)引物的合成根據(jù)hNGB基因(人腦紅素基因片段NSV)已知序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物pU和pD，pU引物5’端引入了EcoRI酶切位點(diǎn)及起始密碼子ATG，pD引物5’端引入了BamHI酶切位點(diǎn)，引物由上海博亞生物技術(shù)公司合成。
pU5’-CCggAATTCATggAgCgCCCggAg-3’pD5’-ggTggATCCTTACTCgCCATCCCAgCCTCg-3’2)PCR的擴(kuò)增反應(yīng)以人腦紅素基因片段(NSV)為模板，利用步驟1)合成的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為先95℃變性5min，再94℃45秒，60℃45秒，72℃45秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后，取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物1.2％(w/v)瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3-1
3)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI同時(shí)消化高效表達(dá)載體pBV220和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳回收，應(yīng)用T4 DNA連接酶使二者連接(見圖3-2)，轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣處理的E.coli HB101感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子接種于3ml LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定后的陽性克隆再提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示，經(jīng)PCR擴(kuò)增及EcoRI和BamHI雙酶切后，重組質(zhì)粒均有一470bp左右的DNA片斷，其大小與插入的NGB基因片段NSV基本相符(見圖3-3、圖3-4)，命名此重組克隆為pBV220-rhNGB/HB101，作為表達(dá)rhNGB的工程菌。
2. 基因工程菌種的活化從4℃保存的穩(wěn)定細(xì)胞株或細(xì)菌平皿中吸取5μl菌液或挑取分離良好的單菌落，接種于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃200rpm振蕩培養(yǎng)8h；按1％(v/v)接種于搖瓶中，培養(yǎng)基同前，30℃200rpm振蕩培養(yǎng)16h作為種子液。
3. 搖菌并誘導(dǎo)表達(dá)種子液按照3％(v/v)接種于150ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃200rpm蕩培養(yǎng)2-3h，待其OD600＝0.3~0.4時(shí)迅速移入42℃水浴中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5h，誘導(dǎo)rhNGB的表達(dá)。
4. 細(xì)菌的收集、洗滌、凍融于4℃6000rpm離心15min收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌，取少量菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，同時(shí)以TE緩沖液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗菌體三次，將菌體置于液氮中5min，取出在冰浴中融化，反復(fù)凍融三次，加入10倍體積的TE緩沖液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)懸浮菌體。
5. 菌體的裂解將用TE緩沖液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)懸浮的菌體冰浴超聲(超聲功率為400W)破碎30s，間歇20s，共超聲15次。4℃12000rpm離心20min，棄上清，收集包涵體。
6. 包涵體的洗滌將包涵體用Tris緩沖液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl)洗滌，4℃12000rpm離心20min，棄上清，沉淀用TE緩沖液(25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗滌兩次，4℃12000rpm離心20min，棄上清，留包涵體。
7. 包涵體的裂解將包涵體重懸于含有8mol/L脲素和1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液中，冰浴超聲(超聲功率為400W)破碎30s，間歇20s，共超聲6次。100℃煮沸5min，室溫12000rpm離心10min，留上清，棄沉淀。
8. 凝膠過濾采用Sephacryls-200凝膠層析柱，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液進(jìn)行平衡。將已處理過的樣品(步驟7)上樣，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫液。將收集的洗脫液各管進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定含雜蛋白較少的目的蛋白各管。
9. 陰離子交換層析采用Amersham Q Sepharose FF強(qiáng)陰離子交換層析柱，用含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液進(jìn)行平衡。將已確定的含雜蛋白較少的目的蛋白各管合并后上樣，分別用含NaCl濃度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.5M、0.7M的平衡液(含有2mol/L脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液)進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，并用含1M NaCl濃度的平衡液對陰離子交換層析柱進(jìn)行再生，同時(shí)取含各濃度NaCl的洗脫管樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定在NaCl濃度為0.7M的平衡液的洗脫管中的蛋白為目的蛋白。
10. 目的蛋白rhNGB的復(fù)性及脫鹽采用Sephadex G-50凝膠過濾柱，用含有0.1％(v/v)SDS的TE緩沖液進(jìn)行平衡，將含目的蛋白的洗脫管樣品上樣，用含有0.1％(v/v)SDS的TE緩沖液沖洗柱子，收集流出液。
經(jīng)檢測，rhNGB的表達(dá)量為1.2g/L培養(yǎng)基。將收集得到的rhNGB用作下面實(shí)驗(yàn)。
二、重組全長人腦紅素(rhNGB)的鑒定1、rhNGB的核酸序列和氨基酸序列已知人腦紅素基因片段(NSV)(其一參考文獻(xiàn)Burmester T，Weich B，Reinhardt S，Hankeln T.A vertebrate globin expressedin the brain.Nature.2000 Sep 28；407(6803)520-523)其編碼區(qū)全長456個(gè)堿基，可編碼151個(gè)氨基酸。具體的核酸序列為(序列1)ATGGAGCGCCCGGAGCCCGAGCTGATCCGGCAGAGCTGGCGGGCAGTGAGCCGCAGCCCGCTGGAGCACGGCACCGTCCTGTTTGCCAGGCTGTTTGCCCTGGAGCCTGACCTGCTGCCCCTCTTCCAGTACAACTGCCGCCAGTTCTCCAGCCCAGAGGACTGTCTCTCCTCGCCTGAGTTCCTGGACCACATCAGGAAGGTGATGCTCGTGATTGATGCTGCAGTGACCAATGTGGAAGACCTGTCCTCACTGGAGGAGTACCTTGCCAGCCTGGGCAGGAAGCACCGGGCGGTGGGTGTGAAGCTCAGCTCCTTCTCGACAGTGGGTGAGACTCTGCTCTACATGCTGGAGAAGTGTCTGGGCCCTGCCTTCACACCAGCCACACGGGCTGCCTGGAGCCAACTCTACGGGGCCGTAGTGCAGGCCATGAGTCGAGGCTGGGATGGCGAGTAA對應(yīng)的氨基酸序列為(序列2)MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNCRQFSSPEDCLSSPEFLDHIRKVMLVIDAAVTNVEDLSSLEEYLASLGRKHRAVGVKLSSFSTVGETLLYMLEKCLGPAFTPATRAAWSQLYGAVVQAMSRGWDGE2、本發(fā)明制備的rhNGB的鑒定用質(zhì)譜儀對本發(fā)明制備的hNGB樣品進(jìn)行鑒定，可得到如下的氨基酸序列MERPEPELIR QSWRAVSRSP LEHGTVLFAR LFALEPDLLP LFQYNCRQFS SPEDCLSSPEFLDHIRKVML VIDAAVTNVE DLSSLEEYLA SLGRKHRAVG VKLSSFSTVG ESLLYMLEKC LGPAFTPATRAAWSQLYGAV VQAMSRGWDG E該氨基酸序列中，加黑部分為相匹配的部分(66個(gè)氨基酸)，覆蓋率占全長人腦紅素(151個(gè)氨基酸)的43.7％，確認(rèn)本發(fā)明方法所得到的樣品是正確的。
進(jìn)一步對所制備的rhNGB樣品進(jìn)行氨基端測序(使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司491蛋白序列分析儀，環(huán)境溫度20℃，環(huán)境相對濕度28％)，得到樣品N末端序列為M-E-R-P-E-P-E-L-I-R-Q-S-W-R-A-V，參見附圖2，該氨基端的16個(gè)氨基酸與全長人腦紅素的氨基端完全一致，確認(rèn)本發(fā)明所得到的樣品是完全正確的。
三、重組全長人腦紅素(rhNGB)的功能驗(yàn)證1.腦紅素在難治性癲癇患者腦組織中的表達(dá)特征腦紅素是一個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的基因，主要功能是促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的氧利用。利用本發(fā)明制備的重組全長人腦紅素(rhNGB)按常規(guī)方法獲得高效價(jià)單克隆抗體，采用經(jīng)典的免疫組化技術(shù)研究，具體方法為選擇7例2003年8月至2003年10月間在北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)切除治療的難治性癲癇病例。所有病例均長期服用三種以上抗癲癇藥物，反復(fù)多次的血藥濃度檢測提示各種抗癲癇藥物均在有效范圍之內(nèi)或高于有效范圍。臨床上診斷均為原發(fā)性癲癇，具體表現(xiàn)為強(qiáng)直陣攣發(fā)作。通過采用常規(guī)冰凍切片免疫組化ABC法檢測NGB的表達(dá)。切片厚20μm，4％多聚甲醛固定。采用SP試劑盒(ZYMED公司產(chǎn)品)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。一抗選用以本發(fā)明制備的rhNGB為抗原免疫小鼠制備的NGB單克隆抗體(編號(hào)1E12)，工作濃度為1∶100，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG工作液(1∶400，Santa Cruz公司產(chǎn)品)，經(jīng)DAB顯色后，脫水，透明，封片。陰性對照以PBS替代一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果顯示在難治性癲癇患者腦內(nèi)顳葉病灶和海馬中，腦紅素的表達(dá)均隨發(fā)作年限增加而減少，且顳葉病灶中的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于海馬(參見圖4A和4B)，這一結(jié)果提示癲癇發(fā)作時(shí)病灶處需要較多的氧從而導(dǎo)致腦紅素表達(dá)增高，但隨著癲癇發(fā)作年限的增加，腦紅素在顳葉病灶中的表達(dá)情況呈現(xiàn)不可逆的下降，是癲癇的病因之一。因此，該實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明制備的重組全長人腦紅素(rhNGB)可用于癲癇病人的治療中，可通過提高癲癇病人腦內(nèi)腦紅素的含量達(dá)到治療癲癇的目的。
2、增強(qiáng)腦紅素可保護(hù)動(dòng)物抵抗腦缺血損傷通過遺傳工程技術(shù)制備rhNGB基因轉(zhuǎn)小鼠動(dòng)物模型，從而人為地提高小鼠腦內(nèi)腦紅素rhNGB的表達(dá)水平。將人腦紅素基因片段(NSV)置于pCMV-Myc載體的CMV啟動(dòng)子下游SalI和XbaI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)間，得到含有本發(fā)明的rhNGB基因的重組表達(dá)載體pCMV-Myc-rhNGB，將pCMV-Myc-rhNGB表達(dá)載體通過電擊方式導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染7～8天后挑取并鑒定陽性克隆。將陽性ES細(xì)胞通過囊胚顯微注射方式構(gòu)建嵌合體小鼠。通過PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠進(jìn)行基因組整合情況鑒定，用RT-PCR和Western Blot檢測小鼠腦神經(jīng)組織中rhNGB的表達(dá)情況，篩選轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果如圖5A、圖5B和圖5C所示；其中，RT-PCR引物序列為pFwd(5’-cccgctggagcacggcaccgtcc-3’)和pRvs(5’-ttactcgccatcccagcctcg-3’)；免疫印跡檢測中的一抗為以本發(fā)明rhNGB為抗原免疫家兔得到的多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(購自北京中山試劑公司)。通過進(jìn)一步的品系繁殖獲得成功的轉(zhuǎn)基因小鼠。
圖5A為使用PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠進(jìn)行基因組整合情況鑒定的圖片。所采用的引物跨越pCMV-Myc載體部分和rhNGB序列部分。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為940bp。圖中可見Tg-1和Tg-2為陽性小鼠，其基因組DNA中已經(jīng)整合有該表達(dá)載體。WT為野生型小鼠。P為采用原始質(zhì)粒作為陽性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
圖5B為采用RT-PCR技術(shù)對所獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)rhNGB表達(dá)進(jìn)行檢測的圖片。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為400bp。Tg-1和Tg-2為陽性小鼠，WT為野生型小鼠。圖中可見Tg-1、Tg-2中NGB的表達(dá)量顯著高于野生型，說明rhNGB已在陽性小鼠中表達(dá)(即陽性小鼠中表達(dá)的NGB包括了rhNGB和小鼠自身的NGB)。
圖5C為采用免疫印跡技術(shù)對所獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)rhNGB表達(dá)進(jìn)行檢測的圖片。Tg-1和Tg-2為陽性小鼠，WT為野生型小鼠。圖中可見Tg-1、Tg-2中NGB的表達(dá)量顯著高于野生型，說明rhNGB已在陽性小鼠中表達(dá)(即陽性小鼠中表達(dá)的NGB包括了rhNGB和小鼠自身的NGB)。Actin所指的條帶為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量控制的陽性對照。
采用常規(guī)的線栓法制備轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠腦缺血模型，用TTC染色法檢測腦內(nèi)梗塞面積的大小，以反映動(dòng)物大腦皮層腦缺血程度。
圖6為采用常規(guī)的線栓法制備轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠單側(cè)局灶性缺血模型，檢測大腦皮層梗塞面積的變化圖片。其中圖6A為通過免疫印跡方法跟蹤檢測轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠rhNGB在單側(cè)局灶性缺血模型后的表達(dá)情況，說明rhNGB的表達(dá)隨著缺血時(shí)間的延長而增加；圖6B為未轉(zhuǎn)染rhNGB基因的同品系小鼠(正常對照小鼠)在單側(cè)局灶性缺血模型后，大腦皮層的梗塞面積較大；圖6C為轉(zhuǎn)染rhNGB基因的小鼠在單側(cè)局灶性缺血模型后，大腦皮層的梗塞面積較小，說明rhNGB對局灶性腦缺血具有保護(hù)作用。
對TTC染色法檢測小鼠腦內(nèi)梗塞面積的大小統(tǒng)計(jì)分析顯示，轉(zhuǎn)rhNGB基因小鼠大腦的梗塞面積(71.74±22.61)比對照小鼠的(102.49±11.05)顯著減少(P＜0.01)。該結(jié)果顯示本發(fā)明得到的rhNGB可顯著保護(hù)動(dòng)物對抗缺血性損傷(腦中風(fēng))所帶來的腦梗塞。
序列表<160>2<210>1<211>456<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)atggagcgcc cggagcccga gctgatccgg cagagctggc gggcagtgag ccgcagcccg 60ctggagcacg gcaccgtcct gtttgccagg ctgtttgccc tggagcctga cctgctgccc120ctcttccagt acaactgccg ccagttctcc agcccagagg actgtctctc ctcgcctgag180ttcctggacc acatcaggaa ggtgatgctc gtgattgatg ctgcagtgac caatgtggaa240gacctgtcct cactggagga gtaccttgcc agcctgggca ggaagcaccg ggcggtgggt300gtgaagctca gctccttctc gacagtgggt gagactctgc tctacatgct ggagaagtgt360ctgggccctg ccttcacacc agccacacgg gctgcctgga gccaactcta cggggccgta420gtgcaggcca tgagtcgagg ctgggatggc gagtaa 456<210>2<211>151<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val1 5 10 15Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe20 25 30Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Cys Arg Gln35 40 45Phe Ser Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp His50 55 60Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His85 90 95Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Thr100 105 110Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Cys Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala115 120 125Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met130 135 140Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu145 150
權(quán)利要求
1.一種重組全長人腦紅素rhNGB，是通過包括將工程菌接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)細(xì)菌反復(fù)凍融、菌體裂解、包涵體裂解、層析純化和目的蛋白復(fù)性步驟生產(chǎn)得到。
2.一種重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，具體步驟包括將工程菌接種培養(yǎng)、細(xì)菌反復(fù)凍融、菌體裂解、包涵體裂解、層析純化和目的蛋白復(fù)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述工程菌為重組pBV220-rhNGB/HB101工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述工程菌接種培養(yǎng)基為含有100μg/ml氨芐青霉素的LB。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述包涵體裂解步驟中將所述包涵體冰浴超聲破碎后，于100℃煮沸5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述層析純化步驟順序包括凝膠過濾和陰離子交換層析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述凝膠過濾用Sephacryls-200凝膠層析柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述陰離子交換層析采用Amersham Q Sepharose FF強(qiáng)陰離子交換層析柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組全長人腦紅素rhNGB的生產(chǎn)方法，其特征在于，具體按照以下步驟進(jìn)行1)構(gòu)建重組pBV220-rhNGB/HB101工程菌；2)基因工程菌種的活化挑取分離良好的單菌落，接種于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃ 200rpm振蕩培養(yǎng)8h；1％(v/v)接種于搖瓶中，培養(yǎng)基同前，30℃ 200rpm振蕩培養(yǎng)16h作為種子液；3)搖菌培養(yǎng)種子液按照3％(v/v)接種于150ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃ 200rpm蕩培養(yǎng)2-3h，待其OD600＝0.3~0.4時(shí)迅速移入42℃水浴中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5h；4)細(xì)菌的收集、洗滌、凍融于4℃ 6000rpm離心15min收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌，以TE緩沖液洗菌體三次，將菌體置于液氮中5min，取出在冰浴中融化，反復(fù)凍融三次，加入10倍體積的TE緩沖液懸浮菌體；所述TE緩沖液為25mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA；5)菌體的裂解將上步懸浮的菌體冰浴超聲破碎30s(超聲功率為400W)，間歇20s，共超聲15次；4℃、12000rpm離心20min，棄上清，收集包涵體，并洗滌包涵體；6)包涵體的裂解將包涵體重懸于含有8mol/L的脲素和1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液中，冰浴超聲破碎30s(超聲功率為400W)，間歇20s，共超聲6次；然后于100℃煮沸5min，室溫12000rpm離心10min，留上清，棄沉淀；7)凝膠過濾采用Sephacryls-200凝膠層析柱，用含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液進(jìn)行平衡；將步驟6)得到的上清液上樣，目的蛋白位于主峰，收集主峰；將主峰各管進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取含雜蛋白較少的目的蛋白各管；8)陰離子交換層析采用Amersham Q Sepharose FF強(qiáng)陰離子交換層析柱，用含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液進(jìn)行平衡；將步驟7)已確定的含雜蛋白較少的目的蛋白各管合并后上樣，分別用含NaCl濃度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.5M、0.7M的平衡液進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳觀察各洗脫峰，并確定NaCl濃度為0.7M的洗脫管中的蛋白為目的蛋白；所述平衡液為含有2mol/L的脲素和0.1％(v/v)巰基乙醇的TE緩沖液；9)目的蛋白的復(fù)性及脫鹽采用Sephadex G-50凝膠過濾柱，用含有0.1％(w/v)SDS的TE緩沖液進(jìn)行平衡，將含目的蛋白的洗脫管樣品上樣，含有0.1％(w/v)SDS的TE緩沖液沖洗柱子，收集流出液即為重組全長人腦紅素液體。
10.權(quán)利要求1所述的重組全長人腦紅素rhNGB在制備預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌表達(dá)生產(chǎn)重組全長人腦紅素rhNGB的方法以及用該方法得到的重組全長人腦紅素rhNGB，該方法包括將工程菌接種培養(yǎng)、細(xì)菌反復(fù)凍融、菌體裂解、包涵體裂解、層析純化和目的蛋白復(fù)性等步驟。本發(fā)明是在構(gòu)建人腦紅素基因片段NSV并構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離裂解、蛋白質(zhì)復(fù)性純化的工藝，從而獲得了重組全長人腦紅素純品，并對重組全長人腦紅素的生物學(xué)活性進(jìn)行描述。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明得到的全長人腦紅素可以作為藥物用于預(yù)防和治療中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1687445SQ20051005931
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者張成崗, 王利紅, 高艷, 王春麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所