專利名稱：抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體zuf10及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，間充質(zhì)干細(xì)胞)是近年來成體干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，其可以從骨髓、臍帶血、脂肪組織、滑膜、骨骼肌、肺、乳牙中分離獲得，具有分裂、增殖、分化成多種細(xì)胞的潛能，在一定的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)條件下可以分化為各個(gè)胚層的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞等；間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性弱，不表達(dá)MHC-II類分子和T細(xì)胞共刺激分子，并具有免疫調(diào)節(jié)活性，這使異基因間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用成為可能；通過基因修飾方法，可使間充質(zhì)干細(xì)胞定向地表達(dá)某些特異的分子而作為細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療的理想載體。間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中有廣闊的前景。目前美國(guó)和歐洲多個(gè)研究中心已開展自體和異基因間充質(zhì)干細(xì)胞治療多種疾病的I、II期臨床試驗(yàn)，主要應(yīng)用于心肌梗死、成骨不全、大塊的骨缺損、軟骨缺損、肌腱損傷、韌帶損傷的修復(fù)和重建，并對(duì)異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(Metachromatic Leukodystrophy，MLD)、赫爾利綜合征(HurlerSyndrome，MPSIH)、重型再生障礙性貧血、移植物抗宿主病等疾病的治療有一定的臨床療效；國(guó)內(nèi)亦著手開展間充質(zhì)干細(xì)胞治療重大疾病的I期臨床研究。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是由Friedenstein在20世紀(jì)60年代首次證實(shí)，是在骨髓中的一種非造血系統(tǒng)的干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中以低密度存在，約104～105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中含有一個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞，但其在體外培養(yǎng)可以倍增50次而不改變其表型特征和分化潛能。迄今為止間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性的表面標(biāo)記，其不表達(dá)CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A及T或B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，認(rèn)為相對(duì)特異性表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。目前各個(gè)實(shí)驗(yàn)室主要還是通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)方法和免疫分選法陽性或陰性篩選獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)傳代的間充質(zhì)干細(xì)胞是一群相對(duì)均一的細(xì)胞，但是不同的分離培養(yǎng)條件導(dǎo)致獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞可能來源于不同的亞群，其生物學(xué)特性可能存在一定的差異。研究者正努力尋求間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其生物學(xué)特性。
20世紀(jì)90年代起研究者通過雜交瘤技術(shù)，研制開發(fā)了多種人間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的單克隆抗體1991年P(guān)aul J.Simmons等以骨髓CD34+細(xì)胞免疫小鼠獲得了人骨髓基質(zhì)細(xì)胞新的單克隆抗體STRO-1；1992年Haynesworth SE等研制了3個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的單克隆抗體SH2、SH3、SH4，之后進(jìn)一步研究證實(shí)SH2的抗原表位位于CD105上，SH3、SH4的抗原表位位于CD73上；1997年J.C.Joyner等研制的單克隆抗體HOP-26，針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的前體細(xì)胞有特異性，研究證實(shí)其抗原表位為CD63上的肽段；1997年S.P.Bruder等將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞免疫小鼠獲得單克隆抗體SB-10，與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)，SB-10的抗原表位位于CD166上；2005年Hyun-Jung Hoo等報(bào)道采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及細(xì)胞膜蛋白提取物免疫小鼠，獲得單克隆抗體YS08、YS14、YS18。間充質(zhì)干細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞的單克隆抗體的研究豐富了對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子及其分化抗原的認(rèn)識(shí)，但目前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞表型仍缺乏全面的認(rèn)識(shí)，尚未發(fā)現(xiàn)其單一的特異性標(biāo)記，因此進(jìn)一步認(rèn)識(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記及生物學(xué)特性，將推進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，命名ZUF10，能與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合，用ZUF10通過免疫印跡法檢測(cè)提取的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白，可獲得單一的特異性陽性條帶。該單克隆抗體與人外周血淋巴細(xì)胞、人血液系統(tǒng)細(xì)胞株及其他組織細(xì)胞株、人間充質(zhì)組織及非間充質(zhì)組織、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞、其他動(dòng)物骨髓細(xì)胞無交叉反應(yīng)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供抗骨髓人間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)免疫原的準(zhǔn)備以多供體來源的傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三～第五代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為動(dòng)物免疫的抗原。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用Ficoll-paque密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)獲得，目前公認(rèn)的人間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標(biāo)記出現(xiàn)單峰，造血細(xì)胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性，是一高度均質(zhì)細(xì)胞群；可以多次傳代，擴(kuò)增至第8代細(xì)胞數(shù)可達(dá)(2～3)×1010左右；通過體外定向誘導(dǎo)可分化為間充質(zhì)來源的的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，也能分化為其他胚層來源的細(xì)胞(如神經(jīng)元樣細(xì)胞)；所用的凍存方法在復(fù)蘇后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率高，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。
(2)動(dòng)物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，免疫BALB/c小鼠，以期產(chǎn)生針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞共同識(shí)別位點(diǎn)的特異性單克隆抗體。每只小鼠以1.0×106細(xì)胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強(qiáng)免疫一次，3天后待融合。
(3)雜交瘤細(xì)胞系的建立取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)以PEG介導(dǎo)融合。融合后細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接免疫熒光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對(duì)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個(gè)月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，直到細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
本發(fā)明的第三目的是提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細(xì)胞系ZUF10，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體ZUF10，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC No.C200513，保藏日期為2005年8月30日。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是建立應(yīng)用該單克隆抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光染色、免疫印跡等技術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
以抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10為探針，通過流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓細(xì)胞懸液中的間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行定量分析。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質(zhì)干細(xì)胞相應(yīng)抗原的表達(dá)，并對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分布進(jìn)行定位分析。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10，結(jié)合熒光二抗，用免疫熒光染色法標(biāo)記培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞、全骨髓細(xì)胞、其他細(xì)胞及組織冰凍切片的相應(yīng)蛋白分子，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的相應(yīng)蛋白分子的表達(dá)進(jìn)行定位和定量分析，并可檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中的分布。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10，采用免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)單克隆抗體ZUF10的相應(yīng)抗原在培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)。
本發(fā)明應(yīng)用建立的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存體系，采用多供者來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為抗原免疫BALB/c小鼠，成功了制備一種新的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，可用于間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記提供了有效的工具，同時(shí)也為進(jìn)一步闡明間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性提供了平臺(tái)，并可推廣應(yīng)用于多種檢測(cè)技術(shù)以及臨床研究。


圖1為用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法獲取的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A為培養(yǎng)的原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，B為凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的人骨髓間充干細(xì)胞。
圖2為培養(yǎng)擴(kuò)增第一代和第四代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
圖3低溫凍存前后第四代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
圖4培養(yǎng)的第四代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別用CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE標(biāo)記，圖為流式細(xì)胞術(shù)分析圖。
圖5人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞，B為誘導(dǎo)成骨分化后Von Kossa法染色。
圖6人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞，B為誘導(dǎo)脂肪分化后油紅O染色。
圖7人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞，B、C、D、E分別為誘導(dǎo)神經(jīng)分化后用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、神經(jīng)元標(biāo)志物NF-M、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。
圖8以單克隆抗體ZUF10，通過間接免疫熒光染色法檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
圖9用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10的相應(yīng)抗原在骨髓組織中的表達(dá)。
圖10以單克隆抗體ZUF10，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A為陰性對(duì)照，B為以ZUF10為探針的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。
圖11以單克隆抗體ZUF10，通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞爬片，B為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊。
圖12以單克隆抗體ZUF10，通過免疫印跡法檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中相應(yīng)抗原的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、鑒定、凍存及復(fù)蘇(1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)無菌條件下采集六份健康供者的骨髓，肝素抗凝，用Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心收集單個(gè)核細(xì)胞，以4×105個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM(LG-DMED)培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后更換培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞可見有梭形貼壁細(xì)胞，之后每3d換液1次，15～20d原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁融合達(dá)80％～90％，排列有明顯方向性，成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似(參見圖1)，用0.25％胰蛋白酶-lmmol EDTA消化，按1∶3比例分瓶傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為P1細(xì)胞。傳代培養(yǎng)過程中每3d換液一次，細(xì)胞達(dá)90％融合后消化傳代，并標(biāo)記為P2，以此類推。
(2)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)特性的鑒定取培養(yǎng)傳代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第一、第四代細(xì)胞，按2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8天，進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析。培養(yǎng)具有以下共性特征細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，12h細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)重新變成梭形細(xì)胞，傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～36h；傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)增殖期約為4～5d；對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束后進(jìn)入平臺(tái)期；第四代與第一代細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有顯著差異(參見圖2)。
(3)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的鑒定取培養(yǎng)傳代的第一、三、五代細(xì)胞，以CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE單克隆抗體為探針，用流式細(xì)胞術(shù)分析間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子的表達(dá)。結(jié)果顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標(biāo)記出現(xiàn)單峰，造血細(xì)胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性(參見圖4)。經(jīng)傳代擴(kuò)增后的各代間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)無明顯差異(參見表1)，表明培養(yǎng)擴(kuò)增的人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是一均質(zhì)細(xì)胞群。
表1成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)

(4)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多分化潛能的鑒定培養(yǎng)傳代細(xì)胞的接近70％融合時(shí)，更換培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LG-DMEM，10％胎牛血清、10-8M地塞米松、10mM β-磷酸甘油、0.25mM抗壞血酸)、脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液、神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4d，大約30％細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由原來的紡錘型變?yōu)榱⒎叫突蚨嘟切停?d后出現(xiàn)鈣化斑點(diǎn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，立方型或多角型細(xì)胞以及鈣化斑明顯增加，約14～21d細(xì)胞形成廣泛均一的礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)21d后，Von Kossa法染色，可以見到染成棕黑色的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積(參見圖5)，對(duì)照組無礦化結(jié)節(jié)形成能力。
經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，細(xì)胞形態(tài)開始變成圓形或多角性，細(xì)胞排列無序，可觀察到胞漿中出現(xiàn)高折光性的小脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸聚集成大的脂滴。培養(yǎng)21d后，油紅O染色，脂滴為橙紅色，約80％以上間充質(zhì)干細(xì)胞均誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞(參見圖6)。
經(jīng)神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)24后細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，更換含5mM硫代甘油的無血清LG-DMEM，在誘導(dǎo)后3-5h中，大多數(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細(xì)胞，簡(jiǎn)單的雙級(jí)細(xì)胞和復(fù)雜的多級(jí)細(xì)胞均有出現(xiàn)，多個(gè)神經(jīng)元樣細(xì)胞突起可相互延伸并形成網(wǎng)狀(參見圖7)。免疫組化染色分析，神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、神經(jīng)元標(biāo)志物NF-M表達(dá)陽性、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)陰性(參見圖7)。
(5)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇將培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞消化后，用凍存保護(hù)液(LG-DMEM、5％DMSO、30％胎牛血清)重懸細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為1×106/ml，用程控凍存方法凍存，計(jì)算機(jī)設(shè)定降溫程序以-1℃/min速率從4℃降至0℃，平衡5min，以-1℃/min速率降至-30℃，然后以-5℃/min速率降至-80℃，快速移入-196℃液氮罐保存。從液氮中取出細(xì)胞放入40℃的恒溫水浴箱快速解凍，在1min內(nèi)解凍完畢，細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率87.67±2.52％，復(fù)蘇細(xì)胞接種后12h細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)重新變成梭形細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過2-3d休眠期后開始迅速增殖，約7～10d細(xì)胞可達(dá)80％～90％融合，細(xì)胞排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，與凍存前細(xì)胞形態(tài)基本一致(參見圖1)。比較凍存前后的第四代細(xì)胞，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性(用MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，參見圖3)、免疫表型(參見表2)、及誘導(dǎo)分化潛能(成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞)均未發(fā)生變化。
表2第四代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)

實(shí)施例2抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10的制備和純化(1)動(dòng)物免疫取雌性6～8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用2份供者來源混合的第三～五代間充質(zhì)干細(xì)胞懸于PBS，約1.0×106/只注入小鼠腹腔。第8d、15d繼續(xù)免疫，免疫方法同第一次。第20天，把經(jīng)三次免疫后小鼠眼球采血，離心分離血清，血清與培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育以間接免疫熒光染色法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選擇效價(jià)高的小鼠準(zhǔn)備融合。融合前3天加強(qiáng)免疫一次，細(xì)胞數(shù)為2.0×106/只。
(2)雜交瘤細(xì)胞系的制備完成免疫過程的小鼠準(zhǔn)備取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，在融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞。融合時(shí)無菌下取小鼠脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞以10∶1混合，以50％PEG介導(dǎo)融合，離心后重懸于HAT選擇性培養(yǎng)基中，接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，融合后第3d、5d、7d用HAT培養(yǎng)液半量換液，兩周后換用HT培養(yǎng)液。
觀察雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，等克隆長(zhǎng)至孔底面積的1/3～1/2，取培養(yǎng)上清液與間充質(zhì)干細(xì)胞孵育，用Ig(G+M)-FITC熒光二抗以間接免疫熒光染色法進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對(duì)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100％，此時(shí)可將陽性克隆細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個(gè)月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，定期收集上清，用篩選抗體的方法測(cè)定上清中的抗體，直到細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
(3)單克隆抗體的制備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1～2周后收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠腹腔注射0.5～1.0×105細(xì)胞懸液。接種細(xì)胞14天左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫臼法處死后打開腹腔，取出腹水。離心后吸取上清，分裝，-20℃保存。取10ml腹水抗體，加入10ml生理鹽水稀釋，用鹽析法以50％的硫酸銨粗提免疫球蛋白，之后用DEAE-纖維素離子交換柱純化。
(4)抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10腹水效價(jià)及亞型鑒定取小鼠腹水抗體，倍比稀釋后與免疫的間充質(zhì)干細(xì)胞孵育后，用間接免疫熒光染色法檢測(cè)(方法同抗體篩選)，抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體效價(jià)為1∶106?？贵w亞型測(cè)定取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用金免疫層析法檢測(cè)，屬IgG1型(輕鏈為κ型)。
實(shí)施例3單克隆抗體ZUF10的特異性的鑒定(1)單克隆抗體ZUF10在人血液系統(tǒng)細(xì)胞、及人類細(xì)胞株中特異性的鑒定細(xì)胞材料培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、外周血細(xì)胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的人外周血單個(gè)核細(xì)胞、全骨髓細(xì)胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞、HL-60(急性原髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、NB4(急性早幼粒白血病細(xì)胞株)、K562(慢性粒細(xì)胞性白血病急變期細(xì)胞株)、U-937(組織細(xì)胞淋巴瘤向單核巨噬細(xì)胞分化細(xì)胞株)、HEL(急性紅白血病細(xì)胞株)、Jurkat(急性T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、Raji(Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株，B淋巴細(xì)胞)、KM3(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株)。采用活細(xì)胞間接免疫熒光染色法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞膜抗原的表達(dá)，以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為陽性對(duì)照(參見圖8)，全骨髓細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞中可見散在的陽性細(xì)胞，其余細(xì)胞均為陰性。單克隆抗體ZUF10與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性結(jié)合可用于區(qū)分骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞與造血細(xì)胞，用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。
(2)單克隆抗體ZUF10在人間充質(zhì)組織及非間充質(zhì)組織中特異性的鑒定組織材料肌腱、韌帶、肌肉、血管壁、神經(jīng)、膽囊、皮膚、肺、肝、小腸、脂肪、骨髓，以上組織標(biāo)本均來自外科手術(shù)標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)，以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)塊的石蠟切片為陽性對(duì)照，骨髓組織中可見散在的陽性細(xì)胞(參見圖9)，其余組織均為陰性。
(3)單克隆抗體ZUF10在大鼠、小鼠、犬、兔、雞骨髓細(xì)胞及大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中特異性的鑒定細(xì)胞材料大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細(xì)胞及培養(yǎng)的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞。采用間接免疫熒光染色法檢測(cè)，以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細(xì)胞及培養(yǎng)的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞均為陰性，由此說明單克隆抗體ZUF10對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞有特異性。
實(shí)施例4單克隆抗體ZUF10在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用取體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以單克隆抗體ZUF10為探針，用間接流式細(xì)胞術(shù)分析間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子的表達(dá)。結(jié)果顯示明顯的陽性單峰(參見圖10)，間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子表達(dá)為82.17％～90.67％，傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞上ZUF10相應(yīng)抗原表達(dá)無顯著性差異。上述結(jié)果顯示單克隆抗體ZUF10與間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子有較高的特異性結(jié)合，可用于間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)和鑒定，并可定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量。以單克隆抗體ZUF10為探針用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，可用于研究骨髓中新鮮間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及臨床診斷。
實(shí)施例5單克隆抗體ZUF10在免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用將體外培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞爬片固定，用單克隆抗體ZUF10通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞相應(yīng)抗原的表達(dá)，結(jié)果顯示大于95％的細(xì)胞呈陽性(參見圖11)。同樣用ZUF10通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊及骨髓組織的石蠟切片中相應(yīng)抗原的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞團(tuán)塊中大于95％的細(xì)胞呈陽性、骨髓組織中有散在的陽性細(xì)胞(參見圖9)。單克隆抗體ZUF10用于免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)方法，可以作為一種間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記，對(duì)組織中間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行定位及定量的分析。
實(shí)施例6單克隆抗體ZUF10在免疫熒光染色法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用以單克隆抗體ZUF10為探針，結(jié)合FITC標(biāo)記的熒光二抗，采用間接免疫熒光染色法檢測(cè)體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示95％～100％的間充質(zhì)干細(xì)胞呈陽性(參見圖8)。單克隆抗體ZUF10可有效的應(yīng)用于免疫熒光染色法，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等工具可以有效的觀察間充質(zhì)干細(xì)胞中的相應(yīng)抗原的表達(dá)，進(jìn)一步研究該抗原在間充質(zhì)干細(xì)胞中的生物學(xué)特性。此外還可以用單克隆抗體ZUF10通過間接免疫熒光染色法檢測(cè)骨髓細(xì)胞及其他組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞。
實(shí)施例7用單克隆抗體ZUF10，通過免疫印跡法檢測(cè)相應(yīng)抗原的表達(dá)提取體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞總蛋白，用單克隆抗體ZUF10通過常規(guī)蛋白免疫印跡法檢測(cè)相應(yīng)抗原的表達(dá)，可見一特異性的陽性條帶(參見圖12)。通過免疫印跡的方法可以進(jìn)一步研究單克隆抗體ZUF10的相應(yīng)抗原在間充質(zhì)干細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)，及該抗原的生物學(xué)特性。
權(quán)利要求
1.抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，能與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞是由免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細(xì)胞系ZUF10，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體ZUF10，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNo.C200513，保藏日期為2005年8月30日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體的制備方法，其特征是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)免疫原的準(zhǔn)備以多供體來源的傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三～第五代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為動(dòng)物免疫的抗原。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用Ficoll-paque密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)獲得，目前公認(rèn)的人間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105陽性標(biāo)記出現(xiàn)單峰，造血細(xì)胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性，是一高度均質(zhì)細(xì)胞群；可以多次傳代，擴(kuò)增至第八代細(xì)胞數(shù)可達(dá)2～3×1010左右；通過體外定向誘導(dǎo)可分化為間充質(zhì)來源的的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，也能分化為其他胚層來源的細(xì)胞；所用的凍存方法在復(fù)蘇后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率高，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。(2)動(dòng)物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，免疫BALB/c小鼠，以期產(chǎn)生針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞共同識(shí)別位點(diǎn)的特異性單克隆抗體。每只小鼠以1.0×106細(xì)胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強(qiáng)免疫一次，3天后待融合。(3)雜交瘤細(xì)胞系的建立取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞以PEG介導(dǎo)融合。融合后細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接免疫熒光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對(duì)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細(xì)胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個(gè)月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，直到細(xì)胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10，在檢測(cè)人間充質(zhì)干細(xì)胞中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，其特征是以該單克隆抗體為探針，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓細(xì)胞懸液中的間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行定量分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質(zhì)干細(xì)胞相應(yīng)抗原的表達(dá)，并對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分布進(jìn)行定位分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，結(jié)合熒光二抗，用免疫熒光染色法標(biāo)記培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞、全骨髓細(xì)胞、其他細(xì)胞及組織冰凍切片的相應(yīng)抗原，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的相應(yīng)抗原的表達(dá)進(jìn)行定位和定量分析，并可檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中的分布。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，采用免疫印跡法檢測(cè)單克隆抗體ZUF10的相應(yīng)抗原在培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUF10。以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為抗原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗人間充質(zhì)干細(xì)胞的單克隆抗體，并建立了以該單克隆抗體為探針通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光染色、免疫印跡檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明為研究間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記提供了有效的工具，同時(shí)也為進(jìn)一步闡明間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性提供了平臺(tái)，并可推廣應(yīng)用于多種檢測(cè)技術(shù)以及臨床研究。
文檔編號(hào)C12N5/18GK1803843SQ20051006103
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者黃河, 沈建根, 來曉瑜, 羅依 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)