專利名稱：口蹄疫雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體、檢測(cè)試劑和試劑盒的制作方法
口蹄疫雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體、檢測(cè)試劑和試劑盒技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明系有關(guān)于一種生產(chǎn)抗口蹄疫病毒之單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、其單克隆抗體，及包含此單克隆抗體的免疫檢測(cè)試劑和試劑盒，特別是關(guān)于一種可用于夾心酶連接免疫吸附試驗(yàn)之生產(chǎn)抗口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體，以及包含此單克隆抗體的免疫檢測(cè)試劑和試劑盒。
背景技術(shù)：
口蹄疫(FMD ；foot-and-mouth diease)為偶蹄類動(dòng)物之高度傳染性疾病，主要感染的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物如牛，豬和綿羊?？谔阋叱Ｒ园l(fā)燒與嘴、舌頭、鼻孔、腳和乳頭的上皮水泡及腐爛等癥狀為特征?？谔阋卟《臼且粋€(gè)正股RNA病毒，隸屬于Picornaviridae科之 Aphthovirus屬，為小的無封套病毒，含有8. 5kbp基因可轉(zhuǎn)譯出結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPs)。 本病毒含有7種血清型，包括0、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分布在全世界，而每個(gè)血清型無交叉保護(hù)作用，F(xiàn)MDV在各個(gè)血清型之間由于具有高的突變速率因此演化的過程也是即為快速，其中于病毒的表面如VPl結(jié)構(gòu)蛋白為主要的中和部位是極具有可塑性 (Plasticity)及高抗原性變異。在1997年，臺(tái)灣爆發(fā)嚴(yán)重的口蹄疫疫情，由血清型0型病毒引起的(命名為0/TAW/97)。此株為非典型的嗜感染豬原型。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該株之非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)3A之一段(即93-102)密碼子缺損，此片段為決定病毒是否能于試管內(nèi)牛上皮細(xì)胞增殖之主要限制生長(zhǎng)因素，故此缺損片段之病毒株證實(shí)是造成0/YUN/TAW/97病毒株在牛只體內(nèi)毒力減弱的原因。在1997年爆發(fā)當(dāng)時(shí)，由于控制和貿(mào)易限制等而造成國(guó)家經(jīng)濟(jì)受到嚴(yán)重的影響(估計(jì)總值超過60億美元)。另一病毒株，在金門發(fā)現(xiàn)自亞臨床感染的動(dòng)物，病毒基因含有全長(zhǎng)的3A非結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)譯區(qū)，證實(shí)為牛型之強(qiáng)毒株(0/TAW/2/99)。0/ TAW/2/99 口蹄疫病毒為南亞血清0型的地理型(Topotype)，自1999年入侵臺(tái)灣。當(dāng)時(shí)疾病爆發(fā)后，立即采取檢疫措施，且在感染牧場(chǎng)中進(jìn)行篩除，并盡快銷毀處置感染的畜體。而預(yù)防性篩檢疑似感染牧場(chǎng)也同時(shí)列入防堵措施。
若以傳統(tǒng)不活化病毒生產(chǎn)方法之缺點(diǎn)為(1)由于口蹄疫為高度傳染性疾病，藉由空氣傳染，制備不活化病毒需使用到病毒，不僅實(shí)驗(yàn)室必須符合生物安全等級(jí)之三級(jí)負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室，而且實(shí)驗(yàn)過程中病毒有可能發(fā)生再活化，危險(xiǎn)性高。( 不活化病毒無法產(chǎn)生寄主于活體感染狀態(tài)下自然產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此檢測(cè)效能欠佳。發(fā)明內(nèi)容
本案系利用大腸桿菌細(xì)胞(E.coli.)來表達(dá)口蹄疫病毒之非結(jié)構(gòu)蛋白 (Non-Structural Protein, NSP)，利用親代細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而制成雜交瘤細(xì)胞株。 將0/TWA/99病毒株之3ABC基因應(yīng)用pRSET、pET 32、pET43及pBlueBacHis2等載體系統(tǒng)進(jìn)行克隆，再應(yīng)用大腸桿菌及桿狀病毒進(jìn)行蛋白質(zhì)之表達(dá)，以純化后之NSP作為抗原進(jìn)行酶結(jié)合免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ；ELISA)。特征在于能夠?qū)Ｒ恍员孀R(shí)動(dòng)物感染口蹄疫病毒后所產(chǎn)生的NSP抗體，本案所保護(hù)之技術(shù)標(biāo)的，包含針對(duì)FMDV5NSP的雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體，以及包含有該單克隆抗體之Sandwich ELISA檢測(cè)試劑或其試劑盒等。
而本案因應(yīng)安全性及有效性考慮，不使用病毒而系利用分子生物學(xué)技術(shù)，以非結(jié)構(gòu)重組蛋白的抗原決定位開發(fā)雜交瘤來生產(chǎn)單克隆抗體，此法不需用到病毒，可在二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，安全性高，而且該方法可以檢測(cè)NSP抗體，以正確分辨出活體感染口蹄疫病毒之個(gè)體。且經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其敏感性及特異性皆高于95%以上，顯示本案發(fā)明對(duì)于感染口蹄疫病毒之檢體有專一性，并可區(qū)別自然感染及疫苗免疫動(dòng)物產(chǎn)生之抗體。
本發(fā)明系提供一種雜交瘤細(xì)胞，系由親代細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而制成，其特征如保藏號(hào)為PTA-11304之細(xì)胞株所示，親代細(xì)胞系由原核細(xì)胞所表達(dá)之口蹄疫病毒之由 3ABC基因片段所編碼之NSP作為抗原免疫至小鼠，并將小鼠體內(nèi)之脾臟細(xì)胞取出而制成， 且雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)之單克隆抗體能夠?qū)Ｒ恍员孀R(shí)口蹄疫病毒之3ABC肽片段，且不會(huì)與豬水皰病(Swine vesicular disease ；SVD)抗血清產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
因此，本發(fā)明之主要目的為提供一種雜交瘤細(xì)胞株，由于其所生產(chǎn)之單克隆抗體對(duì)口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識(shí)能力，且不會(huì)與其它水皰性疾病抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)， 故可用于發(fā)展免疫快速檢測(cè)試劑之用途。
此外，本發(fā)明亦提供一種單克隆抗體，其特征在于其系由保藏號(hào)PTA-11304所產(chǎn)生，且可專一性辨識(shí)口蹄疫病毒之NSP 3ABC肽片段，且對(duì)于豬水皰病抗體無交叉反應(yīng)。
因此，本發(fā)明之主要目的為提供一種單克隆抗體，由于其對(duì)口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識(shí)能力，且不會(huì)與其它水皰性疾病抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故可用于發(fā)展免疫快速檢測(cè)試劑之用途。
又，本發(fā)明尚提供一種包含有上述單克隆抗體的免疫檢測(cè)試劑、免疫檢測(cè)試劑盒， 以及利用上述抗體之免疫檢測(cè)方法，由于所使用的單克隆抗體對(duì)口蹄疫病毒之3ABC肽具有專一性辨識(shí)能力，且不會(huì)與其它水皰性疾病抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故可用于發(fā)展免疫快速檢測(cè)試劑之用途。


圖1為Sandwich ELISA方法之解析圖。
符號(hào)說明
固相載體10
單克隆抗體11
樣本抗原12
待測(cè)檢體13
偵測(cè)抗體14
訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)15
受質(zhì)1具體實(shí)施方式
由于本發(fā)明系揭露一種雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體、利用前述單克隆抗體所制作之免疫檢測(cè)試劑及試劑盒，其中所利用之免疫學(xué)原理、細(xì)胞培養(yǎng)、染色及蛋白質(zhì)偵測(cè)等相關(guān)技術(shù)，已為相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域具有通常知識(shí)者所能明了，故以下文中之說明，不再作完整描述。同時(shí)，以下文中所對(duì)照之圖式，系表達(dá)與本發(fā)明特征有關(guān)之示意，并未亦不需要依據(jù)實(shí)際情形完整繪制，合先敘明。
本發(fā)明第一實(shí)施例系提供一種雜交瘤細(xì)胞株，可生產(chǎn)抗口蹄疫病毒之單克隆抗體，其流程如第1圖所示，系以Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞株與自BALB/c小鼠取得之親代細(xì)胞進(jìn)行制備，此雜交瘤細(xì)胞株之保藏號(hào)為PTA-11304，且其所生產(chǎn)之單克隆抗體可專一性辨識(shí)口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP。
本發(fā)明所提供之保藏號(hào)PTA-11304所示之雜交瘤細(xì)胞株，其親代細(xì)胞系依下列步驟所制備而得
步驟一首先，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)，針對(duì)口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP 3ABC基因進(jìn)行擴(kuò)增。其中，擴(kuò)增之目標(biāo)基因片段又以3ABC基因片段中的高度保守區(qū)域(Highly conserved region)為佳，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示，而其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
步驟二 將步驟中藉由反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)所得之3ABC基因片段構(gòu)建至pET 載體。完成序列確認(rèn)后，利用限制酶切割，將所得之目標(biāo)基因片段再構(gòu)建至PTH 162-B載體，將構(gòu)建完成后的PTH質(zhì)粒轉(zhuǎn)到(trangene)原核細(xì)胞中，并使其表達(dá)pTH 162-B中3ABC 基因片段所編碼的重組蛋白。此步驟所使用的原核細(xì)胞以大腸桿菌為佳。
步驟三將步驟二中利用原核細(xì)胞所表達(dá)而得的重組蛋白進(jìn)行純化后當(dāng)作免疫抗原，對(duì)BALB/c小鼠重復(fù)進(jìn)行注射，使其產(chǎn)生針對(duì)3ABC重組蛋白的免疫反應(yīng)。再將免疫后的 BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞取出，作為制備可生產(chǎn)抗口蹄疫病毒NSP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株之親代細(xì)胞。
將上述步驟所制備而得的親代細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株進(jìn)行融合而得到雜交瘤細(xì)胞。 利用間接酶結(jié)合免疫吸附試驗(yàn)(Indirect ELISA)及^festern印跡法(Western blotting) 篩選出其培養(yǎng)之上清液對(duì)于0/TAW/99病毒株之3ABC重組蛋白具有特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。
經(jīng)由上述步驟篩選后所得之雜交瘤細(xì)胞株，其生產(chǎn)出的單克隆抗體對(duì)于口蹄疫0/ TAW/99病毒株之NSP具有專一性辨識(shí)能力，前述之NSP包含有3ABC基因片段的高度保守區(qū)域所編碼之肽片段。
本發(fā)明之第二較佳實(shí)施例為單克隆抗體，具有保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 Φ ( ATCC , Patent Deposit Designation, jft tit =Manassas, VA, USA) 1 Ii ^ ^ PTA-11304(保藏日期2010年9月14日)之雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)的單克隆抗體之特征。由保藏號(hào)PTA-11304之雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)的單克隆抗體，對(duì)于口蹄疫病毒中屬于血清型0 型的0/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識(shí)能力，特別是對(duì)于NSP中3ABC基因中高度保守區(qū)域所編碼之肽片段具有專一性辨識(shí)能力，且對(duì)于豬水皰病(SVD)抗體無交叉反應(yīng)。
此外，由于制備本較佳實(shí)施例單克隆抗體之抗原系衍生自口蹄疫病毒0/TAW/99 病毒株中NSP之3ABC基因片段高度保守區(qū)域所編碼的重組蛋白，因此，經(jīng)由后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知，本較佳實(shí)施例所提供之單克隆抗體，亦可辨識(shí)屬于血清型如A型、C型、Asia 1型、 SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等的口蹄疫病毒。
又，為了得到高濃度及高純度的單克隆抗體，除了藉由活體外(In vitro)細(xì)胞培CN 102533663 A養(yǎng)技術(shù)以大量培養(yǎng)第一較佳實(shí)施例所提供的雜交瘤細(xì)胞株并收集其培養(yǎng)上清液之外，亦可將第一較佳實(shí)施例所提供的雜交瘤細(xì)胞株注入小鼠腹腔內(nèi)，收集所產(chǎn)生的腹水。無論藉由活體外細(xì)胞培養(yǎng)所收集而之上清液，或是自小鼠體內(nèi)收集而得的腹水，均可藉由適當(dāng)之純化過程(例如利用proteinA管柱層析法)，純化出本較佳實(shí)施例之單克隆抗體。
本發(fā)明之第三較佳實(shí)施例系為一種免疫檢測(cè)試劑，用于酶結(jié)合免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)中，藉以檢測(cè)待測(cè)抗體，其中包含有如第二較佳實(shí)施例中所描述的單克隆抗體。由于本較佳實(shí)施例之免疫檢測(cè)試劑中所含有的單克隆抗體系以小鼠脾臟細(xì)胞作為親代細(xì)胞而制得，屬于小鼠品系之IgG免疫球蛋白，故可配合其他適當(dāng)?shù)脑噭?，藉由Sandwich ELISA 以偵測(cè)待測(cè)之豬只檢體中是否含有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。
本發(fā)明之第四較佳實(shí)施例為一種免疫檢測(cè)試劑盒，藉由Sandwich ELISA以檢測(cè)豬只檢體中是否帶有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。本較佳實(shí)施例之免疫檢測(cè)試劑盒，包含有
(1)單克隆抗體，其特征如同第二較佳實(shí)施例所提供之單克隆抗體，對(duì)于口蹄疫 0/TAW/99病毒株NSP中3ABC基因片段所編碼之肽片段具有專一性辨識(shí)能力。此外，單克隆抗體11系以適當(dāng)濃度涂布于固相載體上。固相載體可以是微孔盤、微球體、雜交膜、或是試紙。
(2)偵測(cè)試劑，包含有偵測(cè)抗體及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)，偵測(cè)抗體可直接與訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)共軛結(jié)合。前述的訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)可以是放射性標(biāo)記物、磷光標(biāo)記物、冷光標(biāo)記物(化學(xué)冷光標(biāo)記物或生物冷光標(biāo)記物)、熒光標(biāo)記物，或是酶；適合本較佳實(shí)施例的酶可以是過氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、堿性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。而在訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)是酶的狀況下，偵測(cè)抗體是與生物素(Biotin)共軛結(jié)合，另外訊號(hào)偵測(cè)物質(zhì)則以酶形式與抗生物素蛋白連接。
(3)樣本抗原，系衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株之NSP中3ABC基因高度保守區(qū)域所編碼之重組蛋白。
此外，本較佳實(shí)施例所提供之免疫檢測(cè)試劑盒，可進(jìn)一步包含有受質(zhì)，受質(zhì)可與酶反應(yīng)而發(fā)生呈色反應(yīng)。受質(zhì)的種類與試劑盒中所選用的酶系統(tǒng)有關(guān)，例如酶為 HRP 時(shí)，受質(zhì)以 ABTS(2，2 ‘ -azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6_sulfonate)) 為佳；而當(dāng)酶為AP時(shí)，選用的受質(zhì)則以溶解于DEA (Diethanolamine)緩沖溶液中的 PNPP(Para-nitrophenylphosphate)為{圭。
又，本較佳實(shí)施例之免疫檢測(cè)試劑盒亦可進(jìn)一步包含有沖洗試劑(Wash reagent)，沖洗未附著于固相載體的單克隆抗體，或是將未與單克隆抗體產(chǎn)生專一性結(jié)合的樣本抗原、待測(cè)樣本之雜質(zhì)、偵測(cè)抗體及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)沖洗出來，避免上述物質(zhì)殘留而造成檢測(cè)結(jié)果之誤差甚至是偽陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。沖洗試劑的組成則可為磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(TBS)、Tween 20，或是上述溶液的任意組合。
本較佳實(shí)施例之免疫檢測(cè)試劑盒亦可進(jìn)一步包含有阻隔試劑(Blocking reagent)，將固相載體中未結(jié)合單克隆抗體之位置加以阻隔，以避免后續(xù)添加之樣本抗原、 待測(cè)樣本、偵測(cè)抗體及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)附著所造成的偽陽(yáng)性訊號(hào)。阻隔試劑則以包含有蛋白質(zhì)為佳，蛋白質(zhì)可以是牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)、動(dòng)物明膠(Gelatin)，或是前述蛋白質(zhì)的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳做為本較佳實(shí)施例之阻隔試劑。
本發(fā)明亦提供一種免疫檢測(cè)方法，如下述第四較佳實(shí)施例所示，系利用ELISA來檢測(cè)待測(cè)抗體。請(qǐng)參閱第1圖，為本實(shí)施例所利用之Sandwich ELISA方法之解析圖。免疫檢測(cè)方法包含有下列步驟
步驟一提供固相載體10。
步驟二 提供單克隆抗體11，具有如第二較佳實(shí)施例所提供之單克隆抗體的特征，為保藏于美國(guó)ATCC Intent Deposit Designation保藏號(hào)為PTA-11304之雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)，且對(duì)于口蹄疫病毒中屬于血清型0型的0/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識(shí)能力，特別是對(duì)于NSP中3ABC基因中高度保守區(qū)域所編碼之肽片段具有專一性辨識(shí)能力。
步驟三將步驟二所提供單克隆抗體11施加(Applying)至固相載體10上。
步驟四提供樣本抗原12，樣本抗原12系與步驟二所提供之單克隆抗體11進(jìn)行專一性結(jié)合。樣本抗原12則以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的NSP為佳，又以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的3ABC基因之重組蛋白為更佳。
步驟五提供待測(cè)檢體13。將待測(cè)檢體13施加于固相載體10上，且待測(cè)檢體13 可操作性地與步驟四所提供的樣本抗原12進(jìn)行免疫反應(yīng)，藉以于固相載體10上與單克隆抗體11及樣本抗原12共同形成免疫復(fù)合物。
步驟六提供偵測(cè)試劑，偵測(cè)試劑可操作性地與于步驟五中所形成的免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫反應(yīng)，藉以產(chǎn)生訊號(hào)。
步驟七偵測(cè)由步驟6中所產(chǎn)生的訊號(hào)。
此外，本較佳實(shí)施例中，步驟六所提供的偵測(cè)試劑，可進(jìn)一步包含有偵測(cè)抗體14 與訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)15 ；偵測(cè)抗體14與訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)15之特征、相互連結(jié)關(guān)系，以及選用種類與第四較佳實(shí)施例中所述大致相同，在此不再贅述。
本較佳實(shí)施例亦可進(jìn)一步包含提供沖洗試劑之步驟，將步驟三中未附著于固相載體10上的單克隆抗體11，或是將步驟四中未與單克隆抗體11產(chǎn)生專一性結(jié)合的樣本抗原 12、步驟六中待測(cè)檢體13所帶有之雜質(zhì)，步驟六中未與形成于步驟五中的免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫反應(yīng)的偵測(cè)抗體14及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)15沖洗出來，避免上述物質(zhì)殘留而造成檢測(cè)結(jié)果之誤差甚至是偽陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。而沖洗試劑可為PBS、TBS、Tween 20，或是上述溶液的任思組合。
此外，若是步驟六所提供的偵測(cè)試劑包含有以酶作為其訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)15，則需要另外加入與所提供酶產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受質(zhì)16。例如當(dāng)使用HRP需使用ABTS作為其受質(zhì)， 而當(dāng)使用AP時(shí)，其受質(zhì)則以溶于DEA溶劑的PNPP為佳；此外，依據(jù)步驟六所使用的酶與受質(zhì)的種類，需要有不同的偵測(cè)方法來偵測(cè)這些由不同系統(tǒng)所產(chǎn)生的訊號(hào)。例如當(dāng)使用 HRP作為酶及ABTS作為受質(zhì)的呈色系統(tǒng)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果系利用各待測(cè)樣本在波長(zhǎng)為450nm或 460nm下的吸收光譜加以判定；而當(dāng)使用AP作為酶及PNPP及DEA作為受質(zhì)的呈色系統(tǒng)時(shí)， 檢測(cè)結(jié)果則利用各待測(cè)樣本在波長(zhǎng)為430nm下的吸收光譜加以判定。
本較佳實(shí)施例亦可進(jìn)一步包含提供阻隔試劑之步驟，此步驟之目的在于將固相載體在步驟三之后未結(jié)合單克隆抗體之位置加以阻隔，以避免后續(xù)于步驟四、五及六中添加之樣本抗原、待測(cè)檢體、偵測(cè)抗體及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)直接附著于固相載體上所造成的偽陽(yáng)性訊號(hào)。阻隔試劑則以包含有蛋白質(zhì)為佳，蛋白質(zhì)可以是BSA、酪蛋白、動(dòng)物明膠，或是前述蛋白質(zhì)的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳作為本較佳實(shí)施例所提供的阻隔試劑。
本發(fā)明另提供下列實(shí)驗(yàn)例作為本發(fā)明之進(jìn)一步說明，但并非作為本發(fā)明之限制。
實(shí)驗(yàn)例1 材料與方法
1. 1 血清
為測(cè)試檢測(cè)之靈敏度，自年齡為8周的豬只且經(jīng)過口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株試驗(yàn)攻毒感染后34天的豬只采集32個(gè)口蹄疫陽(yáng)性(FMD-positive)豬只血清樣本。
為比較本發(fā)明所提供之夾心ELISA檢測(cè)試劑盒與其他三種商售之ELISA檢測(cè)試劑盒，系自32頭不帶特定致病原(Specific-pathogen-free ；SPF)且經(jīng)實(shí)驗(yàn)性感染口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株的豬只采集其血清樣本，共計(jì)320個(gè)。前述320個(gè)血清樣本的采集時(shí)間點(diǎn)為感染病毒后第0、2、4、6、8、10、14、21、28，以及第34天。此外，30個(gè)血清樣本采集自以口蹄疫0/TAW/97病毒株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性感染后觀天的豬只亦并同測(cè)試。
為測(cè)試專一性，自未感染之豬只采集255個(gè)血清樣本，以及自施打過疫苗的豬只中采集了 165個(gè)血清樣本。自未感染之豬只所采集到的255個(gè)血清樣本其中有96個(gè)系自 SPF豬只體內(nèi)采集而得，其余159個(gè)則采集自1997年口蹄疫疫情爆發(fā)前未感染之豬只。自施打過疫苗的豬只中所采集到的165個(gè)血清樣本，系自165未經(jīng)感染且施打過2次市售0 血清型口蹄疫病毒疫苗的豬只體內(nèi)所采集而得。
此外，為評(píng)估本發(fā)明所提供的Sandwich ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)豬水皰病毒(Swine vesicular disease virus ；SVDV)可能發(fā)生的交叉反應(yīng)(Cross-reactivity)，以及為了要證實(shí)本發(fā)明所提供的Sandwich ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)不同血清型口蹄疫病毒之間的交叉反應(yīng)，使用 6 個(gè)抗 SVDV 的抗血清(Antiserum) (UKG/27/72strain EU SVD reference serum batch 2002)以及6個(gè)牛只的抗不同血清型(血清型A、C、Asia USAT USAT 2、SAT3) 口蹄疫病毒的抗血清系來自英國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生研究所(Institute for Animal Health,Pirbright, United Kingdom)產(chǎn)制。
恢復(fù)期中的豬只血清是由實(shí)驗(yàn)性感染0/TAW/97及0/TAW/99病毒株的豬只，在感染觀天后分別取得，其血清中和抗體效價(jià)(SN titer)分別為1 256與1 512，作為 Wfestern印跡法(Western blotting)及Sandwich ELISA中所使用的陽(yáng)性對(duì)照組，另陰性對(duì)照組系為SPF豬只血清。
1. 2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)引物設(shè)計(jì)
一引物對(duì)(Primer pair)系設(shè)計(jì)用來自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株基因體擴(kuò)增其3ABC基因區(qū)域的核酸片段(GenBank accession No. AJ539137之第5595號(hào)至第6119號(hào)核苷酸區(qū)域，其詳細(xì)序列如SEQ ID NO :1所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。其正向引物(Forward primer)其序列為5 ‘ -CACCGGATCCTGTCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAG-3 ‘， 其中包含有BamHI限制酶之酶切位點(diǎn)；而其反向引物(Reverse-primer)之序列為5' -CC CGAATTCGCACGTCTTCCCGTCGAGGATGAGCTC-3 ‘，其中包含有 EcoRI 限制酶之酶切位點(diǎn)。
1. 3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)
反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)混合物系利用Superscript One-Step RT-PCRSystem 以及Platinum Pfx DNA Polymerase 制備而得，而反應(yīng)系利用 GeneAmp PCR system MOOthermocycler熱循環(huán)機(jī)中進(jìn)行；而反應(yīng)進(jìn)行溫度及時(shí)程如下首先將反應(yīng)樣本培育于7/13 頁(yè)420C中40分鐘，接著再于90 95°C中進(jìn)行50秒的預(yù)加熱變性(Pre-denaturation)，接著再重復(fù)進(jìn)行30 40次的下列熱循環(huán)于90 95°C中加熱變性(Denaturation) 30秒，于 50 55°C中退火(Annealing) 30秒，于68 72°C中延伸(Extension) —分鐘。最后再于 72°C中延伸七分鐘，并設(shè)定將樣本保持于4°C。經(jīng)上述反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)所得之產(chǎn)物系保存于-20°C中，直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。其中10微升(yL)的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)產(chǎn)物系經(jīng)由2%的瓊脂電泳分析，并且利用STORSafe DNA gel stain染劑，于一倍的TAE緩沖溶液中染色，并于UV光中進(jìn)行顯色。
1. 4 口蹄疫病毒3ABC基因之克隆(Cloning)
首先，利用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit實(shí)驗(yàn)試劑盒將瓊脂凝膠中的產(chǎn)物純化取出，再利用適當(dāng)?shù)南拗泼?BamHl與EcoRl)進(jìn)行處理后，與pET vector進(jìn)行粘接，以制得一完整之表達(dá)載體。將前述表達(dá)載體導(dǎo)入BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，并培養(yǎng)于添加 100微克/毫升(μ g/mL)氨芐西林(Ampicillin)的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)皿中。將生長(zhǎng)出的陽(yáng)性菌落挑選出來，并利用Miniprep Kit試驗(yàn)試劑盒萃取各菌落的質(zhì)粒，且篩選出帶有3ABC基因片段的質(zhì)粒樣本。最后，將篩選出的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，以確認(rèn)該質(zhì)粒樣本所帶有的3ABC基因片段之核酸序列。
1. 5 口蹄疫病毒3ABC多肽于大腸桿菌中之表達(dá)與純化
將大腸桿菌以所制得的pTH 162-B質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，于添加100微克/毫升 (μ g/mL) Ampici 11 in的Luria-Bertani培養(yǎng)液在37 V中劇烈搖晃進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至中對(duì)數(shù)期(Mid-logarithmic phase)時(shí)，于培養(yǎng)液中添加異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropylthiogalactoside ；IPTG)，使其最終濃度為一毫摩爾濃度(mM)，并將培養(yǎng)液繼續(xù)培育4小時(shí)，以誘導(dǎo)3ABC多肽之表達(dá)。接著利用離心方式收集將大腸桿菌菌體，并加入細(xì)菌蛋白萃取試劑或超聲波震蕩法將菌體裂解。在裂解物中的可溶性的3ABC多肽系利用 His-Tag親和性層析管柱(Affinity chromatography column)加以純化，最后定量純化所得之產(chǎn)物。
1. 6 =SDS膠體電泳與Western印跡分析
經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)例1. 5純化所得之3ABC多肽，系經(jīng)由12% SDS膠體電泳加以分析； 經(jīng)過12% SDS膠體電泳之后，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印于PVDF硝化纖維濾紙之上，利用Western印跡法分析其對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性豬只血清之血清反應(yīng)性。Western印跡法之步驟系使用的第一抗體為適當(dāng)稀釋之陽(yáng)性豬只血清，而第二抗體為適當(dāng)稀釋之帶有堿性磷酸酶的山羊抗豬(Goat anti-swine) IgG 抗體。最后利用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)與氮藍(lán)四唑(Nitro blue tetrazolium)作為堿性磷酸酶之受質(zhì)及呈色物質(zhì)。
1. 7 病毒中和測(cè)試
為確認(rèn)用來作為陽(yáng)性血清組經(jīng)實(shí)驗(yàn)性感染豬只的感染情形，感染病毒株的豬只，其血清收集后均依照國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties ； OIE)-陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)及疫苗手冊(cè)(Manual ofDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)之方法進(jìn)行病毒中和測(cè)試。
1. 8 小鼠免疫與抗3ABC單克隆抗體之制備
生產(chǎn)抗3ABC重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株系經(jīng)由下列方法制備以皮下注射的方式將200微克經(jīng)由實(shí)驗(yàn)例1. 5所制備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/11c小鼠，免疫間隔為4周。在進(jìn)行細(xì)胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate-buffered saline)中以皮下注射方式對(duì)小鼠進(jìn)行補(bǔ)強(qiáng)注射(Boost)。 將免疫后之BALB/c小鼠犧牲后取出其脾臟，并將取得之脾臟細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合以制得雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過兩周后，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重組蛋白的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Indirect ELISA)，針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選；此外，亦利用Western印跡法針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選，其方法與實(shí)驗(yàn)例 1. 6中所述相同。經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析后，將測(cè)試結(jié)果陽(yáng)性/陰性比例(Positive/ negative (P/N)ratio)大于2的雜交瘤細(xì)胞株挑選出進(jìn)行放大培養(yǎng)。經(jīng)判定為會(huì)生產(chǎn)抗 3ABC抗體之雜交瘤細(xì)胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產(chǎn)生之腹水。最后利用 Affi-Gel protein A管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升(mg/mL)。
1. 9 夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Sandwich ELISA)
針對(duì)口蹄疫病毒株血清型0型的Sandwich ELISA(如圖一所示)系建立來對(duì)口蹄疫NSP之抗血清進(jìn)行定量。一般來說，系先在微孔盤(Nunc Maxisorb)上涂布單克隆抗體，并以酸堿值9. 6且0.06摩爾濃度(M)的碳酸/碳酸氫鹽緩沖溶液作為涂布緩沖液，涂布后培育于4°C下直至隔夜；單克隆抗體并依棋盤式滴定方式涂布于微孔盤，以決定單克隆抗體(CmA40)對(duì)口蹄疫病毒0型NSP之最佳濃度。涂布完成后，將以稀釋液進(jìn)行最佳稀釋之口蹄疫病毒0型非結(jié)構(gòu)重組蛋白加入微孔盤中，在37°C中培育一小時(shí)。之后，將以阻隔緩沖液適當(dāng)稀釋后的豬只血清取100微升加入微孔盤中，在37°C中培育一小時(shí)。將連接有HRP的山羊抗豬IgG抗體(HRP conjugated-goat anti-swine IgG)以阻隔緩沖液稀釋后，在微孔盤中各反應(yīng)孔中加入100微升。之后，使用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(3，3，，5， 5，-tetramethylbenzidine ；TMB)作為受質(zhì)，并在室溫中反應(yīng)呈色10至15分鐘。最后，在各反應(yīng)孔中加入50微升，1. 0摩爾濃度的硫酸以停止呈色反應(yīng)，測(cè)量各反應(yīng)孔中波長(zhǎng)450nm 的OD值。上述各步驟中有在37°C中培育一小時(shí)者，之后再以清洗液清洗6次。
1. 10 偵測(cè)抗口蹄疫病毒NSP抗體的ELISA試劑盒之比較
本發(fā)明亦比較三種市售酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒與本發(fā)明所提供之免疫檢測(cè)試劑盒，對(duì)于抗口蹄疫病毒NSP之抗體偵測(cè)能力的差異。Ceditest FMDV-NS檢測(cè)試劑盒 (Cedi-Diagnostics B. V. , Lelystad,Netherlands)為阻隔型(Blocking)酶連接免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，UBI FMD NS EIA檢測(cè)試劑盒(United Biomedical Inc. , Hauppauge,New York, USA)系為利用人工合成之3B肽的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，CHEKIT FMD-3ABC檢測(cè)試劑盒(IDEXX Laboratories Inc. , ffestbrook, Maine, USA)系為利用大腸桿菌表達(dá) 3ABC 多肽的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒。上述檢測(cè)試劑盒之使用系依照各試劑盒制造商之使用說明。
實(shí)驗(yàn)例2 大腸桿菌表達(dá)3ABC重組蛋白
口蹄疫病毒0/TAW/993ABC基因序列系取自美國(guó)國(guó)家生技資訊中心(NCBI) GenBank 資料庫(kù)中，GenBank accession No. AJ539137，第 5595 號(hào)至第 6119 號(hào)核苷酸區(qū)域，其詳細(xì)序列如SEQ ID NO :1所示，其中包含有525個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的編碼區(qū)域(Coding region)，故其編碼之重組蛋白為175個(gè)氨基酸長(zhǎng)(序列如SEQ ID NO 2所示)。比較近來自亞洲、非洲與歐洲所分離出的泛亞洲(Pan-Asia) 口蹄疫病毒株血清型0型的基因組序列，其基因一致性約在97%至99%。
將上述經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)所擴(kuò)增而得之DNA片段，插入pETvector表達(dá)載體。將前述表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21DE3株系感受態(tài)細(xì)胞，并培養(yǎng)于添加100微克 /毫升Ampicillin的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)皿中，挑選出陽(yáng)性菌落，并萃取出帶有3ABC 基因插入片段的質(zhì)粒。
將帶有3ABC基因插入片段的質(zhì)粒送入大腸桿菌BL21DE3菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并于添加 100微克/毫升Ampicillin的Luria-Bertani培養(yǎng)液在37°C中劇烈搖晃進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至中對(duì)數(shù)期時(shí)，于培養(yǎng)液中添加異丙基硫代半乳糖苷，使其最終濃度為一毫摩爾濃度，并將培養(yǎng)液繼續(xù)培育4小時(shí)，以誘導(dǎo)3ABC重組蛋白之表達(dá)。表達(dá)出的3ABC重組蛋白系利用親合性層析管柱加以純化，純化所得之3ABC重組蛋白經(jīng)由12% SDS膠體電泳及Western印跡法加以分析。Western印跡分析之結(jié)果顯示，經(jīng)由上述方法表達(dá)之蛋白其大小為40kDa， 且證實(shí)會(huì)與抗口蹄疫病毒之抗血清產(chǎn)生反應(yīng)(結(jié)果未示)。經(jīng)定量后，純化所得之3ABC之重組蛋白濃度約為11. 2毫克/毫升。
實(shí)驗(yàn)例3 小鼠免疫與抗3ABC單克隆抗體之制備
生產(chǎn)抗3ABC重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株系經(jīng)由下列方法制備以皮下注射的方式將200微克經(jīng)由實(shí)驗(yàn)例1. 5所制備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/ c小鼠，免疫間隔為4周。在進(jìn)行細(xì)胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩沖溶液中以皮下注射方式對(duì)小鼠進(jìn)行補(bǔ)強(qiáng)注射。將免疫后之BALB/c小鼠犧牲后取出其脾臟，并將取得之脾臟細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合以制得雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過兩周后，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重組蛋白的間接酶結(jié)合免疫吸附試驗(yàn)，針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選；此外，亦利用Western印跡法針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選，其步驟方法與實(shí)驗(yàn)例2中所述相同。經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析后，將測(cè)試結(jié)果陽(yáng)性/陰性比值(Positive/negative (P/N) ratio)大于2的雜交瘤細(xì)胞株挑選出進(jìn)行放大培養(yǎng)。經(jīng)判定為會(huì)生產(chǎn)抗3ABC抗體之雜交瘤細(xì)胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產(chǎn)生之腹水。最后利用Affi-Gel protein A(Millipore)管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升。
實(shí)驗(yàn)例4 =Sandwich ELISA 之判讀
為確保各測(cè)試間品質(zhì)控制血清測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定，各Sandwich ELISA的96孔測(cè)試盤中無論陽(yáng)性血清與陰性血清均做二重復(fù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)18個(gè)測(cè)試之結(jié)果，陽(yáng)性血清測(cè)試結(jié)果為 0. 90士0. 09，變異系數(shù)指標(biāo)為9. 78%;陰性血清之測(cè)試結(jié)果為0. 09士0. 02，變異系數(shù)指標(biāo)為 24.33%。共有770個(gè)測(cè)試血清OD45tlnm之測(cè)試結(jié)果皆以標(biāo)準(zhǔn)化呈現(xiàn)。陰性豬只血清共計(jì)觀7 個(gè)，其中包含有255件樣本由未感染之豬只所采集，而有32件樣本由感染后第0天之豬只所采集；前述觀7件陰性血清樣本與62頭實(shí)驗(yàn)性感染的豬只共同用來決定本發(fā)明所提供之 Sandwich ELISA 結(jié)果的決定值(Cut-off value)。
本發(fā)明所提供之免疫檢測(cè)試劑盒的專一性確定測(cè)試系測(cè)試了 96頭SPF豬只體內(nèi)采集之血清。所有測(cè)試樣本的OD45tlnm讀值最大頻度分布均小于0. 15，其中部份測(cè)試樣本的 OD450nm讀值最大頻度分布高于0. 06至0. 11。此外，自經(jīng)疫苗接種免疫之豬只所采集而得之血清樣本，其測(cè)試結(jié)果的OD45tlnm讀值均小于0. 22。因此，決定值系定于OD45tlnm讀值為0. 22。 亦即，當(dāng)待測(cè)樣本測(cè)試結(jié)果的OD45tlnm讀值小于0. 22時(shí)，則該測(cè)試結(jié)果判定為為陰性；而當(dāng)待測(cè)樣本測(cè)試結(jié)果的OD45tlnm讀值大于或等于0. 22時(shí)，則該測(cè)試結(jié)果判定為陽(yáng)性。測(cè)試結(jié)果如表一所示。
表一
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，系由親代細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而制成，其特征如保藏號(hào)為 PTA-11304之細(xì)胞株所示，該親代細(xì)胞系由原核細(xì)胞所表達(dá)之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所編碼之非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原免疫至小鼠，并將該小鼠體內(nèi)之脾臟細(xì)胞取出而制成，且該雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)之單克隆抗體能夠?qū)Ｒ恍员孀R(shí)口蹄疫病毒之該3ABC肽，且對(duì)于豬水皰病抗血清不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之雜交瘤細(xì)胞株，系制備自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株，其分泌的單克隆抗體同時(shí)對(duì)0/TAW/97病毒株會(huì)產(chǎn)生專一性的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述之雜交瘤細(xì)胞株，該非結(jié)構(gòu)蛋白系衍生自該口蹄疫病毒2C、3A、 3AB、;3BC 及 3ABC 基因片段之一高度保守區(qū)域(highly conserved region)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述之雜交瘤細(xì)胞株，該非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC基因片段之該高度保守區(qū)域具有如SEQ ID NO :1之核酸與氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之雜交瘤細(xì)胞株，該小鼠系為Balb/c品系小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述之雜交瘤細(xì)胞株，該原核細(xì)胞系為大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述之雜交瘤細(xì)胞株，該單克隆抗體同時(shí)對(duì)于0型以外的口蹄疫病毒如血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等皆有專一性反應(yīng)。
8.一種單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體系由權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述之雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生，且對(duì)于口蹄疫病毒之3ABC肽具有專一性辨識(shí)能力，而對(duì)于豬水皰病之抗血清不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述之單克隆抗體，其特征在于該口蹄疫病毒系為血清型0型(0 serotype)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述之單克隆抗體，其特征在于該口蹄疫病毒系為0/TWA/99病毒株。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述之單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體對(duì)于口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型有交叉反應(yīng)，即可辨識(shí)口蹄疫七種血清型。
12.一種免疫檢測(cè)試劑，系用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，藉以檢測(cè)一待測(cè)抗原，其特征在于該免疫檢測(cè)試劑包含有權(quán)利要求9所述之單克隆抗體。
13.如權(quán)利要求12所述之免疫檢測(cè)試劑，該待測(cè)抗原系為抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗 # (anti-3ABC antibody)。
14.一種免疫檢測(cè)試劑盒，系利用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)待測(cè)檢體中的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體(anti-3ABC antibody)，其特征在于該免疫檢測(cè)試劑盒包含有如權(quán)利要求8所述之單克隆抗體及偵測(cè)試劑。
15.如權(quán)利要求14所述之免疫檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含有抗原樣本，該抗原樣本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC肽。
16.如權(quán)利要求14所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該偵測(cè)試劑包含有偵測(cè)抗體及訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求16所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該偵測(cè)抗體與該訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)系為共軛結(jié)I=I O
18.如權(quán)利要求16所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)系選自下列所構(gòu)成的群組之一放射性標(biāo)記物、磷光標(biāo)記物、冷光標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物及酶。
19.如權(quán)利要求18所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該冷光標(biāo)記物系為化學(xué)冷光標(biāo)記物或生物冷光標(biāo)記物。
20.如權(quán)利要求18所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該酶系選自下列所構(gòu)成的群組之一過氧化S酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、堿性磷酸酶(Alkaline Phospatase ；AP)、以及 Beta-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase)。
21.如權(quán)利要求20所述之免疫檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含有生物素及抗生物素蛋白，該生物素系與該偵測(cè)抗體連接，且該抗生物素蛋白系與該酶連接。
22.如權(quán)利要求21所述之免疫檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含有受質(zhì)，該受質(zhì)可與該酶反應(yīng)而發(fā)生呈色反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求14所述之免疫檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含有沖洗試劑，該沖洗試劑系選自下列所構(gòu)成的群組之試劑及其組合磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(TBS)以及 Tween 20。
24.如權(quán)利要求14所述之免疫檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含阻隔試劑，藉以阻隔固相載體上未結(jié)合該單克隆抗體之位置。
25.如權(quán)利要求M所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該固相載體系選自下列所構(gòu)成的群組之一微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
26.如權(quán)利要求M所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該阻隔試劑系包含有蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)系選自下列所組成的群組之試劑及其組合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及動(dòng)物明膠(Gelatin)。
27.如權(quán)利要求M所述之免疫檢測(cè)試劑盒，該阻隔試劑系為脫脂牛乳。
28.一種免疫檢測(cè)方法，系利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，包含有下列步驟提供固相載體(Solid phase carrier)； 提供單克隆抗體，該單克隆抗體具有權(quán)利要求8所述之特征； 將該單克隆抗體施加(Applying)至該固相載體； 提供樣本抗原，該樣本抗原系與該單克隆抗體進(jìn)行專一性結(jié)合； 提供待測(cè)檢體，該待測(cè)檢體可操作性地與該樣本抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，藉以于該固相載體上形成一免疫復(fù)合物；提供偵測(cè)試劑，該偵測(cè)試劑可操作性地與該免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生訊號(hào)；以及偵測(cè)該訊號(hào)。
29.如權(quán)利要求28所述之免疫檢測(cè)方法，該抗原樣本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC基因。
30.如權(quán)利要求觀所述之免疫檢測(cè)方法，該偵測(cè)試劑包含有偵測(cè)抗體與訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)。
31.如權(quán)利要求30所述之免疫檢測(cè)方法，該偵測(cè)抗體系與該訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)共軛結(jié)合。
32.如權(quán)利要求30所述之免疫檢測(cè)方法，該訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)系選自下列所構(gòu)成的群組之一放射性標(biāo)記物、磷光標(biāo)記物、冷光標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物及酶。
33.如權(quán)利要求32所述之免疫檢測(cè)方法，該冷光標(biāo)記物系為化學(xué)冷光標(biāo)記物或生物冷光標(biāo)記物。
34.如權(quán)利要求32所述之免疫檢測(cè)方法，該酶系選自下列所構(gòu)成的群組之一過氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、堿性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 Beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。
35.如權(quán)利要求32所述之免疫檢測(cè)方法，該訊號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)進(jìn)一步包含有生物素及抗生物素蛋白，該生物素系與該偵測(cè)抗體連接，請(qǐng)?jiān)摽股锼氐鞍紫蹬c該酶連接。
36.如權(quán)利要求35所述之免疫檢測(cè)方法，進(jìn)一步包含有提供受質(zhì)之步驟，該受質(zhì)可與該酶反應(yīng)而發(fā)生呈色反應(yīng)。
37.如權(quán)利要求觀所述之免疫檢測(cè)方法，進(jìn)一步包含有提供沖洗試劑之步驟，該沖洗試劑系選自下列所構(gòu)成的群組之試劑及其組合磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(TBS)以及Tween 20。
38.如權(quán)利要求觀所述之免疫檢測(cè)方法，該固相載體系選自下列所構(gòu)成的群組之一 微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
39.如權(quán)利要求觀所述之免疫檢測(cè)方法，進(jìn)一步包含有提供阻隔試劑(Blocking reagent)之步驟，藉以阻隔該固相載體上未結(jié)合該單克隆抗體之位置。
40.如權(quán)利要求39所述之免疫檢測(cè)方法，該阻隔試劑系包含有蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)系選自下列所組成的群組之試劑及其組合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及動(dòng)物明膠。
41.如權(quán)利要求39所述之免疫檢測(cè)方法，該阻隔試劑系為脫脂牛乳。
全文摘要
本發(fā)明系提供一種雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體、包含前述單克隆抗體之免疫檢測(cè)試劑及試劑盒，以及免疫檢測(cè)方法。雜交瘤細(xì)胞株系由親代細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而制成，其特征如保藏號(hào)為PTA-11304之細(xì)胞株所示，該親代細(xì)胞系由原核細(xì)胞所表達(dá)之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所編碼之非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原免疫至小鼠，并將該小鼠體內(nèi)之脾臟細(xì)胞取出而制成，且該雜交瘤細(xì)胞株所生產(chǎn)之單克隆抗體能夠?qū)Ｒ恍员孀R(shí)口蹄疫病毒之該3ABC肽，且不會(huì)與豬水皰病抗血清產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N5/18GK102533663SQ201010588900
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者李璠, 潘居祥, 鐘明華, 陳姿菡 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院