專利名稱：具有特定單核苷酸多態(tài)性的th基因及其檢測方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有特定單核苷酸多態(tài)性的基因及其檢測方法和用途，特別涉及一種具有特定單核苷酸多態(tài)性的酪氨酸羥化酶(TH)基因及其檢測方法和用途。
背景技術(shù)：
高血壓病是一種危害人類健康的常見多發(fā)病，其引起的冠心病和腦卒現(xiàn)已成為人類因病致死的首要病因。目前迫切需要能夠預(yù)防、診斷或治療原發(fā)性高血壓的有效方法和藥物。雖然人類為高血壓的研究投入了大量的人力和物力，但迄今為止關(guān)于高血壓的發(fā)病機理尚未完全闡明，也沒有有效的預(yù)防、診斷及治療方法。既往的流行病學(xué)和臨床研究表明高血壓病具有明顯的家族聚集傾向，說明高血壓病與遺傳因素密切相關(guān)。從分子生物學(xué)觀點來看，一些基因結(jié)構(gòu)異常和/或表達異常是高血壓病的根本原因，其中基因突變、基因移位和基因調(diào)控異常起著相當(dāng)大的作用?，F(xiàn)人們認(rèn)為腎素基因異常、血管緊張素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因和原癌基因可能與高血壓形成有關(guān)。
酪氨酸羥化酶，英文tyrosine hydroxylase，縮寫TH，別名縮寫TYH，蛋白產(chǎn)物見表1。
表1、酪氨酸羥化酶基因蛋白產(chǎn)物的4種異構(gòu)體

已知酪氨酸羥化酶基因定位在人類染色體11p15.5，在人類基因組上只有1個拷貝，包含14個主要的外顯子，長度大約為8K堿基對(請參見圖1所示)。在基因表達中它的第一個內(nèi)含子內(nèi)發(fā)生的RNA可變剪接產(chǎn)生了至少3種不同的mRNA，這些不同的mRNA的差異在于12個堿基對和18個堿基對的插入或缺失。在神經(jīng)系統(tǒng)的不同部分酪氨酸羥化酶的基因表達存在差異。
酪氨酸羥化酶催化苯丙氨酸(phenylalanine)轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?dopamine)，是兒茶酚胺(catecholamines)生物合成步驟中的限速酶，在腎上腺素激導(dǎo)性神經(jīng)的生理過程中起著關(guān)鍵作用。酪氨酸羥化酶與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如精神分裂癥、情感性精神障礙和尼古丁依賴癥的關(guān)系已有了廣泛的研究。目前針對高血壓與酪氨酸羥化酶關(guān)聯(lián)關(guān)系的研究并不多，有限的幾個實驗均只涉及了酪氨酸羥化酶基因第一個內(nèi)含子內(nèi)TCAT重復(fù)序列和位于第2個外顯子里的Val81Met多態(tài)性位點，但是酪氨酸羥化酶基因其余多態(tài)性位點與原發(fā)性高血壓間的關(guān)系，以及這些多態(tài)性位點的檢測方法、試劑盒在國內(nèi)外均沒有專利或報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因。
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測本發(fā)明的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因的方法。
本發(fā)明的一個目的是提供一種體外篩查原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的方法。
本發(fā)明的一個目的是提供一種體外檢測待測樣品中是否存在原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的易感位點的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種體外預(yù)測待測個體原發(fā)性高血壓危險性的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種體外檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒。


圖1為人類TH基因的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中的數(shù)字1-13分別代表內(nèi)含子1-13。
圖2為TH基因rs2070762多態(tài)性位點及其側(cè)翼序列。圖中加黑的C/T為TH基因rs2070762多態(tài)性位點，前后序列分別為其側(cè)翼序列。
圖3為擴增后，TH基因rs2070762多態(tài)性位點的酶切圖譜。其中，泳道1表示T/T基因型；泳道2表示T/C基因型；泳道3表示C/C基因型；M表示Marker，即標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明通過大量的實驗研究，提供了一種內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因(NCBI Gene數(shù)據(jù)庫登記號為7054)，本發(fā)明的基因與在NCBI中登記號為7054的TH基因相比，為內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的基因，具體地，rs2070762多態(tài)性位點的等位基因為C。此多態(tài)性位點已被世界權(quán)威的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫-美國國立衛(wèi)生研究院(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收錄，位于酪氨酸羥化酶基因第13個內(nèi)含子內(nèi)，為C/T的多態(tài)性，即位于SEQ ID NO1所示序列的6701個核苷酸處；另外，如圖2所示，圖中加黑的C/T為TH基因rs2070762多態(tài)性位點，前后分別為其側(cè)翼序列，側(cè)翼序列(flanking sequence)分別參見SEQ IDNO2和SEQ ID NO3。此多態(tài)性位點在人類基因組上能被唯一確定。此外由于該序列位于內(nèi)含子區(qū)域，沒有改變氨基酸的編碼，因此它無氨基酸的改變編碼。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，所謂“基因多態(tài)性”指的是在人群中，各個體基因的核苷酸序列存在的差異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的多態(tài)性位點為單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，即基因組序列中單個核苷酸發(fā)生改變；核苷酸序列的差異可以體現(xiàn)在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本發(fā)明的TH基因可以體現(xiàn)在DNA水平，RNA水平上，優(yōu)選DNA水平，更優(yōu)選基因組DNA。
這里所說的“易感基因”是指決定易于罹患某種(某類)疾病的基因。原發(fā)性高血壓易感基因的攜帶者表現(xiàn)為攜帶易感基因的個體患原發(fā)性高血壓的危險因素增大。
本發(fā)明采用在遺傳學(xué)研究中具有更大把握度的關(guān)聯(lián)研究，其通過檢測遺傳標(biāo)記在正常對照人群與疾病人群之間存在的頻率分布差異，識別易感基因的位置。具體地，在本發(fā)明的一個實施方式中，單因素分析發(fā)現(xiàn)(參見實施例2)，rs2070762多態(tài)性位點C等位基因在病例組中的頻率顯著高于對照組(P＝0.005)，多態(tài)性位點rs2070762位于內(nèi)含子區(qū)，可能參與酪氨酸羥化酶基因在細胞內(nèi)表達的調(diào)節(jié)或與可變剪切有潛在的關(guān)聯(lián)，因而在高血壓疾病預(yù)測預(yù)報和針對酪氨酸羥化酶的新藥開發(fā)中具有很大的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種檢測本發(fā)明的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以用多種技術(shù)在DNA水平上體外檢測TH基因序列的多態(tài)性位點?？梢越?jīng)與用放射性標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴增后的DNA序列雜交，以鑒別點多態(tài)性。也可以基于已知的核苷酸順序的改變，合成正常的和具有特定單核苷酸多態(tài)性的PCR引物，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))的底物中加入熒光標(biāo)記的核苷酸，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中有無熒光出現(xiàn)，確定在擴增所用的引物中有無堿基變化，從而檢測特定單核苷酸多態(tài)性。通過DNA直接測序可以直接揭示對照基因和攜帶具有特定單核苷酸多態(tài)性基因之間的序列差異。當(dāng)與PCR結(jié)合使用時，這種方法的靈敏性大大提高。各種DNA及DNA片段的核苷酸序列的測定也可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)。此外，核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒或自動測序儀等。常規(guī)的自動測序法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來確定核酸序列。也可以采用限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)來體外檢測TH基因序列的多態(tài)性位點。
限制性片段長度多態(tài)性分析方法的原理為由于基因具有特定單核苷酸多態(tài)性，導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶酶切位點改變、消失或產(chǎn)生新的位點，若用某種限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，則酶切后產(chǎn)生與正?；蚪M不同長度的DNA片段，檢測這DNA片段的大小和數(shù)量，判斷是否具有特定單核苷酸多態(tài)性。優(yōu)選該方法與PCR技術(shù)結(jié)合(PCR-RFLP)，方法是在設(shè)計PCR擴增實驗時，引物位于基因多態(tài)性部位的兩側(cè)，先將目的基因擴增，使其易于檢測，由于特定單核苷酸多態(tài)性引起已有的限制性內(nèi)切酶位點改變，則可先用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，再進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據(jù)產(chǎn)物片段大小或數(shù)量與正常對照作出判斷。本發(fā)明中優(yōu)選檢測所述TH基因rs2070762多態(tài)性位點的多態(tài)性的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
本發(fā)明同時也為獲得原發(fā)性高血壓相關(guān)基因提供了一個新的思路。目前尋找疾病相關(guān)疾病的方法多為尋找結(jié)構(gòu)基因的變化。而本發(fā)明從一個側(cè)面說明不僅基因的編碼區(qū)具有特定多態(tài)性可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平具有特定多態(tài)性，進而導(dǎo)致患原發(fā)性高血壓的危險因素增大，而且在非編碼區(qū)的特定單核苷酸多態(tài)性，也可以導(dǎo)致患原發(fā)性高血壓的危險因素增大。在本發(fā)明中就是TH基因的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性。
本發(fā)明還提供了一種體外篩查原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的方法，該方法包括(1)針對潛在的功能性單核苷酸多態(tài)性位點，進行原發(fā)性高血壓患者和對照組之間的關(guān)聯(lián)研究；(2)確定統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異的單核苷酸多態(tài)性位點。
為進一步從遺傳學(xué)的角度探討TH基因和原發(fā)性高血壓發(fā)病之間的關(guān)系，并為國內(nèi)外已有的同類研究提供遺傳流行病學(xué)的證據(jù)，本實施例運用PCR-RFLP的國際通行的基因分型方法，在收集到的大樣本原發(fā)性高血壓病例(n＝503)對照(n＝490)研究中，體外檢測來自待測個體的樣品中rs2070762位點的多態(tài)性，從而分析rs2070762位點在原發(fā)性高血壓患者和正常對照人群的分布差異。經(jīng)過本發(fā)明的大量實驗研究，本發(fā)明確定具有rs2070762多態(tài)性的TH基因為原發(fā)性高血壓相關(guān)基因；而TH基因內(nèi)含子區(qū)rs2070762多態(tài)性位點為C等位基因時的rs2070762多態(tài)性位點為原發(fā)性高血壓的易感位點；rs2070762多態(tài)位點為C等位基因的TH基因為原發(fā)性高血壓的易感基因。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種體外檢測待測樣品中是否存在原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的易感位點的方法，該方法包括1)提取待測樣品的DNA，針對TH基因rs2070762多態(tài)性位點設(shè)計引物進行PCR擴增；2)對所述的PCR產(chǎn)物進行分析；3)鑒定TH基因rs2070762多態(tài)性位點是否為C。
所述待測樣品可以從來自試驗者的細胞獲得，如來自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)，活組織檢查和尸體解剖材料的細胞。優(yōu)選來自血液。
對所述的PCR產(chǎn)物進行分析的方法可以采用前述關(guān)于檢測本發(fā)明的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因的方法中提到的任何一種方法，例如，包括但不限于，利用放射性標(biāo)記進行檢測，利用熒光標(biāo)記進行檢測，直接測序進行檢測，采用限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)進行檢測。優(yōu)選對所述的PCR產(chǎn)物進行分析的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
在一個實施方式中，對所述PCR產(chǎn)物進行分析的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合(PCR-RFLP)。將包含目的SNP位點的PCR產(chǎn)物用特定的限制性內(nèi)切酶作酶切，則包含有該SNP位點的個體會產(chǎn)生切成兩個或三個或切不動三種情況。在本發(fā)明中對于rs2070762多態(tài)性位點，采用PCR擴增后，獲得了196個堿基長的PCR產(chǎn)物，對該196個堿基長的PCR產(chǎn)物選用PstI限制性內(nèi)切酶進行酶切，因為rs2070762位點的等位基因為C時在產(chǎn)物序列上存在一個PstI酶切位點，當(dāng)切割后會產(chǎn)生122bp和74bp兩種長度的片段，而當(dāng)rs2070762位點的等位基因為T時，產(chǎn)物序列上無PstI酶切位點，酶切后產(chǎn)物序列長度不變，仍然為196堿基。所以，當(dāng)同時存在196、122和74bp三種長度的片段時，說明rs2070762位點的等位基因型為C/T雜合子；當(dāng)只存在196bp片段時，說明rs2070762位點等位基因T；當(dāng)只存在122bp和74bp片段時，說明rs2070762位點等位基因C。(具體參見實施例1)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種體外預(yù)測待測個體原發(fā)性高血壓危險性的方法，該方法包括體外檢測來自待測個體的樣品中rs2070762多態(tài)性位點的多態(tài)性，其中rs2070762位點C等位基因攜帶者原發(fā)性高血壓的危險顯著增加。優(yōu)選所述待測個體為中國漢族。本發(fā)明通過大樣本的統(tǒng)計分析，在排除實驗誤差的基礎(chǔ)上，以確鑿的實驗證據(jù)證明了rs2070762多態(tài)性位點C等位基因在病例中的分布顯著高于對照組(P＝0.005)，rs2070762多態(tài)性位點與高血壓的緊密相關(guān)性(參見實施例2)；此外，rs2070762多態(tài)性位點C等位基因攜帶者患原發(fā)性高血壓的風(fēng)險平均為非攜帶者的2.66倍，也就是說，增加了一倍多。(參見實施例3)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，對所述的PCR產(chǎn)物進行分析的方法可以采用前述關(guān)于檢測本發(fā)明的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因的方法中提到的任何一種方法，例如，包括但不限于，利用放射性標(biāo)記進行檢測，利用熒光標(biāo)記進行檢測，直接測序進行檢測，采用限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)進行檢測。優(yōu)選對所述的PCR產(chǎn)物進行分析的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
在本發(fā)明大樣本的統(tǒng)計分析的基礎(chǔ)上，可以單獨使用本發(fā)明的方法，即檢測來自待測個體的樣品中rs2070762多態(tài)性位點的多態(tài)性，以體外預(yù)測待測個體患原發(fā)性高血壓危險性。
另一方面，本發(fā)明提供一種體外檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒。所述試劑盒內(nèi)可以裝有一個或多個容器，容器內(nèi)裝有用以檢測含有rs2070762多態(tài)性位點的TH基因的一種或多種組分。按照具體檢測方法及檢測多態(tài)性位點的不同，試劑盒可含有不同組分。與之同時提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種體外檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒，該試劑盒包含(1)擴增rs2070762多態(tài)性位點的引物；(2)PCR擴增酶及相應(yīng)緩沖液；(3)檢測rs2070762多態(tài)性位點的試劑。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，所述擴增多態(tài)性位點的引物，可以依據(jù)本發(fā)明已知的核苷酸序列設(shè)計，通常為15-30個堿基，GC含量為45％-50％左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c模板特異性結(jié)合，其可以利用專門的計算機程序設(shè)計，例如(Oligo 6.53軟件)。如本發(fā)明實施例1所示，提供一種擴增rs2070762多態(tài)性位點的引物引物序列 序列號正向5’CCTTCCTTCTGGCCTTGAGCAG 3’SEQ ID NO4反向5’TGTCAGCACCTCCAAGACTGG 3’ SEQ ID NO5本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，PCR擴增的酶可以為Tag DNA聚合酶、Klenow片段、Tth DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等能夠用于PCR擴增的酶。試劑盒中檢測rs2070762多態(tài)性位點的試劑根據(jù)檢測方法的不同而不同。例如，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合方法來檢測rs2070762多態(tài)性位點時，試劑盒中可以含有限制性內(nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜，例如PstI限制性內(nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜。
本發(fā)明的檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒可以用于體外檢測原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的多態(tài)性。
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，例如參見Sambrook等人，《分子克隆實驗手冊》(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
實施例1、rs2070762多態(tài)性位點的檢測方法rs2070762多態(tài)性位點可通過PCR與限制性片段長度多態(tài)性方法結(jié)合進行檢測。
1.rs2070762多態(tài)擴增片段的獲得使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得rs2070762多態(tài)擴增片段(196bp)，PCR反應(yīng)在ABI公司的9700型PCR儀上完成；每板PCR加待測樣品DNA模板(取自被檢測的對象，按照常規(guī)方法將白細胞內(nèi)的DNA用苯酚-氯仿法或者用鹽析法提取出來即可)對照反應(yīng)以及不加DNA樣本的空白對照反應(yīng)各2例。擴增所用引物和擴增條件見表2和表3，其中所用Taq酶為寶生物公司出品的HotStart Taq酶，適宜于Touch-down方法。
表2、rs2070762多態(tài)性位點檢測引物

表3、rs2070762多態(tài)性位點PCR擴增體系和擴增條件

2.限制性片段長度多態(tài)性方法鑒定rs2070762多態(tài)基因型成功擴增含有rs2070762多態(tài)性位點的DNA片段后，首先使用商品PCR產(chǎn)物純化板(例如Millipore MultiScreenTMPCR，Millipore公司)按照廠家推薦步驟進行產(chǎn)物純化。純化后的產(chǎn)物用PstI限制性內(nèi)切酶(MBI公司)進行酶切，從凝膠電泳圖譜即可分辨出此位點的基因型。rs2070762多態(tài)酶切反應(yīng)在37度恒溫培養(yǎng)箱中進行，酶切體系和酶切條件見表4。
表4、rs2070762多態(tài)酶切體系和酶切條件

3.瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切產(chǎn)物在濃度為2.5％的瓊脂糖凝膠(稱量普通瓊脂糖粉7.5克，溶于300毫升0.5X的TB液中，加熱至澄清透明，室溫放置約2分鐘，加入25微升EB，振蕩混勻，室溫放置晾干)中電泳酶切產(chǎn)物，電壓180伏，電泳時間為1小時。
結(jié)果如圖3所示，當(dāng)rs2070762多態(tài)性位點出現(xiàn)T等位基因時，電泳為196bp的條帶(泳道1)；出現(xiàn)C/T等位基因時，電泳為196、122、74bp三條帶(泳道2)；出現(xiàn)C等位基因時，電泳為122bp和74bp的兩條帶(泳道3)。
實施例2、rs2070762多態(tài)性位點與人類原發(fā)性高血壓的相關(guān)性1.病例對照樣本臨床特征描述，參見表5。
表5、病例對照樣本臨床特征描述

數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。NS，無統(tǒng)計學(xué)意義；BMI，體重指數(shù)。
2.rs2070762多態(tài)性位點在病例對照樣本中的頻率分布采用實施例1中方法，分別對上述病例(n＝503)和對照(n＝490)的rs2070762多態(tài)性位點進行分析，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表6。
表6、rs2070762多態(tài)在病例對照樣本中的頻率分布

結(jié)果如表6所示，rs2070762多態(tài)性位點C等位基因在病例中的分布顯著高于對照組(P＝0.005)，由于本研究按照嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)挑選樣本，在生活的地域環(huán)境，年齡，性別等方面進行了匹配，盡可能排除了非遺傳因素對統(tǒng)計分析結(jié)果的影響，所以統(tǒng)計分析說明了rs2070762與人類原發(fā)性高血壓密切相關(guān)。
實施例3、rs2070762多態(tài)性位點對于原發(fā)性高血壓的相對危險性1.研究對象中rs2070762多態(tài)性位點對于原發(fā)性高血壓的相對危險性采用實施例1中的方法對rs2070762多態(tài)性位點進行分析，并進一步進行統(tǒng)計分析(使用SAS軟件包，多元logistic回歸分析)，結(jié)果見表7。
表7、rs2070762多態(tài)對于原發(fā)性高血壓的相對危險性

結(jié)論如表7所示，在調(diào)整了原發(fā)性高血壓傳統(tǒng)的危險因素BMI，甘油三酯和血糖后，rs2070762多態(tài)性位點C等位基因攜帶者發(fā)生原發(fā)性高血壓的相對危險性顯著升高，即在其它條件一樣的情況下，此位點攜帶C等位基因患原發(fā)性高血壓的風(fēng)險平均為非攜帶者的2.66倍，也就是說，增加了一倍多。
實施例4體外檢測TH基因rs2070762多態(tài)性位點的試劑盒體外檢測TH基因的試劑盒，該試劑盒包含1.擴增rs2070762多態(tài)性位點的引物引物序列 序列號正向5’CCTTCCTTCTGGCCTTGAGCAG 3’SEQ ID NO4反向5’TGTCAGCACCTCCAAGACTGG 3’ SEQ ID NO52.PCR擴增酶及相應(yīng)緩沖液Tag DNA聚合酶，10X緩沖液，dNTP；3.檢測rs2070762多態(tài)性位點的試劑PstI內(nèi)切酶及其緩沖液。
并在試劑盒的使用說明中指出可以按照實施例1所述的方法進行檢測。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述描述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本申請權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
序列表<110>北京諾賽基因組研究中心有限公司中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院中國科學(xué)院生物物理研究所<120>具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因及其檢測方法和用途<130>GBI05CN0323<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7876<212>DNA<213>智人<220>
<221>misc_feature<222>(6701)..(6701)<223>n＝c或t<400>1cggacctcca cactgagcca tgcccacccc cgacgccacc acgccacagg ccaagggctt 60ccgcagggcc gtgtctgagc tggacgccaa gcaggcagag gccatcatgg taagagggca120ggtaggtgcc cggcggccgc agtggaccgg agcccagggc tggtgccagc tgcctctgct180actccccagc ctggctggca gccccaggct cagggtccat gcaaacccct gggacgcggc240gtggatgtgg aggcctgggc acagcggcat cccctgtgcc tggtgtttga gtccctgttg300ggggagggtg aggtgatgcc tgtccctgtg tgtgcccctc ttaggccgac ctctctcggg360ggtcgtgtgg gtctctgtgt cttgtttcat cttgaatctt aacgatcgga atgtggaaac420aaatccatcc aaaaaatcca agatggccag aggtccccgg ctgctgcacc cagcccccac480cctactccca cctgcccctg cctccctctg ccccagctgc cctagtcagc accccaacca540gcctgcctgc ttggggaggc agccccaagg cccttcccag gctctagcag cagctcatgg600tggggggtcc tgggcaaata gggggcaaaa ttcaaagggt atctgggctc tggggtgatt660
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<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ccttccttct ggccttgagc ag 22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5tgtcagcacc tccaagactg g 2權(quán)利要求
1.一種內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因，該基因與在NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中登記號為7054的TH基因相比，rs2070762多態(tài)性位點的等位基因為C。
2.如權(quán)利要求1所述的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因，該基因為原發(fā)性高血壓易感基因。
3.一種檢測如權(quán)利要求1所述的內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因的方法，該方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
4.一種體外篩查原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的方法，該方法包括(1)針對潛在的功能性單核苷酸多態(tài)性位點，進行原發(fā)性高血壓患者和對照組之間的關(guān)聯(lián)研究；(2)確定統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異的單核苷酸多態(tài)性位點。
5.如權(quán)利要求4所述的體外篩查原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的方法，所述原發(fā)性高血壓相關(guān)基因為rs2070762位點具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因。
6.一種體外檢測待測樣品中是否存在原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的易感位點的方法，該方法包括1)提取待測樣品的DNA，針對TH基因rs2070762多態(tài)性位點設(shè)計引物進行PCR擴增；2)對所述的PCR產(chǎn)物進行分析；3)鑒定TH基因rs2070762多態(tài)性位點是否為C。
7.如權(quán)利要求6所述的體外檢測待測樣品中是否存在原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的易感位點的方法，其中步驟(2)中對所述的PCR產(chǎn)物進行分析的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
8.一種體外預(yù)測待測個體原發(fā)性高血壓危險性的方法，該方法包括體外檢測來自待測個體的樣品中TH基因rs2070762位點的多態(tài)性，其中rs2070762位點C等位基因攜帶者患原發(fā)性高血壓危險性比非攜帶者顯著增加。
9.如權(quán)利要求8所述的體外預(yù)測待測個體原發(fā)性高血壓危險性的方法，其中檢測來自待測個體的樣品中TH基因rs2070762位點的多態(tài)性的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長度多態(tài)性分析相結(jié)合。
10.一種體外檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒，該試劑盒包含1)擴增rs2070762多態(tài)性位點的引物；2)PCR擴增酶及相應(yīng)緩沖液；3)檢測rs2070762位點多態(tài)性的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種內(nèi)含子中具有特定單核苷酸多態(tài)性的TH基因及其檢測方法。本發(fā)明還涉及檢測原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的方法。本發(fā)明還涉及體外檢測待測樣品中是否存在本發(fā)明的原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的易感位點的方法及體外預(yù)測待測個體原發(fā)性高血壓相對危險性的方法。本發(fā)明最后涉及檢測內(nèi)含子中具有單核苷酸多態(tài)性的TH基因的試劑盒。
文檔編號C12N15/12GK1891822SQ200510080578
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者顧東風(fēng), 李彪, 陳恕鳳, 陳潤生, 張鵬華 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院, 中國科學(xué)院生物物理研究所