一種cyp2c19*2和cyp2c19*3多態(tài)性檢測的引物組合物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的引物組合物、試劑盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，將PNA與LAMP法結(jié)合，利用PNA?2G封閉CYP2C19*2位點處的G等位基因，PNA?2A封閉CYP2C19*2位點處的A等位基因，PNA?3G封閉CYP2C19*3位點處的G等位基因，PNA?3A封閉CYP2C19*3位點處的A等位基因，從而使得相應的LAMP反應無法繼續(xù)，以此達到檢測CYP2C19基因型的目的。該發(fā)明具有的優(yōu)點在于該方法步驟簡單，特異性高，鑒定簡便，成本低廉，利于臨床檢驗大范圍普及。
【專利說明】
-種CYP2C19巧和CYP2C19巧多態(tài)性檢測的引物組合物、試劑 盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢 測的引物組合物、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人體中，CYP2C19參與氯化格雷、S-美芬妥英、奧美拉挫、伏立康挫、安定、去甲安 定等藥物的代謝。氯化格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于急性冠脈綜合征、缺血性腦血 栓、閉塞性脈管炎和動脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。屯、臟支架手術(shù)后的患者需長期服 用氯化格雷W防止支架內(nèi)再梗。氯化格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應。 CYP2C19遺傳變異可導致酶活性的個體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者（ultrarapid metabolizer，UM)、快代謝者（extensive metaboIizer，EM)、中間代謝者（intermediate metabolize;r，IM)和慢代謝者（poormetabolize;r，PM)4種表型。CYP2C19巧（rs4244285， C. 681G〉A(chǔ))和CYP2C19*3(rs4986893，c. 636G〉A(chǔ))是中國人群中存在的巧中導致CYP2C19酶缺 陷的主要等位基因。EM個體只攜帶CYP2C19*1等位基因，IM個體攜帶CYP2C19*2或CYP2C19*3 雜合子基因型；PM個體包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。 CYP2C19PM患者應用常規(guī)劑量的氯化格雷后體內(nèi)活性代謝物生產(chǎn)減少，對血小板的抑制作 用下降。美國FDA和美國屯、臟病學會建議，對于CYP2C19慢代謝基因型患者需考慮改變治療 方案。阿米替林為=環(huán)類抗抑郁藥，主要用于焦慮性或激動性抑郁癥的治療。阿米替林在體 內(nèi)主要經(jīng)CYP2C19代謝為活性代謝產(chǎn)物去甲替林。CYP2C19活性的高低可通過影響血液中阿 米替林與去甲替林的濃度比，影響阿米替林的療效和不良反應的產(chǎn)生。伏立康挫是一種廣 譜S挫類抗真菌藥，CYP2C19是其主要代謝酶之一。CYP2C1犯M與PM個體間伏立康挫的血液 濃度存在顯著差異，PM個體在應用常規(guī)劑量藥物時可能出現(xiàn)毒副反應，建議減少用藥劑量； EM和IM個體可給予常規(guī)劑量。在常規(guī)劑量治療時，若EM個體出現(xiàn)毒副反應或PM療效不佳，均 應考慮更換藥物。FDA批準的藥物說明書中指出應用伏立康挫前需檢測CYP2C19基因型，W 確保用藥安全。由上述可見，CYP2C19的活性在在臨床指導用藥上具有非常廣泛的作用，因 此，CYP2C19巧和CYP2C19*3的檢測也是非常重要。目前用于檢測運兩種亞型的方法主要是 直接測序法、Taqman巧光PCR法W及忍片法等等，運些方法均在不同方面展現(xiàn)出了自己的優(yōu) 勢，但是也都普遍存在檢測儀器及配套試劑耗材購買成本高昂，檢測周期長、操作繁瑣且假 陽性率時有出現(xiàn)的問題。因此，發(fā)明并構(gòu)建一套價格低廉，使用操作簡便且利于臨床檢驗大 范圍普及的商品化試劑盒就顯得十分重要。
[0003] 日本科學家于2000年提出一種恒溫擴增法-----環(huán)介導等溫擴增技術(shù)化〇〇口- Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，該技術(shù)的主要特點是針對勒1基因的6個區(qū)域 設(shè)計4條引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的催化下于65°C左右進行恒溫擴 增，僅需15-90分鐘即可獲得IO9-IOW數(shù)量級的特異產(chǎn)物。具有操作簡單，特異性強和成本低 廉的優(yōu)點。目前LAMP法較多用于病原體和其他一些微生物的檢測中，雖然對于使用LAMP法 進行基因突變的檢測也偶見報道，但運些等位基因特異性引物的LAMP法在實際的應用中很 不穩(wěn)定，因此在市場上還沒有W LAMP法為基礎(chǔ)的基因突變檢測試劑盒出售。膚核酸(PNA)是 具有類多膚骨架的DNA類似物，骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基幾 基連接而成的。PNA可W特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復合體。當PNA與祀序列完全 互補時，運種復合體的穩(wěn)定性要遠遠高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的雙鏈結(jié)構(gòu)。 然而，當PNA與祀序列不完全配對甚至只有一個堿基錯配的時候，運種PNA-DNA復合物就變 得非常不穩(wěn)定，很容易打開雙鏈。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有CYP2C19*2和CYP2C19*3的檢測存在費用高，檢測 周期較長、操作繁瑣且假陽性率時有出現(xiàn)等問題。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，將PNA與LAMP法結(jié)合，利用 PNA-2G封閉CYP2C19*2位點處的G等位基因，PNA-2A封閉CYP2C19*2位點處的A等位基因， PNA-3G封閉CYP2C19*3位點處的G等位基因，PNA-3A封閉CYP2C19*3位點處的A等位基因，從 而使得相應的LAMP反應無法繼續(xù)，W此達到檢測CYP2C19基因型的目的。該方法既快速靈敏 又成本低廉，利于臨床檢驗大范圍普及。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的引物組 合物，包括如下八條引物和四條膚核酸序列：
[0007] 5'-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（沈Q ID No.l，W下簡稱F3);
[000引 5'-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3'（沈Q ID 齡.2，^下簡稱83);
[0009] 5 '-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAA TGC-3'（SEQ ID 齡.3，^下簡稱。1口）；
[0010] 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（沈Q ID 齡.4，^下簡稱81口）；
[0011] 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（沈Q ID No. 5，W下簡稱F3');
[0012] 5'-4166口'61'口'466〔4464-3'（沈9 10齡.6，^下簡稱83');
[0013] 日 '-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（沈Q ID No.7，W 下簡稱FIP/ );
[0014] 5 '-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（沈Q ID No.8， W下簡稱BIP'); W及
[0015] 用于封閉CYP2C19巧位點處G等位基因的膚核酸序列：
[0016] 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（沈Q ID 齡.9，^下簡稱？臟-26);
[0017] 用于封閉CYP2C19巧位點處A等位基因的膚核酸序列：
[001 引 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（沈Q ID 齡.10，^下簡稱口臟-2八）；
[0019] 用于封閉CYP2C19*3位點處G等位基因的膚核酸序列：
[0020] 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID 齡.11，^下簡稱?臟-36);
[0021] 用于封閉CYP2C19*3位點處A等位基因的膚核酸序列：
[0022] 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 齡.12，^下簡稱?臟-3八）；
[0023] 其中，F(xiàn)3、B3、FIP和BIP為檢測CYP2C19*2的引物，F(xiàn)3'、B3'、FIP'和BIP'為檢測 CYP2C19*3的引物。
[0024] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒， 所述檢測的試劑盒包括上述的引物和膚核酸序列。
[0025] 進一步地，所述檢測的試劑盒中還包括dNTP、緩沖液、Bs t聚合酶和超純水。
[00%] 進一步地，所述檢測的試劑盒分為檢測CYP2C19*2位點處G等位基因的反應體系 2G，檢測CYP2C19*2位點處A等位基因的反應體系2A，檢測CYP2C19*3位點處G等位基因的反 應體系3G，檢測CYP2C19*3位點處A等位基因的反應體系3A:
[0027] 反應體系2G中包括。3、83^1?、81?、？臟-26、(1饑1\緩沖液、831聚合酶和超純水；
[0028] 反應體系2A中包括。3、83^1?、81?、？臟-24、(1饑1\緩沖液、831聚合酶和超純水；
[0029] 反應體系3G中包括F3'、B3'、FIP'、BIP'、PNA-3G、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純 水；
[0030] 反應體系3A中包括F3'、B3'、FIP'、BIP'、PNA-3A、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純 水。
[0031] 進一步地，所述反應體系2G、2A、3G和3A中還包括用于顯示體系顏色的指示劑。
[0032] 優(yōu)選地，所述指示劑為徑基糞酪藍。
[0033] 優(yōu)選地，所述指示劑在反應體系2G、2A、3G和3A中的濃度相同，徑基糞酪藍的濃度 為 120iiM。
[0034] 進一步地，所述反應體系2G、2A、3G和3A中還包括添加劑，所述添加劑在四個反應 體系中的濃度一致。
[0035] 優(yōu)選地，所述添加劑為甜菜堿，甜菜堿的濃度為0.8M。
[0036] 優(yōu)選地，所述反應體系2G、2A、3G和3A中緩沖液的濃度相同，均包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (體積分數(shù)）。
[0037] 優(yōu)選地，所述反應體系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3'和B3'的濃度相同，均為0.4iiM; FIP、BIP、FIP/和BIP/的濃度相同，均為1.6測，所述反應體系2G、2A、3G和3A中相應膚核酸序 列的濃度相同，均為0.化M。
[003引優(yōu)選地，所述反應體系2G、2A、3G和3A中dNTP的濃度相同，均為1.4mM;所述反應體 系2G、2A、3G和3A中Bst聚合酶的濃度相同，均為8U。
[0039] 本發(fā)明的第S個目的在于提供一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的方法，其 使用上述檢測的試劑盒，包括如下步驟：
[0040] (1)抽取靜脈血，拋DTA抗凝管保存；
[0041] (2)用DNA提取試劑盒提取全基因組DNA作為檢測的模板，W超純水代替模板做陰 性對照；
[0042] (3)采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，進行LAMP反應，將模板和超純水分別加入到反應體 系2G、2A、3G和3A中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然 降溫，觀察體系顏色變化。
[0043] 進一步地，所述反應時間為60~SOmin。
[0044] 在本發(fā)明的四個反應體系中，當反應體系中存在指示劑時，選用徑基糞酪藍作為 指示劑時，反應前體系中的儀離子與dNTP馨合，體系呈現(xiàn)紫羅蘭色；當有陽性反應時，儀離 子與副產(chǎn)物焦憐酸形成沉淀，溶液pH發(fā)生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{色。因此，觀 察反應體系顏色的變化就可W直接判定是否發(fā)生擴增反應。
[0045] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：
[0046] 本發(fā)明采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，將PNA與LAMP法結(jié)合，利用PNA將相應的等位基 因"封閉"，從而使得LAMP反應無法繼續(xù);而當檢測樣本中存在另外一個或者幾個等位基因 時，PNA由于不能有效對其進行"封閉"，使得LAMP反應得W順利進行，W此達到檢測CYP2C19 基因型的目的。
[0047] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：
[0048] (1)步驟簡單:LAMP法本身對模板的要求并不嚴格，反應體系配置完畢后放置在恒 溫水浴鍋中進行反應擴增即可，不需要預先進行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應中的 反復變性、退火、延伸等變溫過程；
[0049] (2)高特異性:擴增的特異性很高，可W根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與 否；
[0050] (3)擴增反應快速、高效:整個擴增化內(nèi)即可完成，且產(chǎn)率高；
[0051] (4)鑒定簡便:反應完成后通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，結(jié)果的觀察可W 脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制；
[0052] (5)成本低廉:整個檢測反應僅需要水浴鍋就可開展，無需任何其他檢測設(shè)備。
【附圖說明】
[0053] 圖1-圖4分別是檢測樣本M1-M4用PCR測序分型得到的測序圖譜；
[0054] 圖5-圖8分別是檢測樣本M6-M9用PCR巧膊分型得到的測序圖譜。
【具體實施方式】
[0055] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明，但 不限定本發(fā)明的保護范圍。
[0化6] -種CYP2C19巧和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的引物組合物，包括如下八條引物和四條 膚核酸序列：
[0化7] 5'-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（沈Q ID No.l，W下簡稱F3);
[0化引 5'-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3'（沈Q ID 齡.2，^下簡稱83);
[0059] 5 '-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAA TGC-3'（SEQ ID 齡.3，^下簡稱。1口）；
[0060] 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（沈Q ID 齡.4，^下簡稱81口）；
[0061 ] 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（沈Q ID No. 5，W下簡稱F3');
[0062] 5'-4166口'61'口'466〔4464-3'（沈9 10齡.6，^下簡稱83');
[0063] 日 '-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（沈Q ID No.7，W 下簡稱FIP/ );
[0064] 5 '-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（沈Q ID No.8， W下簡稱BIP'); W及
[0065] 用于封閉CYP2C19巧位點處G等位基因的膚核酸序列：
[0066] 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（沈Q ID 齡.9，^下簡稱？臟-26);
[0067] 用于封閉CYP2C19巧位點處A等位基因的膚核酸序列：
[006引 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（沈Q ID 齡.10，^下簡稱口臟-2八）；
[0069] 用于封閉CYP2C19*3位點處G等位基因的膚核酸序列：
[0070] 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID 齡.11，^下簡稱?臟-36);
[0071] 用于封閉CYP2C19*3位點處A等位基因的膚核酸序列：
[0072] 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 齡.12，^下簡稱?臟-3八）；
[0073] 其中，F(xiàn)3、B3、FIP和BIP為檢測CYP2C19*2的引物，F(xiàn)3'、B3'、FIP'和BIP'為檢測 CYP2C19*3的引物。
[0074] 一種CYP2C19巧和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，所述檢測的試劑盒包括上述的 引物和膚核酸序列，還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿。
[0075] 所述檢測的試劑盒分為檢測CYP2C19*2位點處G等位基因的反應體系2G，檢測 CYP2C19*2位點處A等位基因的反應體系2A，檢測CYP2C19*3位點處G等位基因的反應體系3G 和檢測CYP2C19*3位點處A等位基因的反應體系3A。反應體系2G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2G、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿;反應體系2A中包括F3、B3、FIP、 BIP、PNA-2A、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、?基糞酪藍和甜菜堿;反應體系3G中包括 F3/、B3/、FIP/、BIP/、PNA-3G、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿;反應 體系3A中包括F3/、B3/、FIP/、BIP/、PNA-3A、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍 和甜菜堿。
[0076] 四個反應體系中各組分的濃度可按正常LAMP反應的濃度設(shè)置，作為一種實施方 案，四個反應體系中：F3、B3、F3/和B3/的濃度相同，均為0.化M;FIP、BIP、FIp/和BIp/的濃度 相同，均為1.6咖，相應膚核酸序列的濃度相同，均為0.4iiM; dNTP的濃度相同，均為1.4mM; Bst聚合酶的濃度相同，均為8U;緩沖液的濃度相同，均包括：Tris-HC120mM，KCl 50mM， (NH4)2S04 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (體積分數(shù)）；?基糞酪藍的濃度相同，均為120 咖;甜菜堿的濃度相同，均為0.8M。
[0077] 一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的方法，其使用上述檢測的試劑盒，包括 如下步驟:抽取靜脈血，W邸TA抗凝管保存；用DNA提取試劑盒提取全基因組DNA作為檢測的 模板，W超純水代替模板做陰性對照;采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，進行LAMP反應，將模板和 超純水分別加入到反應體系2G、2A、3G和3A中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min進 行酶滅活處理，之后自然降溫，觀察體系顏色變化。優(yōu)選地，所述反應時間為60~80min。
[0078] 具體實施時，抽取8個人Iml靜脈血W抓TA抗凝管保存，分為兩組，一組用于檢測 CYP2C19*2，記為Ml，M2，M3和M4，另有一 W超純水代替模板的陰性對照，記為M5;另一組用于 檢測CYP2C19*3,記為M6，M7，M8和M9,另有一 W超純水代替模板的陰性對照，記為M10。每管 取200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書提取全基因組 DNA作為檢測的模板。對模板Mn (n為組別編號，n為1-10)進行LAMP反應，將模板Ml -M5分別加 入到反應體系2G和2A中，將模板M6-M10分別加入到反應體系3G和3A中，各反應體系于60°C 下反應60min，然后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然降溫，觀察體系顏色變 化。
[0079] 利用檢測試劑盒對模板Mn進行檢測，作為一種實施方式，檢測試劑盒的四個反應
[0081] 體系各為2如L，其內(nèi)的組分和含量如下表1-表4所示：[0080] 表1反應體系2G的組分和含量
[0083] 表2反應體系2A的組分和含量
[0082]
[0084]
[008日]表3反應體系3G的組分和含量
[0086]
[0087] [008引
[0089]
[0090] 反應按照上述的檢測方法進行，反應前，體系顏色均為紫羅蘭色，反應后，各組別 反應體系的顏色及基因型判斷如下表5-6所示：
[0091] 表5 CYP2C19巧各組別反應體系的顏色及基因型判斷
[0095] 為進一步驗證反應的準確性，將上述8個實驗組別的模板M1-M4、M6-M9分別用PCR 測序法進行分型，得到的測序圖譜參見圖1-圖8。
[0092]
[0093]
[0094]
[0096] 對比基因測序圖譜和本發(fā)明提供的檢測的試劑盒的檢測結(jié)果可知，二者的檢測吻 合率100 %，驗證了本發(fā)明的結(jié)果精確。
[0097] W上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例， 不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等， 均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的引物組合物，其特征在于:包括如下八條 引物和四條肽核酸序列： 5'-AGITTTAAATTACAACCAGAGCT-3'（SEQ ID No.l，以下簡稱F3); 5 ' -TGATGTCCATCGATTCTTGG-3 '（SEQ ID No · 2，以下簡稱B3); 5'-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGC-3'（SEQ ID Νο·3,以下簡稱FIP); 5 '-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3 '（SEQ ID No.4,以下簡稱BIP); 5 ' -AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3 '（SEQ ID No · 5，以下簡稱F3'); 5 ' -ATGGCTGTCTAGGCAAGA-3 '（SEQ ID No · 6，以下簡稱B3'); 5 ' -GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3 '（ SEQ ID No · 7，以下簡 稱FIP'); 5 ' -ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3 '（ SEQ ID No · 8，以下 簡稱BIP"；以及 用于封閉CYP2C19*2位點處G等位基因的肽核酸序列： 5'-CATTGATTATTTCCCG-3'（SEQ ID Νο·9,以下簡稱PNA-2G); 用于封閉CYP2C19*2位點處Α等位基因的肽核酸序列： 5'-CAGGAACCCATAACA-3'（SEQ ID 吣.10，以下簡稱卩熟-2八）； 用于封閉CYP2C19*3位點處G等位基因的肽核酸序列： 5'-TAAGCACCCCCTGGAT-3'（SEQ ID No.ll，以下簡稱PNA-3G); 用于封閉CYP2C19*3位點處A等位基因的肽核酸序列： 5'-TAAGCACCCCCTGAAT-3'（SEQ ID 吣.12，以下簡稱卩熟-3八）； 其中，F(xiàn)3、B3、FIP和BIP為檢測CYP2C19*2的引物，F(xiàn)3'、B3' AIP'和BIP'為檢測CYP2C19* 3的引物。2. -種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述 的引物和肽核酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:還 包括dNTP、緩沖液、Bs t聚合酶和超純水。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述檢測的試劑盒分為檢測CYP2C19*2位點處G等位基因的反應體系2G，檢測CYP2C19*2位點 處A等位基因的反應體系2A，檢測CYP2C19*3位點處G等位基因的反應體系3G，檢測CYP2C19* 3位點處A等位基因的反應體系3A: 反應體系2G中包括?3、83、？1?、81?、？熟-26、(1犯1\緩沖液、88丨聚合酶和超純水； 反應體系2A中包括?3、83、？1?、81?、？熟-24、(1犯1\緩沖液、88丨聚合酶和超純水； 反應體系3G中包括F3' JIP' 3IP'、PNA-3G、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水； 反應體系3A中包括F3' JIP' 3IP'、PNA-3A、dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述反應體系2G、2A、3G和3A中還包括用于顯示體系顏色的指示劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述指示劑為羥基萘酚藍。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述指示劑在反應體系2G、2A、3G和3A中的濃度相同，羥基萘酚藍的濃度為120μΜ。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述反應體系2G、2A、3G和3A中還包括添加劑，所述添加劑在四個反應體系中的濃度一致。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其特征在于:所 述添加劑為甜菜堿，甜菜堿的濃度為〇. 8M。10. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其 特征在于:所述反應體系2G、2A、3G和3A中緩沖液的濃度相同，均包括:Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (體積分數(shù)）。11. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其 特征在于：所述反應體系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3lPB3l勺濃度相同，均為0.4yM;FIP、 BIPJIP'和BIP'的濃度相同，均為1.6μΜ;所述反應體系2G、2A、3G和3A中相應肽核酸序列的 濃度相同，均為〇.4μΜ。12. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的試劑盒，其 特征在于:所述反應體系2G、2A、3G和3A中dNTP的濃度相同，均為1.4mM;所述反應體系2G、 2A、3G和3A中Bst聚合酶的濃度相同，均為8U。13. -種CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的方法，使用權(quán)利要求3-12任一所述的檢 測的試劑盒，其特征在于:包括如下步驟： (1) 抽取靜脈血，以Η)ΤΑ抗凝管保存； (2) 用DNA提取試劑盒提取全基因組DNA作為檢測的模板，同時以超純水代替模板做陰 性對照； (3) 采用PNA Clamp LAMP技術(shù)，進行LAMP反應，將模板和超純水分別加入到反應體系 2G、2A、3G和3A中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然降 溫，觀察體系顏色變化。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多態(tài)性檢測的方法，其特征在于:所 述反應時間為60~80min。
【文檔編號】C12N15/11GK105861690SQ201610299069
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】汪大為, 張井存
【申請人】北京晉祺生物科技有限公司