專利名稱：堿基序列檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及堿基序列檢測(cè)方法，更詳細(xì)地說(shuō)，涉及SNPs(single nucleotidepolymorphisms)、甲基化胞嘧啶等對(duì)單堿基的變異和變化的檢測(cè)方法、以及利用此方法的基因的診斷方法。
背景技術(shù)：
人類基因組的解析已經(jīng)結(jié)束，基因組信息在各個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用的時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨。人的個(gè)體性和對(duì)藥品的敏感性在基因水平上的闡明正不斷推進(jìn)，其結(jié)果將被應(yīng)用于診斷和治療之中。這其中尤其是基因組序列中的單核苷酸多態(tài)(SNPs)被認(rèn)為起著重要的作用。SNPs的數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建正在進(jìn)行，并開(kāi)始應(yīng)用于各種診斷。
對(duì)于SNPs的解析提出了以下多種方法DNA序列確定方法，在變異部分插入與該變異對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記核酸后、用凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)的方法，根據(jù)變異部分的有無(wú)使用具有活性作用的熒光探針的方法，或如DNA芯片等那樣區(qū)分探針是否和靶點(diǎn)穩(wěn)定雜交的方法，以及利用階段性互補(bǔ)鏈合成來(lái)確定序列的方法等。這些方法中很多是為制作SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)而開(kāi)發(fā)的技術(shù)，裝置往往龐大且造價(jià)高。因此希望使用簡(jiǎn)便、運(yùn)行成本低廉的SNPs的檢測(cè)方法。
DNA堿基序列的檢測(cè)方法大致可以分為利用熒光的方法和利用化學(xué)發(fā)光的方法等兩種方法。在使用熒光的方法中，由于光源是必需的，因而通常裝置龐大。另一方面，在使用化學(xué)發(fā)光的方法中，以往主要是采用熒光素酶反應(yīng)對(duì)ATP進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)(檢測(cè)ATP)，但最近使用的是焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)，該技術(shù)利用化學(xué)發(fā)光來(lái)確定DNA堿基序列。
在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，將DNA互補(bǔ)鏈合成時(shí)生成的焦磷酸變成ATP，進(jìn)行以該ATP為底物的熒光素·熒光素酶反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生的光來(lái)確定序列。即，按照順序向反應(yīng)槽中注入核酸底物，進(jìn)行DNA互補(bǔ)鏈的合成反應(yīng)。如果觀察到光，說(shuō)明互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行，則從注入的核酸底物可以確定被插入位點(diǎn)的堿基。反應(yīng)后，剩余的底物迅速進(jìn)行酶分解，使得在注入下一個(gè)核酸底物時(shí)在反應(yīng)槽中幾乎不存在。由于發(fā)光量與互補(bǔ)鏈合成的量成比例，同時(shí)插入2個(gè)底物時(shí)能觀察到2倍的發(fā)光。
但是，人基因組DNA是來(lái)源于母親和父親的2個(gè)等位基因進(jìn)行配對(duì)，DNA樣品有雜合樣品和純合樣品，其中雜合樣品具有針對(duì)特定位點(diǎn)的序列的2種不同的等位基因，而純合樣品具有相同的等位基因。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的情況下，雜合樣品中得到的信號(hào)強(qiáng)度是純合樣品的一半，對(duì)于不同樣品，這種一半的信號(hào)強(qiáng)度有時(shí)會(huì)持續(xù)一會(huì)。但是，這種情況在正確了解以SNPs為首的序列信息方面存在困難。
另外，在DNA互補(bǔ)鏈合成時(shí)，通常使用4種堿基dATP、dCTP、dGTP、dTTP進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，但由于發(fā)光底物dATP與ATP的結(jié)構(gòu)相似，也可作為熒光素酶反應(yīng)的反應(yīng)底物。即，為進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成而加入dATP時(shí)，會(huì)引發(fā)熒光素酶反應(yīng)，即使不引起DNA互補(bǔ)鏈的合成，也能觀察到發(fā)光。與此相反，國(guó)際專利申請(qǐng)98/13523號(hào)(特表2001-501092號(hào)公報(bào))公開(kāi)了使用不會(huì)成為發(fā)光底物的dATP類似物dATPαS和ddATP類似物進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成的方法，但由于dATPαS價(jià)格高而存在運(yùn)行成本高的問(wèn)題。
而且，在使用ATP的熒光素酶反應(yīng)中，發(fā)光的同時(shí)會(huì)生成焦磷酸作為反應(yīng)產(chǎn)物，但焦磷酸再次轉(zhuǎn)換成ATP作為發(fā)光反應(yīng)的底物。即，發(fā)光能一直持續(xù)。與此相反，國(guó)際專利申請(qǐng)98/28440號(hào)(特表2001-506864號(hào)公報(bào))公開(kāi)了為了在每次加入核酸底物時(shí)發(fā)光(信號(hào))，使分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶共存于反應(yīng)液中，從而迅速分解加入的dNTP和ATP。但是，由于三磷酸腺苷雙磷酸酶的用量大時(shí)，會(huì)妨礙反應(yīng)的進(jìn)行，而用量小時(shí)，會(huì)發(fā)生由殘存的dNTP引起的反應(yīng)，因而存在使用困難、價(jià)格高的問(wèn)題。
此外，Science 1987，238，336-341報(bào)道了向反應(yīng)槽中一起加入4種熒光標(biāo)記終止劑，通過(guò)單核苷酸互補(bǔ)鏈的延伸檢測(cè)DNA變異的方法。但是，在此反應(yīng)中，互補(bǔ)鏈延伸后，由于要分離插入的熒光標(biāo)記終止劑產(chǎn)生的熒光和剩余終止劑產(chǎn)生的熒光后進(jìn)行檢測(cè)，所以必須利用凝膠電泳分離生成物再進(jìn)行檢測(cè)。另外，Nucleic Acids Research，2000，Vol.28，Nol.12報(bào)道了4種終止劑同時(shí)加入反應(yīng)槽中，進(jìn)行單核苷酸延伸反應(yīng)，再使用質(zhì)量分析儀分析生成物的方法，但是，由于需要價(jià)格昂貴的裝置，因而缺乏廣泛應(yīng)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于解決以往技術(shù)中的問(wèn)題，提供廉價(jià)而且重復(fù)性好、簡(jiǎn)便的堿基序列檢測(cè)方法，尤其是能在一個(gè)反應(yīng)槽中檢測(cè)多個(gè)單核苷酸變異的堿基序列檢測(cè)方法。
為克服上述課題，本發(fā)明提供以化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法為基礎(chǔ)的、廉價(jià)、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便的堿基序列檢測(cè)方法。在以往的焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，為了不影響后面的反應(yīng)，用三磷酸腺苷雙磷酸酶分解加入的核酸底物，為降低背景發(fā)光，又必須使用dATPαS等高價(jià)樣品。在本發(fā)明的方法中，互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)以單個(gè)堿基終止，通過(guò)使用不能進(jìn)行1個(gè)堿基以上的互補(bǔ)鏈延伸的擬核酸堿基(ddNTP)，解決了這些問(wèn)題。
即，使用無(wú)3’末端延伸能力的4種ddNTP作為互補(bǔ)鏈合成試劑，階段性進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，再利用化學(xué)發(fā)光確定靶位點(diǎn)的堿基序列。在本發(fā)明的方法中，由于插入的核酸堿基無(wú)延伸能力，所以不必加入三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶。以往認(rèn)為ddATP與dATP產(chǎn)生同樣背景發(fā)光，因而一直回避使用ddATP。但是，發(fā)明人已證實(shí)，ddATP與dATP不同，其作為熒光素酶反應(yīng)的底物的活性低，因此不必使用價(jià)格高的dATPαS。而且，本發(fā)明中通過(guò)向試劑中加入微量PPase，降低背景化學(xué)發(fā)光，也能高靈敏度地進(jìn)行堿基序列的檢測(cè)。另外，通過(guò)使用多個(gè)引物，能在1個(gè)反應(yīng)槽中檢測(cè)多個(gè)變異位點(diǎn)。
如果利用本發(fā)明，能利用化學(xué)發(fā)光簡(jiǎn)便裝置檢測(cè)特定位點(diǎn)的堿基序列和變異的有無(wú)。本發(fā)明中使用的核酸底物(ddNTP)沒(méi)有3’末端延伸能力，在插入到DNA鏈后，不能進(jìn)行后面的互補(bǔ)鏈的合成，因而不必使用三磷酸腺苷雙磷酸酶等高價(jià)分解酶分解所加入的核酸底物。另外，由于ddNTP不會(huì)成為熒光素酶反應(yīng)的底物，因而也不必使用dATPαS等高價(jià)試劑。在本發(fā)明的方法中使用的試劑(ddNTP和Ppase等)都是廉價(jià)的，又由于能在1個(gè)反應(yīng)槽中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)變異位點(diǎn)，所以與以往的檢查方法比較，成本和時(shí)間都得以降低。


圖1是表示對(duì)利用本發(fā)明的方法和焦磷酸測(cè)序技術(shù)法的階段反應(yīng)的比較。
圖2是表示本發(fā)明方法(實(shí)施例1)中的反應(yīng)式。
圖3是比較利用本發(fā)明得到的發(fā)光類型和焦磷酸測(cè)序技術(shù)中得到的發(fā)光類型。
圖4是比較以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時(shí)的熒光素酶反應(yīng)引起的發(fā)光強(qiáng)度的曲線圖。
圖5是表示在本發(fā)明的方法中使用酶PPDK、并以AMP作為底物合成ATP的反應(yīng)式。
圖6是表示3個(gè)SNPs的組合和觀察到的發(fā)光類型。
圖7是表示在3個(gè)SNPs的檢測(cè)中的發(fā)光類型的曲線圖。
圖8是表示按順序注入3種引物檢測(cè)多個(gè)SNPs的例子中的發(fā)光類型的曲線圖。
圖9是表示實(shí)施例2中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)的情況下(添加PPase 40mU/mL)得到的發(fā)光類型。
其中，101引物102來(lái)自父親的等位基因的一側(cè)DNA鏈103來(lái)自母親的等位基因的一側(cè)DNA鏈1021多態(tài)位點(diǎn)的堿基(A)1031多態(tài)位點(diǎn)的堿基(B)301添加ddCTP引起的發(fā)光強(qiáng)度的增加302添加ddTTP引起的發(fā)光強(qiáng)度的增加303添加dCTP引起的發(fā)光強(qiáng)度的增加304添加dTTP引起的發(fā)光強(qiáng)度的增加305-308向反應(yīng)槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度的變化401ATP引起的發(fā)光402dATP引起的發(fā)光403dATPαS引起的發(fā)光404ddATP引起的發(fā)光405ddATPαS引起的發(fā)光
701加入ddATP時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度(其他的3倍的強(qiáng)度)702加入ddCTP時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度703加入ddGTP時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度704加入ddCTP時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度801用引物-2測(cè)定時(shí)加入ddATP時(shí)的發(fā)光802用引物-2測(cè)定時(shí)加入ddGTP時(shí)的發(fā)光803，804用引物-3測(cè)定時(shí)加入ddATP和ddGTP時(shí)的發(fā)光具體實(shí)施方式
本發(fā)明的方法是堿基序列檢測(cè)方法，該方法包括以下工序向有核酸樣品的反應(yīng)槽中加入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP等4種ddNTP或其衍生物中任一種進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，使靶位點(diǎn)延伸一個(gè)堿基的工序；使所得的焦磷酸生成ATP，并以此為反應(yīng)底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的工序；以及利用所述化學(xué)發(fā)光判斷互補(bǔ)鏈合成的有無(wú)，確定所述靶位點(diǎn)的堿基序列的工序。
4種ddNTP或其衍生物按順序每次一種加入反應(yīng)槽中，通過(guò)只有注入與檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)互補(bǔ)的核酸堿基才產(chǎn)生的發(fā)光，能夠確定靶位點(diǎn)的堿基種類。ddNTP和其衍生物本身就是互補(bǔ)鏈合成的底物，但是由于其沒(méi)有3’末端延伸能力，因而所述互補(bǔ)鏈的合成只限于1個(gè)堿基的延伸，所得化學(xué)發(fā)光通常是一個(gè)堿基所對(duì)應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。另外，作為ddNTP的衍生物，例如，可以舉出ddATPαS等ddNTPαS。
以ATP作為反應(yīng)底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可以采用熒光素·熒光素酶體系的酶發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP可以利用以往的APS和ATP硫酸化酶反應(yīng)體系，然而，如果使用不會(huì)成為熒光素反應(yīng)的底物的AMP和丙酮酸磷酸二激酶反應(yīng)體系，能避免背景發(fā)光的問(wèn)題。
通過(guò)預(yù)先使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于反應(yīng)槽中，可以使熒光素酶反應(yīng)中生成的焦磷酸和ATP馬上分解，因而，收集一定時(shí)間內(nèi)(1分鐘)的發(fā)光，可以得到明顯的峰。作為分解焦磷酸和/或ATP的酶，可以使用焦磷酸酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，但優(yōu)選廉價(jià)且活性高的焦磷酸酶。
本發(fā)明的方法能用于檢測(cè)包含單堿基取代(SNPs)、癌變所伴隨的堿基變異和甲基化(甲基化胞嘧啶等)、人為的堿基取代等在內(nèi)的所有單堿基的變異和變化。可檢測(cè)的位點(diǎn)不只限于1個(gè)，只要滿足后述的一定條件，就能在1個(gè)反應(yīng)槽中簡(jiǎn)便地檢測(cè)2個(gè)或2個(gè)以上的靶位點(diǎn)。
檢測(cè)多個(gè)靶位點(diǎn)的情況下，準(zhǔn)備與各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物，使用其中2或3種引物，同時(shí)進(jìn)行利用上述4種ddNTP及其衍生物的互補(bǔ)鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，由所得結(jié)果確定與上述2或3種引物對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)的堿基序列?；蛘撸?種引物，進(jìn)行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補(bǔ)鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)的堿基序列后，再分解或除去添加到反應(yīng)槽中的ddNTP及其衍生物，也可以按順序利用接下來(lái)的引物確定靶位點(diǎn)。另外，也可以反復(fù)進(jìn)行同時(shí)向反應(yīng)槽中添加2種或2種以上引物同時(shí)檢測(cè)2個(gè)或2個(gè)以上靶位點(diǎn)的工序。作為分解除去ddNTP的方法，可以舉出上述酶解、和將核酸樣品固定在固相上后用反應(yīng)液沖洗的方法。
本發(fā)明也提供用于上述堿基序列檢測(cè)方法的試劑盒。該試劑盒中含有1)對(duì)應(yīng)于堿基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)熒光素和熒光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
根據(jù)需要，試劑盒中還可進(jìn)一步添加分解焦磷酸和/或ATP的酶。
下面利用實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1圖1是比較利用本發(fā)明的方法的階段反應(yīng)與焦磷酸測(cè)序技術(shù)的階段反應(yīng)。個(gè)體的基因，是來(lái)源于父親和來(lái)源于母親的2個(gè)等位基因配對(duì)而成。本實(shí)施例中，以雜合樣品為例進(jìn)行說(shuō)明，該雜合樣品在某多態(tài)位點(diǎn)具有各一條A/G差異的2個(gè)等位基因。
圖1的102和103分別表示多態(tài)A(1021)和多態(tài)G(1031)2個(gè)等位基因的一側(cè)DNA鏈。使用通用的引物101，利用本發(fā)明的方法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)的情形以A表示，利用以往的焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的情形用B表示。發(fā)生互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的情況下的發(fā)光強(qiáng)度與互補(bǔ)鏈合成時(shí)插入的堿基數(shù)成比例。下面為了方便，將單堿基所對(duì)應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度作為“強(qiáng)度單位1(或1個(gè)單位)”進(jìn)行說(shuō)明。在本發(fā)明的方法中，由于使用ddNTP作為底物，因而延伸的堿基數(shù)常常為1，所得的發(fā)光強(qiáng)度為強(qiáng)度單位1。另一方面，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，由于使用dNTP作為底物，因而合成的堿基的長(zhǎng)度會(huì)因檢測(cè)對(duì)象多態(tài)位點(diǎn)的相鄰堿基的種類和狀態(tài)而有所不同，會(huì)得到發(fā)光強(qiáng)度為1個(gè)單位、2個(gè)單位或3個(gè)或3個(gè)以上單位等各種值。
檢測(cè)的方案如下所述。首先擴(kuò)增作為檢測(cè)對(duì)象的DNA，使之變成單鏈后加入到反應(yīng)槽中。使設(shè)計(jì)的引物與該單鏈DNA雜交，所述引物與作為檢測(cè)對(duì)象的核酸堿基之前的一個(gè)堿基呈3’末端對(duì)應(yīng)關(guān)系。即，設(shè)定為由引物引發(fā)的互補(bǔ)鏈合成，使得核酸底物插入到檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)。在本實(shí)施例中應(yīng)該被插入到檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基種類是T或C。通過(guò)加樣器(dispenser)按順序?qū)?種核酸底物即擬核酸堿基(終止劑)或核酸堿基注入到反應(yīng)槽中。注入的核酸底物的種類和順序，在本發(fā)明的方法的情況下是ddATP→ddCTP→ddGTP→ddTTP，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)的情況下是dATPαS→dCTP→dGTP→dTTP。注入的核酸堿基種類與檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)的情況下，互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)繼續(xù)，注入的核酸堿基結(jié)合到引物的3’末端。在本實(shí)施例中，焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，因?yàn)樾枰A(yù)先在反應(yīng)液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，因而注入的核酸底物在1分鐘內(nèi)分解，但如后所述，該三磷酸腺苷雙磷酸酶產(chǎn)生的分解作用在本發(fā)明的方法中不一定需要。
最初注入的ddATP或dATPαS由于與檢測(cè)對(duì)象多態(tài)位點(diǎn)的堿基不互補(bǔ)，因而互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)不發(fā)生。接下來(lái)如果注入ddCTP或dCTP，只在多態(tài)位點(diǎn)是G的等位基因的DNA鏈103處發(fā)生互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，在本發(fā)明的方法和焦磷酸測(cè)序技術(shù)中都觀測(cè)到強(qiáng)度單位1的發(fā)光。同樣，接下來(lái)的ddGTP或dGTP由于與檢測(cè)對(duì)象多態(tài)位點(diǎn)的堿基不互補(bǔ)，不引起互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，觀察不到發(fā)光。接下來(lái)的ddTTP或dTTP的注入，在多態(tài)位點(diǎn)是A的等位基因的DNA鏈102處發(fā)生互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，從而在本發(fā)明的方法中觀察到強(qiáng)度單位為1的發(fā)光。另一方面，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，DNA鏈102的多態(tài)位點(diǎn)和其鄰位各插入了1個(gè)dTTP，同時(shí)另一個(gè)等位基因在DNA鏈103也插入了1個(gè)dTTP，合計(jì)觀察到3個(gè)堿基對(duì)應(yīng)的發(fā)光(強(qiáng)度單位為3)。圖2表示本發(fā)明方法中的一系列的反應(yīng)式。另外，圖3示意性表示在本發(fā)明的方法(A)和焦磷酸測(cè)序技術(shù)(B)中觀察到的發(fā)光(信號(hào)強(qiáng)度)。
在本發(fā)明的方法中，由于只在變異位點(diǎn)插入與其數(shù)目相對(duì)應(yīng)的核酸堿基，因而，對(duì)于純合基因型的被檢驗(yàn)者的DNA樣品，在一處觀察到2個(gè)單位的發(fā)光；對(duì)于雜合型DNA樣品，則在二處觀察到1個(gè)單位的發(fā)光。另一方面，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中，由于互補(bǔ)鏈合成持續(xù)發(fā)生，發(fā)光強(qiáng)度的表現(xiàn)方式變得復(fù)雜。
表1表示的是在本實(shí)施例中使用的反應(yīng)液組成。在反應(yīng)液中含有DNA聚合酶、ATP生成反應(yīng)中使用的ATP硫酸化酶、APS、發(fā)光反應(yīng)中使用的熒光素酶、熒光素。而且，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中由于有必要分解注入的核酸底物，所以反應(yīng)液中添加有分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶。如后所述，由于試劑中常常含有雜質(zhì)焦磷酸等，所以在本發(fā)明的方法中，在加入有擬核酸堿基的試劑中預(yù)先了加入微量的焦磷酸酶(PPase)。
表1反應(yīng)液組成

*Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的循環(huán)測(cè)序用耐熱性DNA聚合酶。
若加入與模板DNA互補(bǔ)的核酸底物，則進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，能觀察到發(fā)光，但互補(bǔ)鏈的合成進(jìn)行時(shí)，會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸。焦磷酸在APS和ATP硫酸化酶的存在下，生成ATP，但APS本身也能成為熒光素酶反應(yīng)的底物引起發(fā)光反應(yīng)。在焦磷酸測(cè)序技術(shù)中為了進(jìn)行任意階段的互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)，有必要預(yù)先加入足夠的APS，致使背景發(fā)光變大。但是，本發(fā)明的方法中，由于不需要存在與焦磷酸測(cè)序技術(shù)同樣大量的APS，所以實(shí)質(zhì)上觀察不到APS引起的背景發(fā)光。
ATP在熒光素酶的存在下，與熒光素反應(yīng)發(fā)光，釋放出焦磷酸。由于焦磷酸再次與APS反應(yīng)生成ATP，發(fā)光反應(yīng)持續(xù)到熒光素消耗殆盡或APS用盡。但是，加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下，由于三磷酸腺苷雙磷酸酶也分解ATP，所以發(fā)光在1分鐘左右的較短時(shí)間停止。圖4表示這樣在三磷酸腺苷雙磷酸酶存在下觀察到的發(fā)光(信號(hào)強(qiáng)度)。在本實(shí)施例中，由于PPase的量少，因而如果發(fā)生互補(bǔ)鏈合成，信號(hào)強(qiáng)度急劇升高，隨著焦磷酸的緩慢分解，信號(hào)強(qiáng)度慢慢減弱(401)。接下來(lái)，注入下一個(gè)擬核酸堿基，此堿基被插入而引起互補(bǔ)鏈的合成時(shí)，由于信號(hào)強(qiáng)度再次急劇增加，因而能容易地檢測(cè)出。
如上所述，反應(yīng)中使用的各種試劑中往往含有雜質(zhì)焦磷酸(PPi)。焦磷酸在混合反應(yīng)試劑時(shí)被轉(zhuǎn)變成ATP，引起發(fā)光反應(yīng)，成為背景發(fā)光的原因。因而，在本實(shí)施例中，使微量的Ppase共存于加入有擬核酸堿基的試劑中，從而分解了作為雜質(zhì)的焦磷酸。PPase的加入量如果多，則由于在ATP→PPi→ATP循環(huán)反應(yīng)中焦磷酸減少，發(fā)光反應(yīng)會(huì)在短時(shí)間內(nèi)停止?；パa(bǔ)鏈合成時(shí)生成的焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP的過(guò)程也受到影響，發(fā)光(信號(hào)強(qiáng)度)也變小，但不妨礙測(cè)定。
另外，也可以使用三磷酸腺苷雙磷酸酶代替上述PPase。由于三磷酸腺苷雙磷酸酶分解ATP、dNTP、ddNTP等，因而如前所述，在分解ATP并在短時(shí)間內(nèi)收集發(fā)光的同時(shí)分解加入的擬核酸堿基(ddNTP)。但是，由于PPase的價(jià)格是三磷酸腺苷雙磷酸酶的一半左右，而且必需的使用量是三磷酸腺苷雙磷酸酶的1/10左右，所以使用PPase能使成本降低。
本實(shí)施例中，擬核酸堿基使用終止劑ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。圖4表示分別以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時(shí)的熒光素酶反應(yīng)引起的發(fā)光強(qiáng)度(401ATP、402dATP、403dATPαS、404ddATP、405ddATPαS)。dATP作為熒光素酶反應(yīng)的反應(yīng)底物比dATPαS的活性高300倍左右，而ddATP只顯示了與dATPαS大致相同的低活性。由于ddATP的價(jià)格約是dATPαS的一半，而且反應(yīng)必需的量是dATPαS的1/10左右，所以使用ddATP的本發(fā)明的方法與以往的方法比較，使檢測(cè)成本降低。
在本發(fā)明的方法中，由于只在核酸堿基插入到引物的3’末端時(shí)，能觀察到1個(gè)單位的發(fā)光，所以所得數(shù)據(jù)(發(fā)光類型)簡(jiǎn)單而且明了。通過(guò)只有注入與檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)互補(bǔ)的核酸堿基種類時(shí)產(chǎn)生的發(fā)光，能夠簡(jiǎn)單地判別靶SNPs。如上，如果利用本發(fā)明的方法，使用廉價(jià)的試劑ddATP和PPase能簡(jiǎn)便地檢測(cè)單核苷酸多態(tài)(SNPs)。
實(shí)施例2在實(shí)施例1中，在焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP的反應(yīng)中使用了ATP硫酸化酶，由焦磷酸和APS生成ATP。如上所述，APS作為熒光素酶發(fā)光底物的活性低，但是如果大量共存于反應(yīng)槽中，由此引起的發(fā)光將不能忽視，往往使檢測(cè)靈敏度下降。所以，在本實(shí)施例中，使用不會(huì)成為熒光素酶反應(yīng)的底物的AMP作為焦磷酸的反應(yīng)底物，并使用丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate Phosphate DikinasePPDK)進(jìn)行反應(yīng)，針對(duì)該體系進(jìn)行說(shuō)明。圖5表示本實(shí)施例的反應(yīng)概況。本實(shí)施例的方法除ATP生成反應(yīng)以外，幾乎與實(shí)施例1相同，但是，由于設(shè)定了所使用的酶PPDK的適用條件，因而所用試劑和反應(yīng)條件有所不同。表2表示本實(shí)施例中使用的反應(yīng)液的組成。
表2反應(yīng)液組成

接下頁(yè)表2，接上頁(yè)

*Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的循環(huán)測(cè)序用耐熱性DNA聚合酶。
在使用PPDK的反應(yīng)體系中由于背景發(fā)光小，增加熒光素酶的量，能使發(fā)光量增加數(shù)倍。所以即使微量的樣品也能靈敏地測(cè)定。
檢測(cè)的方案如下所述。按順序向反應(yīng)槽中加入4種ddNTP，進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)。只有注入與檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)的擬核酸堿基時(shí)，才進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，生成焦磷酸(PPi)。Ppi和AMP在PPDK的存在下反應(yīng)生成ATP。ATP成為熒光素酶反應(yīng)的底物，在發(fā)出熒光的同時(shí)，生成AMP和PPi。與實(shí)施例1相同，生成的PPi與AMP反應(yīng)再次生成ATP。即使在本實(shí)施例中，由于利用PPase或三磷酸腺苷雙磷酸酶分解PPi，因而發(fā)光強(qiáng)度緩慢降低。檢測(cè)對(duì)象樣品的基因型有純合和雜合的兩種情形。純合的情況下，互補(bǔ)鏈合成所伴隨的發(fā)光強(qiáng)度的急劇增加只觀察到1次，但雜合的情況下，則觀察到2次。通過(guò)觀察這種發(fā)光強(qiáng)度的變化，能檢測(cè)到作為靶的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的變異。
圖9是表2的試劑中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下的實(shí)施例。多態(tài)是A/G雜合的情形。已知道，只有注入與多態(tài)對(duì)應(yīng)的堿基的情況下，發(fā)光強(qiáng)度才急劇增加。使4種ddNTP或其衍生物按順序反應(yīng)的情況下，純合時(shí)能觀察到1次發(fā)光強(qiáng)度的急劇增加，雜合時(shí)能觀察到2次。在本實(shí)施例中由于不加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，而加入40mU/mL PPase，因而延伸時(shí)生成的PPi被PPase分解，發(fā)光強(qiáng)度緩慢減弱。其減少量比加入三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下要緩慢。在本發(fā)明中，由于使用ddNTP和其衍生物，延伸堿基數(shù)總保持每次1個(gè)堿基，判斷簡(jiǎn)便，如本實(shí)施例那樣，不加入試劑三磷酸腺苷雙磷酸酶也能判斷堿基的不同。
實(shí)施例3本發(fā)明的方法能在1個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)多個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNPs)。首先，作為第一個(gè)例子，對(duì)檢測(cè)對(duì)象SNPs是3個(gè)的情形進(jìn)行說(shuō)明。
SNPs幾乎都是由一般型(野生型)和其一個(gè)堿基被其他3種堿基中某一個(gè)特定取代而成的類型(變雜合)構(gòu)成。即，可以說(shuō)SNPs位點(diǎn)的變異通常有2種。因此，同時(shí)檢測(cè)3個(gè)多態(tài)的情況下，應(yīng)確定的堿基的個(gè)數(shù)一共為6個(gè)(2個(gè)×3種)。而且，由于自然界中可能存在的堿基有A、C、G、T 4種，對(duì)于3個(gè)SNPs，如果不同時(shí)測(cè)定組合完全相同的SNPs，則6個(gè)可采用的堿基的自由度一共為27。因此，完全確定3個(gè)SNPs的條件如下所示。
首先，為了使3個(gè)SNPs不成為完全相同的組合，有必要選擇檢測(cè)對(duì)象SNPs。另外，在3個(gè)SNPs的可采用堿基，即6個(gè)堿基中，有必要使4種堿基ACGT中的任一個(gè)都至少存在1個(gè)。例如，有必要如(A/G、A/G、T/C)那樣，在3種SNPs中含有2個(gè)相同的「A/G」組合；如(A/G、A/C、G/C)那樣，在3種SNPs中不完全含有4種堿基ACGT(此種情況下不含有「T」)。
關(guān)于檢測(cè)對(duì)象SNPs的組合的這些限定條件，由于單純通過(guò)與其對(duì)應(yīng)的引物的組合就可設(shè)定，所以不失一般性。下面，以3種檢測(cè)對(duì)象SNPs(SNP-1、SNP-2、SNP-3)分別是(A/C、A/G、C/T)的情形為例，對(duì)本發(fā)明中多個(gè)SNPs的檢測(cè)方法進(jìn)行具體說(shuō)明。
首先，向檢測(cè)對(duì)象DNA中加入3種引物，配制反應(yīng)液。然后如在實(shí)施例1和2中說(shuō)明的那樣，按順序加入4種ddNTP，觀察發(fā)光強(qiáng)度。加入的堿基不被插入的情況下發(fā)光強(qiáng)度為零，1個(gè)檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)被插入時(shí)發(fā)光強(qiáng)度為1。另外，加入的堿基與基因型為純合的1個(gè)SNPs對(duì)應(yīng)的情況下，或與基因型為雜合的2個(gè)SNPs對(duì)應(yīng)的情況下，發(fā)光強(qiáng)度都為2。而且，加入ddATP以外的擬核酸堿基時(shí)，在對(duì)應(yīng)的SNPs等位基因?yàn)榧兒蠒r(shí)，得到的發(fā)光強(qiáng)度為2，雜合時(shí)發(fā)光強(qiáng)度為1，但純合時(shí)，如果具有堿基A的等位基因，則為零。這樣，通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于加入的堿基的發(fā)光強(qiáng)度，能確定全部多態(tài)位點(diǎn)。
圖6表示3種檢測(cè)對(duì)象SNPs在各種組合時(shí)所觀察到的發(fā)光情況。發(fā)光強(qiáng)度合計(jì)都是6個(gè)單位。這18種組合的發(fā)光類型完全不同，由所得的發(fā)光類型能唯一確定多態(tài)位點(diǎn)。圖7是實(shí)際的測(cè)定例。這里使用了具有(A/C)、(A/G)、(C/T)3個(gè)SNPs的樣品。在測(cè)定例中加入T、G和C時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度為1個(gè)單位(702、703、704)，加入A時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度為3個(gè)單位(701)，由此確定樣品的基因型是(AA、AG、CT)。這相當(dāng)于圖6的案例13。
從圖6可知，只要滿足上述條件，利用本發(fā)明的方法對(duì)于任何SNPs都能唯一確定至3個(gè)。另外，對(duì)于檢測(cè)對(duì)象SNPs存在于1條DNA鏈上的情形和存在于不同DNA鏈上的情形，也同樣處理。
在本發(fā)明的方法中，ddNTP的注入是每次一種核酸堿基，加入的ddNTP即使有殘留，也沒(méi)有妨礙測(cè)定。因此沒(méi)有必要加入試劑中預(yù)先含有的PPase以外的分解酶。為了觀察到呈尖峰狀的發(fā)光信號(hào)，在本實(shí)施例的反應(yīng)液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，但不加進(jìn)行測(cè)定當(dāng)然也可以。
實(shí)施例4下面對(duì)多個(gè)SNPs的檢測(cè)例子進(jìn)行說(shuō)明。檢測(cè)多個(gè)SNPs的情形下，按順序在反應(yīng)槽中加入多個(gè)引物，再向其中按順序加入4種擬核酸堿基進(jìn)行測(cè)定(圖8)。因此為了不使引物之間發(fā)生部分雜交而阻礙互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)，將反應(yīng)溫度升至接近40℃(優(yōu)選32℃～40℃)，并且加入的引物量盡量少。優(yōu)選各引物的量與檢測(cè)對(duì)象DNA樣品等摩爾。
反應(yīng)槽中不加入引物的情況下，在加入ddNTP時(shí)，不產(chǎn)生發(fā)光(圖8最上面的圖)。在多個(gè)SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)中，為了不影響使用下一個(gè)引物的檢測(cè)，必須除去注入的ddNTP。ddNTP的除去方法有，如上述利用PPase和三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶的分解法和用反應(yīng)液沖洗的方法。
在使用第一個(gè)引物(primer-1)進(jìn)行第一次測(cè)定中，只有加入ddATP時(shí)，才能觀察到發(fā)光(信號(hào))(801)。這表示對(duì)應(yīng)于加入的引物的位點(diǎn)是基因型(AA)的純合。在加入新的引物進(jìn)行第二次測(cè)定時(shí)，由于當(dāng)殘留有以前使用的ddNTP時(shí)不好，因而向反應(yīng)槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶進(jìn)行分解。在進(jìn)行利用接下來(lái)的引物的測(cè)定中，ddNTP只要是在加入相同堿基的循環(huán)結(jié)束前，被分解即可，因而加入的三磷酸腺苷雙磷酸酶的量可以比焦磷酸測(cè)序技術(shù)少。
在使用第二個(gè)引物(primer-2)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，雖然能觀察到ddATP的若干發(fā)光(信號(hào))，但由其強(qiáng)度認(rèn)為，是在第一次的測(cè)定中插入未反應(yīng)的位點(diǎn)引起的(802)。在此測(cè)定中，添加ddGTP時(shí)觀察到強(qiáng)發(fā)光(信號(hào))。由此顯示對(duì)應(yīng)于第二個(gè)引物的位點(diǎn)是基因型(GC)的純合。
在使用第三個(gè)引物(primer-3)進(jìn)行測(cè)定中，注入ddATP和ddGTP時(shí)，得到幾乎相同強(qiáng)度的發(fā)光(信號(hào))(803)。由此顯示對(duì)應(yīng)于第三個(gè)引物的位點(diǎn)是基因型(AG)的雜合。
因此對(duì)于多個(gè)SNPs，通過(guò)按順序加入不同的引物進(jìn)行測(cè)定能分別確定SNPs的基因型。在本實(shí)施例中，按順序每次加入1個(gè)引物，也可以3個(gè)一起加入。在此情況下，添加3～4個(gè)引物可以確定大于等于10處的SNPs。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的檢測(cè)方法能有效地適用于特定位點(diǎn)的堿基序列的檢測(cè)、尤其是對(duì)含有單核苷酸(SNPs)和甲基化的基因的變異的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種堿基序列檢測(cè)方法，其特征在于，具有在含有核酸樣品的反應(yīng)槽中添加與堿基AGTC相對(duì)應(yīng)的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，使靶位點(diǎn)延伸一個(gè)堿基的工序；以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應(yīng)底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的工序；和利用上述化學(xué)發(fā)光判斷是否有互補(bǔ)鏈合成，確定上述靶位點(diǎn)的堿基序列的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，按順序每次向反應(yīng)槽中加入一種上述4種ddNTP或其衍生物進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用丙酮酸磷酸二激酶和AMP由上述互補(bǔ)鏈合成中得到的焦磷酸生成ATP。
4.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是熒光素酶引起的酶發(fā)光反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于上述反應(yīng)槽中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述的酶分解所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中生成的焦磷酸和/或ATP，在一定時(shí)間內(nèi)收集發(fā)光。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酶是焦磷酸酶和/或三磷酸腺苷雙磷酸酶。
8.一種堿基序列的檢測(cè)方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)2個(gè)或2個(gè)以上靶位點(diǎn)的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物，針對(duì)其中的2種或3種引物，同時(shí)進(jìn)行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補(bǔ)鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，由其結(jié)果確定與上述2種或3種引物對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)的堿基序列。
9.一種堿基序列的檢測(cè)方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)2個(gè)或2個(gè)以上靶位點(diǎn)的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物，針對(duì)一種引物，進(jìn)行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補(bǔ)鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)的堿基序列后，分解或除去反應(yīng)槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按順序利用接下來(lái)的引物確定靶位點(diǎn)。
10.一種堿基序列的檢測(cè)方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)2個(gè)或2個(gè)以上靶位點(diǎn)的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物，同時(shí)向反應(yīng)槽中添加2種或2種以上引物，進(jìn)行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補(bǔ)鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)的堿基序列后，分解或除去反應(yīng)槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按順序利用下一個(gè)或二個(gè)或二個(gè)以上引物確定靶位點(diǎn)。
11.如權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述靶位點(diǎn)是單堿基發(fā)生了變異或變化的位點(diǎn)。
12.堿基序列檢測(cè)用試劑盒，其包括下列1)～4)1)對(duì)應(yīng)于堿基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)熒光素和熒光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有分解焦磷酸和/或ATP的酶。
全文摘要
本發(fā)明提供價(jià)格便宜、重復(fù)性好、并且簡(jiǎn)便的堿基序列檢測(cè)方法，尤其是能在1個(gè)反應(yīng)槽中檢測(cè)多個(gè)變異位點(diǎn)。在含有核酸樣品的反應(yīng)槽中，添加與堿基AGTC相對(duì)應(yīng)的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，使靶位點(diǎn)延伸一個(gè)堿基，以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應(yīng)底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，利用上述化學(xué)發(fā)光判斷是否有互補(bǔ)鏈合成，確定上述靶位點(diǎn)的堿基序列。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1854308SQ20051009309
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者神原秀記, 周國(guó)華, 梶山智晴 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所