專利名稱：一種植物二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于植物基因工程育種的農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體，具體講是包含緊密連鎖的玉米泛素啟動(dòng)子Pubi調(diào)控的擬南芥冷響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子基因cbf1和擬南芥中特異的衰老基因的啟動(dòng)子SAG12調(diào)控的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶ipt基因的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及此雙元載體的構(gòu)建方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
許多抗凍植物，如擬南芥、油菜、大麥和黑麥等，其共同的特征是具有冷馴化響應(yīng)的特性，即在經(jīng)過0℃以上至10℃以下的低溫鍛煉后就具有抗凍的能力。在這一過程中，植物發(fā)生了一系列的生理和生化變化。在低溫脅迫下植物基因表達(dá)發(fā)生改變，包括原有蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增強(qiáng)、低溫特異性誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)等。因此，植物對(duì)低溫的適應(yīng)實(shí)際上是感受低溫信號(hào)、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和代謝的環(huán)境適應(yīng)過程。擬南芥上冷響應(yīng)(Cold responsive，COR)基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1，能識(shí)別冷響應(yīng)(Cold responsive，COR)基因中的CRT/DRE元件并與之結(jié)合，誘導(dǎo)COR基因的表達(dá)。人工構(gòu)建含有cbf1的農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體，并以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)將cbf1插入擬南芥基因組內(nèi)并使其超量表達(dá)，在非低溫條件下可以激活含有CRT/DRE的靶基因的表達(dá)，從而提高植物的抗凍性和耐脫水性(Jaglo-Ottosen等1998，Science，，280104-106；Liu等1998，PlantCell，101391-1046)。
但即使在低溫等逆境條件下能夠存活的植物，其葉片中細(xì)胞分裂素(CTK)含量下降(Yamada等1985，J Japan Soc Hort Sci，53419-426)植物易于衰老。CTK可直接或間接地清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化作用(Leshem等1981，PhysiolPlant，539-12)，提高SOD等膜保護(hù)酶的活性(王三根和梁穎1995，中國(guó)水稻科學(xué)，9223-229)。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl transferase，ipt)是細(xì)胞分裂素生物合成中的第一關(guān)鍵限速酶，它促使5`-AMP和異戊烯基腺嘌呤焦磷酸合成異戊烯基腺苷-5`-磷酸。此物質(zhì)很快被轉(zhuǎn)化成異戊烯基腺苷和異戊烯基腺嘌呤。這兩種物質(zhì)經(jīng)過細(xì)胞分裂素氧化酶作用分別形成玉米素核苷和玉米素。有關(guān)ipt轉(zhuǎn)化初期的研究發(fā)現(xiàn)，以原始ipt即未更換啟動(dòng)子的ipt為外源基因獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，細(xì)胞分裂素超量表達(dá)，葉片衰老明顯延緩，同時(shí)導(dǎo)致植株矮化叢生，完全失去頂端優(yōu)勢(shì)，葉片小而圓，根系不能形成，植株不能正常生長(zhǎng)發(fā)育(Smigocki等1988，PNAS，855131-5135；Beinsberger等1991，Plant CellPhysiology，32489-496)。為了消除植物組織中細(xì)胞分裂素過量表達(dá)產(chǎn)生的影響，研究者應(yīng)用了許多組織特異性啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如熱激啟動(dòng)子(Schmulling等1989，F(xiàn)EBS Lett，249401-406；Medford等1987，PlantCell，1403-413；Smart等1991，Plant Cell，3647-656；Van Loven 1993，J Exp Bot，441671-1678)、銅誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Mckenzie等1998，Plant Physiology，116969-977)、四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Kunkel等1999，Nat Biotechnol，116969-977)、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Smigocki等1988，PNAS，855131-5135)、果實(shí)特異性啟動(dòng)子(Martineau等1994，Plant J，511-19)、傷害誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Gatz等1998，Trends in Plant Sci.，3352-358)，都獲得了相應(yīng)的抗衰老植株，但由于它們或者誘導(dǎo)因子自身對(duì)植物生長(zhǎng)不利，大大限制了抗衰老遺傳轉(zhuǎn)化工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。1995年，Gan and Amasino將擬南芥中高度特異的衰老基因SAG12的啟動(dòng)子與農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens中Ti質(zhì)粒的ipt融合，構(gòu)建了一個(gè)可延緩衰老的自我調(diào)控系統(tǒng)。PSAG12-ipt的工作原理是當(dāng)葉片剛開始衰老時(shí)，SAG12啟動(dòng)子被激活，ipt開始表達(dá)，細(xì)胞分裂素濃度升高，衰老受到抑制；當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度達(dá)到一定水平，衰老的癥狀消失，SAG12啟動(dòng)子不再有活性，ipt不再表達(dá)，細(xì)胞分裂素的濃度也得到控制，從而防止過量的激素對(duì)植物的負(fù)面影響。用PSAG12-ipt基因轉(zhuǎn)化煙草(Can等1995，Science，2701986-1988)、水稻(付永彩等1999，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，0117-22)、番茄(張賽群等1999，園藝學(xué)報(bào)，26376-379)、牧草白三葉(Schroeder等2001，Journal of the American Society for Horticultural，126，523-530))、花椰菜(Chang等2003，Plant physiology，1322174-2183)、萵苣(McCabe等，2001)、青菜(袁政等2002，植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，28379-384)和小麥(奚亞軍等2004，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，371236-1238)，都已獲得了葉片衰老延緩的轉(zhuǎn)基因植株，且基本不影響植株的正常生長(zhǎng)與發(fā)育。
抗逆性育種一直是植物育種工作的重要目標(biāo)，由于植物對(duì)低溫等逆境的抗性是由微效多基因調(diào)控的，因此如果cbf1和ipt基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，將可能使植物獲得更好的抗寒性并保持旺盛的生命力。在過去的研究中僅構(gòu)建了含有cbf1或ipt其中一個(gè)功能基因的雙元載體。若要將兩個(gè)功能基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植株時(shí)必須進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，其結(jié)果將使轉(zhuǎn)基因植株后代中兩個(gè)功能基因的獨(dú)立遺傳概率極大升高，難以獲得兩個(gè)功能基因連鎖遺傳的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將cbf1和ipt兩個(gè)功能基因構(gòu)建到同一個(gè)農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體上，以使cbf1和ipt基因通過農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，同時(shí)轉(zhuǎn)入植物而獲得兩個(gè)功能基因緊密連鎖、穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系，使植物的抗逆性和抗衰老能力增強(qiáng)。
本發(fā)明的雙元表達(dá)載體，是包含緊密連鎖的擬南芥冷響應(yīng)基因COR的轉(zhuǎn)錄激活因子基因cbf1和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體。
本發(fā)明成功構(gòu)建了包含緊密連鎖的擬南芥冷響應(yīng)基因COR的轉(zhuǎn)錄激活因子基因cbf1和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體。利用此載體轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株明顯增強(qiáng)了對(duì)逆境的抗性，并延緩了逆境誘發(fā)的衰老。
本發(fā)明所構(gòu)建的雙元表達(dá)載體，其功能基因cbfl是由玉米泛素啟動(dòng)子Pubi調(diào)控，功能基因ipt是由擬南芥中特異的衰老基因的啟動(dòng)子Psag12所調(diào)控，其結(jié)構(gòu)參見圖1。
本發(fā)明所構(gòu)建的雙元表達(dá)載體，堿基對(duì)約17.3kb，其中T-DNA區(qū)約11kb，含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Psag12調(diào)控的ipt基因，組成型啟動(dòng)子Pubi調(diào)控的cbf1基因，以及組成型啟動(dòng)子CaMV35s調(diào)控的抗除草劑基因bar和報(bào)告基因gus。用Sac I和KpnI分別對(duì)其進(jìn)行酶切，產(chǎn)物在瓊脂糖濃度為1.5％的膠上，以3v/cm的電壓電永1h，經(jīng)EB染色后，在紫外光成像儀上應(yīng)得到其裂解圖譜為圖2。
本發(fā)明構(gòu)建的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法是以具有融合基因Pubi-cbf1的中間克隆載體、具有融合基因Psag12-ipt的中間克隆載體和雙元表達(dá)載體p3301為原始載體構(gòu)建的。
其中具有融合基因Pubi-cbf1的中間克隆載體，是含有融合基因Pubi-cbf1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌所得到的。分類命名為大腸桿菌埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏單位名稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào).中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2005年8月18日，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1440，保藏名稱為pUBC/DH5a.
pUBC/DH5a中質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖為圖3，堿基對(duì)約5.2kb，用HindIII單酶切可得到2.3+2.0+0.9kb三個(gè)片段。
具有融合基因Psag12-ipt的中間克隆載體，是含有融合基因Psag12-ipt的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌所得到的。分類命名為大腸桿菌埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏單位名稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào).中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2005年8月18日，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1441，保藏名稱為pSAGI/DH5a.
pSAGI/DH5a的結(jié)構(gòu)圖為圖4，堿基對(duì)約5.62kb，用SacI單酶切可以得到2.9+2.72kb兩個(gè)片段。
雙元表達(dá)載體p3301從PCAMBIA公司購(gòu)買。
本發(fā)明的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法是先將Psag12-ipt融合基因中的T-nos插入到雙元載體上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入不含T-nos的Psag12-ipt融合基因，從而得到完整的二價(jià)雙元載體。
具體講是用EcoRI和SacI酶切中間載體pSAGI，回收0.3kb的T-nos片段，同時(shí)用EcoRI和SacI酶切雙元載體p3301，回收11.3kb片段作為載體，用T4-DNA連接酶連接兩片段的相應(yīng)位點(diǎn)上，得到載體p3301-nos，新插入的T-nos片段5’端先后為SacI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)，均為單酶切位點(diǎn)，參見圖5。
用內(nèi)切酶HindIII酶切克隆載體pUBC，回收約3kb的融合基因Pubi-cbf1片段，同時(shí)用內(nèi)切酶HindIII酶切載體p3301-nos，回收11.6kb片段作為載體，將融合基因ubi-cbf1接到p3301-nos的Hind III位點(diǎn)上，得到載體p3301C-nos，其中融合基因ubi-cbf1為順時(shí)針方向，在p3301C-nos上新插入的T-nos的5’端有SacI單酶切位點(diǎn)。參見圖7。
用內(nèi)切酶SacI酶切中間克隆載體pSAGI，回收約2.7kb的不帶有T-nos的融合基因Psag12-ipt片段，同時(shí)用內(nèi)切酶Sac I酶切載體p3301C-nos，回收酶切產(chǎn)物中大片段作為載體，將不帶有T-nos的融合基因Psag12-ipt片段，正向插入到p3301C-nos的Sacl位點(diǎn)，得到二價(jià)雙元載體p3301IC。參見圖9。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明將玉米泛素啟動(dòng)子調(diào)控的抗逆基因cbf1和衰老特異性啟動(dòng)子調(diào)控的抗衰老基因ipt整合到同一個(gè)雙元載體上，利于兩個(gè)功能基因同時(shí)轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，與僅有兩功能基因其中之一的雙元載體所轉(zhuǎn)化的植物相比顯著的提高植物對(duì)逆境的抗性，并延緩了逆境所誘發(fā)的植物的衰老，使植物在逆境中，生長(zhǎng)期和綠期均明顯延長(zhǎng)。
2.該雙元載體轉(zhuǎn)化植物后，轉(zhuǎn)基因植株明顯矮壯，以僅有兩功能基因其中之一的雙元載體所轉(zhuǎn)化的植物為對(duì)照，莖桿明顯加粗；葉厚度增加10.8-18.5％；葉色濃綠，葉片中葉綠素a+b較對(duì)照增加22.3-30.6％，生長(zhǎng)期較對(duì)照延長(zhǎng)30-45天。在低溫或干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中脯氨酸和可溶性糖水平均明顯高于對(duì)照，植株也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性和抗干旱性。
3.本發(fā)明載體構(gòu)建步驟簡(jiǎn)單。如果按照傳統(tǒng)的方法，先后把兩個(gè)完整的融合基因Pubi-cbf1、Psag12-ipt插入到p3301比較困難，因?yàn)閱?dòng)子Pubi、Psag12以及功能基因ipt DNA序列上有大量常用的限制內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，要把它們構(gòu)建在同一個(gè)雙元載體上就必須避開這些酶切位點(diǎn)。在載體構(gòu)建中常用的方法是在目標(biāo)片段的兩端接上新的酶切位點(diǎn)，而找到合適的中間載體同樣很困難。經(jīng)過分析，我們采用了三個(gè)步驟成功地把兩個(gè)融合基因整合到一個(gè)雙元載體上。即首先把Psag12-ipt融合基因中的T-nos插入到雙元載體上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入Psag12-ipt融合基因，從而得到完整的二價(jià)雙元載體。


圖1二價(jià)雙元載體p3301IC的構(gòu)建2p3301IC酶切鑒定圖。圖中1為KpnI酶切10.0kb+3.1kb+2.7kb+0.86kb+0.74kb；2為SacI酶切14.4kb+2.9kb；M為Marker從上至下依次為4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。
圖3pUBC/DH5a的構(gòu)建4pSAGI/DH5a的構(gòu)建5載體p3301-nos的構(gòu)建6p3301-nos酶切鑒定圖。圖中1為KpnI酶切0.8+1.8kb；M為Marker從上至下依次為4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。
圖7載體p3301C-nos的構(gòu)建8p3301C-nos酶切鑒定圖。圖中1為KpnI酶切11.0+2.8+1.8kb；3為HindIII酶切11.6+2.0+1.0kb；M為Marker從上至下依次為4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5，0.2kb。
圖9二價(jià)雙元載體p3301IC的構(gòu)建圖
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1構(gòu)建載體p3301-Nos一、實(shí)驗(yàn)材料及試劑盒所用的限制性內(nèi)切酶及連接酶試劑盒均為NEB公司所產(chǎn)，DNA片段回收采用清華天為時(shí)代公司生產(chǎn)的柱離心試劑盒。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自清華天為時(shí)代公司。質(zhì)粒提取用清華天為時(shí)代公司生產(chǎn)的試劑盒，所有操作程序均按試劑盒說明書進(jìn)行。
二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容用EcoRI和SacI酶切中間載體pSAGI，回收0.3kb的T-Nos片段，同時(shí)用EcoRI和SacI酶切雙元載體p3301，回收11.3kb片段作為載體，用T4-DNA連接酶連接兩片段的相應(yīng)位點(diǎn)上，得到載體p3301-nos，新插入的T-nos片段5’端先后為SacI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)，均為單酶切位點(diǎn)。參見圖3，4。
三、實(shí)驗(yàn)步驟1、質(zhì)粒提取(1)所需設(shè)備0.5μl-1000μl不同規(guī)格移液器，離心機(jī)。
(2)提取質(zhì)粒程序參見試劑盒說明書。
2、質(zhì)粒酶切反應(yīng)(1)所需設(shè)備0.5-100μl不同規(guī)格移液器，離心機(jī)，37℃溫箱(2)反應(yīng)體系為EcoR I和SacI雙酶切體系質(zhì)粒 5μl(約1μg)10×buffer10.5μlEcoRI 0.5μl(約5個(gè)單位)SacI 0.5μl(約5個(gè)單位)10×BSA0.5μlddH2O 43μlTotal 50μl以上樣品混均后，完全酶切樣品置37℃溫育過夜。不完全酶切樣品置7℃溫育4min后取出，立即加入Loadimg buffer終止反應(yīng)。
3、片段回收(1)所需設(shè)備0.5μl-1000μl不同規(guī)格移液器，DNA電泳儀，紫外光成像系統(tǒng)，離心機(jī)。
(2)目標(biāo)片斷回收在濃度為0.8-1.5％瓊脂凝膠上電泳酶切產(chǎn)物，回收需要的片段。
4、DNA連接反應(yīng)(1)所需設(shè)備0.5-100μl不同規(guī)格移液器，離心機(jī)，PCR儀(用于提供16℃恒溫環(huán)境)。
(2)反應(yīng)體系目標(biāo)片段 10μl載體片段 2μl10×buffer 1.5μlT4連接酶 1.0μl(約10個(gè)單位)ddH2O 0.5μlTotal 15μl反應(yīng)體系中目標(biāo)片段與載體片段的摩爾比例為4∶1。樣品混勻后置于16℃下連接反應(yīng)2小時(shí).連接反應(yīng)產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌或保存于4℃冰箱內(nèi)備用。
5、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(1)所需設(shè)備水浴鍋，0.5μl-1000μl不同規(guī)格移液器，離心機(jī)。
(2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌程序參見試劑盒說明書。
實(shí)施例2構(gòu)建載體p3301C-nos試劑設(shè)備及實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下用內(nèi)切酶HindIII酶切克隆載體pUBC，回收約3kb的融合基因Pubi-cbf1片段，同時(shí)用內(nèi)切酶HindIII酶切載體p3301-nos，回收11.6kb片段作為載體，將融合基因Pubi-cbf1接到p3301-nos的HindIII位點(diǎn)上，得到載體p3301C-nos，其中融合基因Pubi-cbf1為順時(shí)針方向，在p3301C-nos上新插入的T-nos的5’端有SacI單酶切位點(diǎn)。參見圖5，6。
反應(yīng)體系為HindIII單酶體系質(zhì)粒 5μl(約1μg)
10×buffer2 0.5μlHindIII 0.5μl(約5個(gè)單位)ddH2O 44μlTotal 50μl實(shí)施例3構(gòu)建二價(jià)雙元載體p3301IC試劑設(shè)備及實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下用內(nèi)切酶Sac I酶切中間克隆載體pSAGI，回收約2.7kb的不帶有T-nos的融合基因Psag12-ipt片段，同時(shí)用內(nèi)切酶SacI酶切載體p3301C-nos，回收酶切產(chǎn)物中大片段作為載體，將不帶有T-nos的融合基因Psag12-ipt片段，正向插入到p3301C-nos的SacI位點(diǎn)，得到二價(jià)雙元載體p3301IC。參見圖7，2。
反應(yīng)體系為Sac I單酶切體系質(zhì)粒 5μl(約1μg)10×buffer1 0.5μlSacI 0.5μl(約5個(gè)單位)10×BSA 0.5μlddH2O 43.5μlTotal50μl實(shí)施例4二價(jià)雙元載體p3301IC轉(zhuǎn)化煙草按照無(wú)菌操作，挑取一個(gè)含p3301IC的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落轉(zhuǎn)移到3mL液體LB培養(yǎng)基(表一)中，此培養(yǎng)基還含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平，200rmp，28℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，再?gòu)闹腥?mL菌液轉(zhuǎn)移到含有50mL的LB培養(yǎng)液的250mL三角瓶?jī)?nèi)擴(kuò)大繁殖6小時(shí)。當(dāng)OD/600nm為0.35時(shí)，用50ml離心管收集菌液，以4000rmp離心10min，沉淀用等體積的農(nóng)桿菌重懸培養(yǎng)液，重新懸殊菌體，作轉(zhuǎn)化備用液。培養(yǎng)基成分除與上述含有卡那霉素和利福平的液體LB培養(yǎng)基成分相同外，另外還含有100μg/L的乙酰丁香酮。
取新發(fā)出的無(wú)菌煙草葉片，用解剖刀在垂直主脈方向劃3-5次，以劃斷葉脈、但不使葉片分成碎片為度，然后放到備用液內(nèi)浸泡4分鐘，取出葉片，后用無(wú)菌濾紙吸干菌液，接種到煙草分化培養(yǎng)基(Ms培養(yǎng)基(表二)另加激素為0.5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤(6-BA)、0.05mg/L萘乙酸(NAA))上。在25℃下黑暗中共培養(yǎng)4天后，用無(wú)菌水清洗葉片至清洗液澄清，無(wú)菌濾紙吸干多余的液體，轉(zhuǎn)到新的煙草分化培養(yǎng)基(另含250mg/L頭孢霉素)上培養(yǎng)8天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)基是在煙草分化培養(yǎng)基中分別加入2.5mg/L草丁膦(Sigma公司生產(chǎn))和250mg/L頭孢霉素。在選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生轉(zhuǎn)化植株，然后將再生的小植株轉(zhuǎn)到煙草生根培養(yǎng)基(Ms培養(yǎng)基(表二)附加激素為0.02mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.02mg/L萘乙酸(NAA))上，培養(yǎng)出完整植株。
轉(zhuǎn)化煙草植株矮狀，葉色深綠。在干旱、低溫等逆境脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉表面很快形成一層臘質(zhì)層，葉面有光澤，植株失水緩慢，表現(xiàn)出明顯的抗旱、抗寒性狀，延緩植株衰老。
實(shí)施例5二價(jià)雙元載體p330llC轉(zhuǎn)化香石竹受體材料為香石竹新生葉。農(nóng)桿菌浸染、轉(zhuǎn)化植株再生及篩選過程同實(shí)施例4。
轉(zhuǎn)化香石竹植株節(jié)間距比對(duì)照植株短，分枝增多，葉片相對(duì)較厚。在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中脯按酸、可溶性糖含量明顯高于未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株，丙二醛含量顯著低于對(duì)照植株，說明植株抗寒能力增強(qiáng)，并保持了旺盛的生命力。
表2

實(shí)施例的油墨，即使反復(fù)5次制版和印刷1000張的循環(huán)后，圖象性能沒有變化，并且油墨也沒有從滾筒泄漏。
權(quán)利要求
1.一種雙元表達(dá)載體，其特征在于所述雙元表達(dá)載體載有緊密連鎖的二價(jià)抗逆基因擬南芥冷響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄激活因子基因cbf1和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt。
2.按照權(quán)利要求1所述的雙元表達(dá)載體，其特征在于基因cbf1是由玉米泛素啟動(dòng)子Pubi調(diào)控，基因ipt是由擬南芥特異衰老基因啟動(dòng)子SAG12調(diào)控，所述的雙元表達(dá)載體結(jié)構(gòu)為
3.按照權(quán)利要求2所述的雙元表達(dá)載體，其特征在于所述雙元表達(dá)載體為17.3kb，其中T-DNA區(qū)為11kb，載有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PSAg12調(diào)控的ipt基因，組成型啟動(dòng)子Pubi調(diào)控的cbf1基因，以及組成型啟動(dòng)子CaMV35s調(diào)控的抗除草劑基因bar和報(bào)告基因gus。
4.按照權(quán)利要求1所述雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于以具有融合基因pUbi-cbf1的中間克隆載體、具有融合基因pSag-ipt的中間克隆載體和雙元表達(dá)載體p3301為原始載體構(gòu)建的。
5.按照權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的具有融合基因pUbi-cbf1的中間克隆載體，是含有融合基因Pubi-cbf1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌所得到的，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1440。
6.按照權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的具有融合基因pSag-ipt的中間克隆載體，是含有融合基因Psag12-ipt的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌所得到的，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1441。
7.按照權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于此二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法是先將Psag12-ipt融合基因中的T-Nos插入到雙元載體上，然后插入Pubi-cbf1融合基因，最后插入不含T-Nos的Psag12-ipt融合基因，從而得到完整的二價(jià)雙元載體。
8.按照權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于用EcoR I和SacI酶切中間載體Psag12-ipt，回收0.3kb的T-Nos片段，同時(shí)用EcoR I和SacI酶切雙元載體p3301，回收11.3kb片段作為載體，用T4-DNA連接酶連接兩片段的相應(yīng)位點(diǎn)上，得到載體p3301-Nos，新插入的T-Nos片段5’端先后為Sac I位點(diǎn)和Hind III位點(diǎn)，均為單酶切位點(diǎn)。
9.按照權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于用內(nèi)切酶Hind III酶切克隆載體pUbi-cbf1，回收約3kb的融合基因ubi-cbf1片段，同時(shí)用內(nèi)切酶Hind III酶切載體p3301-Nos，回收11.6kb片段作為載體，將融合基因ubi-cbf1接到p3301-NOS的Hind III位點(diǎn)上，得到載體p3301C-NOS，其中融合基因ubi-cbf1為順時(shí)針方向，在p3301C-Nos上新插入的T-Nos的5’端有SacI單酶切位點(diǎn)。
10.按照權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于用內(nèi)切酶Sac I酶切中間克隆載體pSag12-ipt，回收約2.7kb的不帶有T-Nos的融合基因Psag-ipt片段，同時(shí)用內(nèi)切酶Sac I酶切載體p3301C-Nos，回收酶切產(chǎn)物中大片段作為載體，將不帶有T-Nos的融合基因Psag12-ipt片段，正向插入到p3301C-NOS的SacI位點(diǎn)，得到二價(jià)雙元載體p3301IC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于植物基因工程育種的農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體，具體講是包含緊密連鎖的玉米泛素啟動(dòng)子Pubi調(diào)控的擬南芥冷響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄激活因子基因cbf1和擬南芥特異的衰老基因啟動(dòng)子SAG12調(diào)控的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶ipt基因的二價(jià)抗逆基因雙元表達(dá)載體。本發(fā)明通過三個(gè)步驟首先把sag12－ipt融合基因中的T－Nos插入到雙元載體上，然后插入ubi－cbf1融合基因，最后插入sag12－ipt融合基因，從而得到完整的二價(jià)雙元載體。此載體利于兩個(gè)功能基因同時(shí)轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，顯著的提高了轉(zhuǎn)化株對(duì)逆境的抗性，同時(shí)延緩了逆境所誘發(fā)的植物的衰老。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1757740SQ20051009283
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月22日
發(fā)明者孫振元, 韋善君, 錢永強(qiáng), 韓蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所