專利名稱：提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是一種雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化代謝工程策略提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿(TIAs)含量的方法。
背景技術(shù)：
長春花(Catharanthus roseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬植物，目前人們從長春花全草中分離了100多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)，如長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、阿嗎堿(Ajmalicine)、蛇根堿(Serpentine)、文多靈堿(Vindoline)、長春質(zhì)堿(Catharanthine)、洛克定堿(Lochneridine)、派文利堿(Perivine)等。大多數(shù)TIAs由于具有生物學(xué)活性而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)藥中，如著名的抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿可用于治療何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細(xì)胞型白血病、絨毛上皮細(xì)胞癌及其它癌癥，其硫酸鹽已廣泛用于臨床，是目前應(yīng)用最廣的天然植物抗腫瘤藥物。長春花中其它TIAs，如阿嗎堿和蛇根堿是高效降壓藥，文多靈、長春質(zhì)堿和環(huán)氧長春堿(Leurosine)具降血糖作用，可治療糖尿病，文多靈和長春質(zhì)堿是降血脂藥。長春堿和長春新堿是目前長春花中藥用價(jià)值最大、應(yīng)用最廣泛的抗癌TIAs。它們主要是從天然長春花植株中提取，但天然植物體內(nèi)含量極其微少，使得長春花材料來源困難。長春花中長春堿和長春新堿的含量還受到植株發(fā)育階段、細(xì)胞分區(qū)、組織分化和環(huán)境的影響，僅從天然植物中提取TIAs遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求。長春堿和長春新堿由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成和半合成成本太高，不具商業(yè)前景。毛狀根和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為生產(chǎn)這些有價(jià)值的生物堿帶來了希望。盡管通過毛狀根和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能產(chǎn)生單萜類吲哚生物堿阿嗎堿，但其含量太低不具商業(yè)前景，且細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能產(chǎn)生最具應(yīng)用價(jià)值的雙萜類吲哚生物堿長春堿和長春新堿。因此，提高植物生物堿含量和改變生物堿組成成份是非常必要的。代謝工程為改變植物細(xì)胞或毛狀根的組成成份和增加植物細(xì)胞或毛狀根生物堿產(chǎn)量提供了一條誘人的方法。為了更有效地生產(chǎn)長春花生物堿，開展TIAs生物合成途徑及其催化酶乃至基因的表達(dá)與調(diào)控研究，以及開展TIAs代謝工程研究將提高TIAs含量并最終解決抗腫瘤TIAs藥物稀缺的有效方法。
經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)中香葉醇-10-脫氫酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)和異胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase，STR)是長春花TIAs生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是TIAs代謝工程的重要靶點(diǎn)。采用基因工程手段，將所述的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因str和g10h共轉(zhuǎn)化長春花，將打破TIAs生物合成限速瓶頸，獲得長春花TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根或植株，為規(guī)?；a(chǎn)長春花TIAs提供一條新途徑，但尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法。本發(fā)明涉及的關(guān)鍵酶基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測、TIAs提取及含量測定、熒光定量PCR分析用于本發(fā)明，建立了提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，為長春花毛狀根大規(guī)模工廠化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，促進(jìn)了我國長春花藥物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從長春花中克隆str和g10h基因，構(gòu)建含所述DNA分子的植物表達(dá)載體，用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將str和g10h基因同時(shí)導(dǎo)入長春花細(xì)胞并再生出毛狀根；PCR和熒光定量PCR檢測外源目的基因str和g10h的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜測定長春花毛狀根中TIAs含量。
本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得長春花關(guān)鍵酶基因str和g10h；(2)把str和g10h基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含str和g10h基因的植物表達(dá)載體；(3)將含str和g10h基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化長春花的含str和g10h基因植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化長春花細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因毛狀根；(5)熒光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)；
(6)對獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根中TIAs含量進(jìn)行高效液相色譜法測定，獲得TIAs含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根。
所述的PCR檢測中，分別設(shè)計(jì)合成rolB、rolC、hpt、str和g10h基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因長春化毛狀根。
所述的高效液相色譜測定阿嗎堿、長春堿和長春新堿含量的方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩沖液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計(jì)算≥2000。
所述的熒光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)的方法為分別設(shè)計(jì)合成長春花TIAs生物合成途徑中的11個(gè)基因和看家基因18SrRNA的引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，用相對定量法分析基因相對表達(dá)量。
本發(fā)明的雙關(guān)鍵酶基因共轉(zhuǎn)化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，采用基因工程方法，將雙關(guān)鍵酶基因?qū)腴L春花毛狀根中，獲得了TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根無性系。TIAs高產(chǎn)長春花毛狀根的獲得，可以顯著增加長春花毛狀根中重要抗癌TIAs的含量，毛狀根中長春堿、長春新堿和阿嗎堿的含量分別是非轉(zhuǎn)化對照根的234.8倍、3.3倍和40.6倍，對解決抗癌TIAs藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1長春花str和g10h基因的克隆1.組織分離(Isolation)將長春花種子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaClO浸泡10min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養(yǎng)基中，25℃、12h/12h光照培養(yǎng)，即可獲得長春花無菌苗，待苗長至5cm左右后，切取葉片和莖段用于RNA提取。
2.RNA的分離(RNA isolation)稱取0.5g所述的長春花無菌試管苗，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200μL氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于4℃、12,000g離心15min；將上清液(約600μL)吸入干凈的1.5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4℃、12,000g離心10min；棄上清，加1mL 75％乙醇清洗，振蕩后，于4℃、7,500g離心5min；室溫干燥15-20min后溶于適量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。
3.基因克隆(Cloning of the genes)3.1.第一鏈cDNA的合成3.2.長春花str和g10h基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增根據(jù)所述str基因的編碼序列(SEQ ID NO.1)和g10h基因的編碼序列(SEQID NO.2)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的長春花str基因(SEQ ID NO.1)和g10h基因(SEQID NO.1)編碼序列一致。
本實(shí)施例采用基因克隆方法從長春花中獲得序列正確的TIAs生物合成關(guān)鍵酶基因str和g10h，為通過雙關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化策略提高長春花TIAs含量提供了兩個(gè)重要關(guān)鍵酶基因。
實(shí)施例2含str和g10h基因的植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建1.中間載體pCAMBIA1304+的構(gòu)建選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構(gòu)建雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+。具體地，HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121的GUS表達(dá)盒和pCAMBIA1304大片段；連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化篩選，抽質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。
2.植物表達(dá)載體pCAMBIA1304++str的構(gòu)建以所述的pCAMBIA1304+為表達(dá)載體，用實(shí)施例1中str替換其上的gus基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pGEM T-easy+str和pCAMBIA1304+，回收str和pCAMBIA1304+大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。
3.植物表達(dá)載體pCAMBIA1304++str+g10h的構(gòu)建以所述的pCAMBIA1304++str為基礎(chǔ)，用實(shí)施例1中的g10h替換pCAMBIA1304++str上的gfp+gus基因。具體地，BglII/BstEII雙酶切pCAMBIA1304++str和pGEM T-easy+g10h，回收pCAMBIA1304++str大片段和g10h基因小片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，g10h基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304++str中，從而獲得含str和g10h的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304++str+g10h。
本實(shí)施例將TIAs生物合成途徑關(guān)鍵酶基因str和g10h可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含str和g10h基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過代謝工程策略來提高長春花TIAs含量。
實(shí)施例3發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)str和g10h基因遺傳轉(zhuǎn)化長春花獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根1.含str和g10h基因雙元植物表達(dá)載體發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實(shí)施例2中含str和g10h基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌(如C58C1)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，含str和g10h基因植物雙元表達(dá)載體已成功構(gòu)建到發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)str和g10h基因轉(zhuǎn)化長春花2.1.外植體的預(yù)培養(yǎng)剪取實(shí)施例1中長春花無菌苗葉片(0.5cm×0.5cm)和莖段(0.5cm)外植體，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+AS 100μmol/L)上，25℃暗培養(yǎng)2d。
2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的預(yù)培養(yǎng)長春花葉片和莖段外植體，放入含活化好的所述發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡5min(輕輕搖動使外植體與菌液充分接觸)后，倒出懸液，用無菌吸水紙吸干表面余菌，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，暗培養(yǎng)2d。以浸泡在不帶有發(fā)根農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基中的葉片和莖段外植體為對照。
2.3.毛狀根的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)將所述的共培養(yǎng)2d的長春花外植體轉(zhuǎn)入到脫菌固體培養(yǎng)基(1/2MS+Cef250mg/L)上于25℃、16h/8h光照培養(yǎng)20天左右，可從外植體邊緣切口處長出毛狀根。剪取毛狀根(大約2-3cm)，將起源于一個(gè)單細(xì)胞的每條根作為一個(gè)無性系，接種于脫菌培養(yǎng)基(1/2MS+Cef 250mg/L)中暗培養(yǎng)兩周，選擇生長快、分枝好的毛狀根轉(zhuǎn)入脫菌培養(yǎng)基(1/2MS+Cef 250mg/L)中繼代篩選，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過5-6次繼代后即可完全脫菌。再將生長良好的長春花毛狀根轉(zhuǎn)入無抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右，轉(zhuǎn)基因毛狀根生長迅速、根毛和分枝逐漸增多、向地性喪失并可以在無植物激素的培養(yǎng)基上快速生長，具有典型的毛狀根特征。
3.轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根的PCR檢測設(shè)計(jì)Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)rol基因特異性引物，用PCR方法對所述毛狀根進(jìn)行分子檢測。由于目的基因str和g10h在植物表達(dá)載體上與潮霉素抗性基因(hpt)在同一個(gè)邊界內(nèi)，檢測hpt基因以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因毛狀根。根據(jù)目的基因str序列(SEQ IDNO.1)和g10h序列(SEQ ID NO.2)設(shè)計(jì)引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用rolB、rolC和hpt基因的PCR特異引物，能分別擴(kuò)增出423bp、622bp和812bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化長春花普通根基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。用目的基因str和g10h的PCR引物擴(kuò)增長春花毛狀根DNA，能擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果一致的特異目的片段。這說明誘導(dǎo)毛狀根形成的rolB、rolC基因和T-DNA區(qū)的hpt、str和g10h基因已經(jīng)整合到長春花基因組中。
本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化長春花的含str和g10h基因植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化長春花細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因毛狀根。轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根的獲得為篩選獲得TIAs含量高產(chǎn)的毛狀根提供了直接素材。
實(shí)施例4熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達(dá)1.引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)長春花TIAs生物合成代謝途徑基因(orca3、g10h、dxs、ggpps、asα、cpr、str、tdc、sgd、d4h和dat，共11個(gè))和看家基因18S rRNA全序列設(shè)計(jì)引物。引物擴(kuò)增基因片段長度在150-400bp之間。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2.RNA的提取、標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線參照實(shí)施例1中所述方法，從長春花毛狀根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因組DNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA為模板，分別用11對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)的11條基因的擴(kuò)增條帶。
PCR產(chǎn)物電泳回收，用紫外分光光度計(jì)測定所有目的基因原液的濃度和純度。標(biāo)準(zhǔn)品用10倍梯度稀釋法得到系列濃度的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品用熒光定量PCR方法測定，得到Ct值。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)對它們的Ct值作圖，得到滿意的11個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得到的11個(gè)基因相關(guān)系數(shù)(斜率-3.3左右，相關(guān)系數(shù)大于0.95)表明初始模板濃度的對數(shù)與循環(huán)閾值Ct之間存在著極強(qiáng)的線性關(guān)系，這為定量的準(zhǔn)確性提供了基礎(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)顯示，熒光定量PCR(FQ-PCR)反應(yīng)線性范圍極寬，可達(dá)5個(gè)log值的范圍(10-9-105μg/μL)，敏感度高，起始濃度在10-9μg/μL也可獲得良好的定量效果。參照標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線，可以準(zhǔn)確地得到樣品中起始模板的濃度。
3.熒光定量PCR檢測看家基因18S rRNA基因的表達(dá)為調(diào)整各樣品間在RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄過程中反應(yīng)效率的差異，檢測目的基因表達(dá)量的同時(shí)需檢測看家基因18S rRNA基因的表達(dá)。檢測18S rRNA和目的基因的熒光定量PCR的反應(yīng)體系如下

PCR反應(yīng)條件熱啟動和變性94℃15min，50個(gè)循環(huán)(94℃變性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec并檢測熒光，80℃20sec并檢測熒光)。
4.熔解曲線分析和熒光定量PCR產(chǎn)物的檢測所有PCR產(chǎn)物經(jīng)50個(gè)循環(huán)完成以后，以0.2℃/sec的速度使溫度從72℃緩慢上升到95℃。擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA隨溫度的升高逐漸變性解鏈為單鏈，SYBR GreenI染料逐漸釋放出來，熒光信號逐漸減弱，儀器每升高0.2℃檢測一次反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，最后得到擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號強(qiáng)度對溫度變化的熔解曲線(Melting curve)，定量PCR儀自動以dF/dT對溫度T作圖。根據(jù)熔解曲線的形狀和峰值對反應(yīng)管中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。為消除引物二聚體對Ct的影響，將每個(gè)循環(huán)中的讀板溫度調(diào)高到80℃，在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結(jié)合的SYBR-Green染料，從而消除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各待測樣品cDNA中各目的基因的原始濃度，然后以每份cDNA中目的基因濃度除以每份cDNA中的看家基因18S rRNA的濃度對每個(gè)樣品中目的基因的濃度進(jìn)行校正。每份樣品目的基因的校正濃度除以非轉(zhuǎn)化對照根中該目的基因的校正濃度，則表示樣品對非轉(zhuǎn)化對照根的相對表達(dá)量，非轉(zhuǎn)化對照根的表達(dá)量即為1。
通過研究，本發(fā)明中提供了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定長春花TIAs生物合成基因表達(dá)量的方法。應(yīng)用本發(fā)明的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、擴(kuò)增污染小等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，同一樣本可同時(shí)分析TIAs生物合成途徑中多個(gè)目的基因的表達(dá)，大大節(jié)約了成本。
5.熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中12個(gè)基因的表達(dá)用熒光定量PCR技術(shù)測定實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，str和g10h基因?qū)腴L春花毛狀根可誘導(dǎo)初級代謝中asα和ggpps的表達(dá)，還可誘導(dǎo)次級代謝中g(shù)10h、str、tdc、cpr、sgd、dat和d4h的表達(dá)。
本實(shí)施例采用熒光定量PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，通過基因表達(dá)量的高低可以初步篩選出TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根。
實(shí)施例5利用HPLC測定轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中TIAs含量1.毛狀根液體培養(yǎng)選取實(shí)施例3中生長迅速的長春花毛狀根無性系，在超凈工作臺上取出毛狀根培養(yǎng)物，無菌水沖洗掉瓊脂后，用無菌濾紙吸干表面水分，將毛狀根切成約5cm長的根段，放入裝有30mL 1/2MS液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，起始接種量為0.5-1.0g鮮重/瓶。將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)速為110rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上，于25℃黑暗下振蕩培養(yǎng)。每隔3d隨機(jī)抽取毛狀根培養(yǎng)物3瓶，用濾紙吸干毛狀根表面水分后，稱取鮮重，并計(jì)算毛狀根培養(yǎng)物的鮮重增值倍數(shù)。通過研究，在本發(fā)明中長春花毛狀根接種后的1-9d，毛狀根生長較緩慢，處于毛狀根生長的停滯期。9-21d毛狀根生長迅速，為快速生長的對數(shù)期，毛狀根繁殖系數(shù)從3.89增至47.87。21d后，生長速率開始下降，進(jìn)入生長平臺期。培養(yǎng)40d后，由于培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分的消耗，培養(yǎng)物開始褐化衰老，并逐漸變成淺黃色。
2.色譜條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制色譜柱C-18反相硅膠柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)。流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(體積比25∶75)。檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，靈敏度(AUFS＝1.0)，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計(jì)算不低于2000。
精密稱取長春堿、長春新堿和阿嗎堿標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg、5.0mg和10.0mg，用1mL甲醇完全溶解，分別得到10mg/mL長春堿、5mg/mL長春新堿和10mg/mL阿嗎堿對照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> HPLC流動相是由乙腈和5mM Na2HPO4(用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至6.0)組成的混合液。本發(fā)明中流動相乙腈-磷酸緩沖液在體積比25∶75時(shí)，長春新堿、阿嗎堿和長春堿的保留時(shí)間分別為3.195min、4.727min和6.232min，峰型良好，且可保證三種萜類吲哚生物堿良好分離。理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿計(jì)算不低于2000。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將所述對照品溶液分別稀釋1、2、5、10倍，在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，mg/L)進(jìn)行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中長春堿在2.5-25mg/L、長春新堿在2.5-25mg/L、阿嗎堿在2.5-25mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。長春堿、長春新堿和阿嗎堿對照品的線性回歸方程分別為<p>試驗(yàn)3、不同途徑應(yīng)用異煙肼的體內(nèi)抑菌作用比較以大白鼠為試驗(yàn)對象，重復(fù)試驗(yàn)2，結(jié)果見表1表1

以上結(jié)果表明，抗結(jié)核病藥物異煙肼經(jīng)不同途徑給藥的抑菌作用不同，以局部應(yīng)用的效果為好(P＜0.05)，其中局部注射異煙肼緩釋注射劑和局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果更好。
試驗(yàn)4、不同途徑應(yīng)用異煙肼的體內(nèi)抑菌作用比較以大白鼠為試驗(yàn)對象，重復(fù)試驗(yàn)3，但觀察動物至給藥后60天，結(jié)果見表2表2

以上結(jié)果表明，抗結(jié)核病藥物異煙肼經(jīng)不同途徑給藥的抑菌作用不同，以局部應(yīng)用的效果為好，其中局部注射異煙肼緩釋注射劑和局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果更好。但局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果比局部注射異煙肼緩釋注射劑的效果為好(P＜0.01)。
&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1044&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;長春花(Catharanthus roseus)&lt;400&gt;1atgatggcag ttttcttcat gtttttcctt cttcttcttt cttcttcttc ttcttcttct 60tcttcttcac caattttgaa aaagattttt attgaaagcc cttcctatgc tccgaatgcc120ttcaccttcg attcaactga taaagggttc tacacttccg tccaagatgg ccgagttatc180aaatatgaag ggccaaattc aggcttcact gacttcgcct acgcatctcc cttctggaac240aaagcttttt gtgagaacag caccgatcca gagaaaagac cattgtgtgg gaggacatat300gatatttcct atgactataa gaacagccaa atgtacattg ttgatggcca ttaccatctt360tgtgtggttg gaaaagaagg tgggtatgcc acacaactag ccacaagtgt gcaaggagtg420ccattcaaat ggctctatgc agtaactgtt gatcagagaa cagggattgt ttatttcact480gatgttagct ccatacatga tgacagtccc gaaggtgtgg aagaaatcat gaatacaagt540gatagaacag ggagattaat gaagtatgat ccttcaacaa aagaaaccac cttattattg600aaagagctac atgttcccgg cggtgcagaa atcagcgcag atggttcctt tgttgtagta660gcagaatttt taagcaatcg gatagtgaag tattggctag aagggccaaa gaaaggcagt720gcagagttct tagttacaat cccaaatcca ggaaatataa agaggaattc tgatggccat780ttttgggtgt cttcaagtga agaattagat ggaggtcaac atggaagtgt tgtttcaaga840ggaattaagt ttgatggatt tgggaatatt cttcaagtta taccacttcc accaccatat900gaaggtgaac attttgaaca gattcaagag cacgatggtt tgttatacat tggaagtctc960tcccatagct ctgtgggtat attagtgtat gatgatcatg ataacaaggg aaattcttat 1020gtttctcagc tagtcattaa ttga 1044SEQ ID NO.2的信息&lt;210&gt;2&lt;211&gt;1482&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;長春花(Catharanthus roseus)&lt;400&gt;2atggattacc ttaccataat attaacttta ctatttgcct tgactctcta tgaagccttc 60
agctacctat ccagaagaac caaaaacctt cctccaggac catcgccatt gccgttcatc120ggaagcctcc atttattagg cgaccaacca cacaaatcct tagcaaaact ttccaaaaaa180cacggtccaa ttatgagtct caaattaggc cagatcacta caatcgtcat atcttcatca240acaatggcga aagaagttct tcaaaaacag gatttagcat tttcaagcag atcagttcca300aacgcactcc acgctcacaa tcaattcaaa ttctccgttg tatggcttcc ggtagcctca360cgatggagaa gtcttcgaaa agttttgaat tctaatatat tttccggcaa tcggctcgac420gctaatcaac atttgagaac tagaaaagta caggaactaa ttgcgtattg ccggaaaaat480agccagagcg gagaagcggt tgacgtcggc cgagctgctt ttagaacttc gttgaatttg540ttgtcgaatt tgattttttc aaaggatttg acggatcctt attcggattc tgccaaggaa600ttcaaggatt tggtttggaa tataatggtt gaggcgggga aacctaattt ggtcgatttt660tttcccctgc ttgaaaaagt tgatcctcaa ggtatacgac atcgtatgac gattcacttt720ggggaagttc ttaagctttt tggtggactt gttaatgaaa gattggagca aagaagatca780aaaggggaaa aaaatgatgt gttggatgta cttctaacta ccagccaaga aagccctgag840gaaatcgata gaactcacat tgagcgaatg tgcttggacc tgtttgtagc agggacggac900acaacatcaa gcacattaga atgggcaatg tcagaaatgc ttaaaaaccc agacaaaatg960aagaaaaccc aagatgaact tgcacaagta atcggcagag gaaaaacaat agaagaatcc 1020gatattaacc gcttacctta cttaagatgc gttatgaaag aaaccttaag gatacatcca 1080ccagttccct tcttaattcc tcgcaaagtg gaacaaagtg ttgaggtttg tggatacaat 1140gtccctaaag gatcacaagt tcttgtgaat gcttgggcaa ttggacgtga tgaaactgtt 1200tgggatgatg ctttggcatt caaacccgag agatttatgg aatctgaatt ggatatccgt 1260ggaagagatt tcgagctgat tccgttcggt gctggccgaa gaatttgccc agggttgcca 1320ttggcactaa ggactgtgcc tttgatgctt ggttctttgt tgaactcttt taattggaag 1380cttgaaggtg ggatggctcc aaaagatttg gatatggagg agaagtttgg tattacactg 1440cagaaggctc atcctttgcg tgctgtacca agcacccttt aa 148權(quán)利要求
1.一種提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征在于，從長春花中克隆str和g10h基因，構(gòu)建含所述DNA分子的植物表達(dá)載體，用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將str和g10h基因同時(shí)導(dǎo)入長春花細(xì)胞并再生出毛狀根，PCR和熒光定量PCR檢測外源目的基因str和g10h的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜測定長春花毛狀根中TIAs含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得長春花關(guān)鍵酶基因str和g10h；(2)把str和g10h基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含str和g10h基因的植物表達(dá)載體；(3)將含str和g10h基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化長春花的含str和g10h基因植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化長春花細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因毛狀根；(5)熒光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)；(6)對獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根中TIAs含量進(jìn)行高效液相色譜法測定，獲得TIAs含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因毛狀根，分別設(shè)計(jì)合成rolB、rolC、hpt、str和g10h基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因長春化毛狀根。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的高效液相色譜法測定阿嗎堿、長春堿和長春新堿含量的方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩沖液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計(jì)算≥2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的熒光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)的方法為分別設(shè)計(jì)合成長春花TIAs生物合成途徑中的11個(gè)基因和看家基因18S rRNA的引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，用相對定量法分析基因相對表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高長春花毛狀根TIAs含量的方法。本發(fā)明從長春花中克隆str和g10h基因，構(gòu)建含str和g10h基因的植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化長春花獲得轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根，高效液相色譜法測定長春花毛狀根中TIAs含量，熒光定量PCR測定長春花毛狀根TIAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根中重要TIAs[抗癌藥物長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)]的含量顯著提高，其中長春堿含量比非轉(zhuǎn)化對照根提高了234倍，從而提供了一種提高長春花毛狀根TIAs的方法，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物長春堿和長春新堿提供了一種新方法。
文檔編號C12Q1/68GK1858212SQ20051011221
公開日2006年11月8日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者唐克軒, 龔一富, 廖志華, 苗志奇, 孫小芬 申請人:上海交通大學(xué)