專利名稱：用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的方法，特別是一種采用轉錄因子代謝工程策略提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿(TIAs)含量的方法。
背景技術：
長春花(Catharanthus roseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬植物，目前人們從長春花全草中分離了100多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)，如長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、阿嗎堿(Ajmalicine)、蛇根堿(Serpentine)、文多靈堿(Vindoline)、長春質堿(Catharanthine)、洛克定堿(Lochneridine)、派文利堿(Perivine)等。大多數(shù)TIAs由于具有生物學活性而被廣泛應用于現(xiàn)代醫(yī)藥中，如著名的抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿可用于治療何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細胞型白血病、絨毛上皮細胞癌及其它癌癥，其硫酸鹽已廣泛用于臨床，是目前應用最廣的天然植物抗腫瘤藥物。長春花中其它TIAs，如阿嗎堿和蛇根堿是高效降壓藥，文多靈、長春質堿和環(huán)氧長春堿(Leurosine)具降血糖作用，可治療糖尿病，文多靈和長春質堿是降血脂藥。長春堿和長春新堿是目前長春花中藥用價值最大、應用最廣泛的抗癌TIAs。它們主要是從天然長春花植株中提取，但天然植物體內含量極其微少，使得長春花材料來源困難。長春花中長春堿和長春新堿的含量還受到植株發(fā)育階段、細胞分區(qū)、組織分化和環(huán)境的影響，僅從天然植物中提取TIAs遠遠不能滿足市場需求。長春堿和長春新堿由于結構復雜，化學合成和半合成成本太高，不具商業(yè)前景。毛狀根和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)為生產(chǎn)這些有價值的生物堿帶來了希望。盡管通過毛狀根和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能產(chǎn)生單萜類吲哚生物堿阿嗎堿，但其含量太低不具商業(yè)前景，且細胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能產(chǎn)生最具應用價值的雙萜類吲哚生物堿長春堿和長春新堿。因此，提高植物生物堿含量和改變生物堿組成成份是非常必要的。代謝工程為改變植物細胞或毛狀根的組成成份和增加植物細胞或毛狀根生物堿產(chǎn)量提供了一條誘人的方法。為了更有效地生產(chǎn)長春花生物堿，開展TIAs生物合成途徑及其催化酶乃至基因的表達與調控研究，以及開展TIAs代謝工程研究將提高TIAs含量并最終解決抗腫瘤TIAs藥物稀缺的有效方法。
ORCA3(Octadecaniod-derivative Responsive Catharanthus AP2-domainprotein)是一個受MeJA誘導的植物基礎和次生代謝的轉錄調控因子。在長春花中，ORCA3可以增強TIAs生物合成代謝途徑上多個基因，包括dxs、asα、tdc、str、d4h的表達(van der Fits L，Memelink J.ORCA3，a jasmonate-responsivetranscriptional regulator of plant primary and secondary metabolism.Science，2000，289295-297)。作為TIAs生物合成代謝的中心調控者，orca3通過對初級和次級代謝中基因的協(xié)調調控來調節(jié)TIAs合成。在對現(xiàn)有文獻的分析中發(fā)現(xiàn)，TIAs生物合成基因g10h不受ORCA3的控制，G10H是TIAs生物合成的瓶頸。由于g10h基因不受ORCA3的誘導，將轉錄調控因子基因orca3和限速酶基因g10h共轉化長春花，將因為轉錄調控因子ORCA3的全局調控作用和G10H打破限速瓶頸作用而使代謝流源源不斷地向TIAs生物合成方向流動，從而獲得長春花TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根或植株，為規(guī)?；a(chǎn)長春花TIAs提供一條新途徑，但尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的采用轉錄因子和關鍵酶基因共轉化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法。本發(fā)明涉及的轉錄因子和關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、TIAs提取及含量測定、熒光定量PCR分析用于本發(fā)明，建立了提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，為長春花毛狀根大規(guī)模工廠化生產(chǎn)奠定堅實的基礎，促進了我國長春花藥物技術領域的發(fā)展。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明從長春花中克隆orca3和g10h基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用發(fā)根農(nóng)桿菌介導，將orca3和g10h基因同時導入長春花細胞并再生出毛狀根，PCR和熒光定量PCR檢測外源目的基因orca3和g10h的整合和表達情況，液相色譜測定長春花毛狀根中生物堿含量。
本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得長春花轉錄因子orca3和關鍵酶基因g10h；(2)把orca3和g10h基因可操作性地連于表達調控序列，形成含orca3和g10h基因的植物表達載體；(3)將含orca3和g10h基因的植物表達載體轉化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉化長春花的含orca3和g10h基因植物表達載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因毛狀根；(5)熒光定量PCR測定長春花毛狀根中生物堿生物合成相關基因的表達；(6)對獲得的轉基因毛狀根中生物堿含量進行液相色譜法測定，獲得生物堿含量顯著提高的轉基因長春花毛狀根。
所述的經(jīng)PCR檢測的轉基因毛狀根，分別設計合成rolB、rolC、hpt、orca3和g10h基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因長春化毛狀根。
所述的液相色譜測定長春花毛狀根中生物堿含量的方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩沖液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計算≥2000。
所述的熒光定量PCR測定長春花毛狀根中生物堿生物合成相關基因的表達的方法為分別設計合成長春花生物堿生物合成途徑中的11個基因和看家基因18S rRNA的引物，進行熒光定量PCR擴增，用相對定量法分析基因相對表達量。
本發(fā)明的轉錄調控因子和關鍵酶基因共轉化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，采用基因工程方法，將轉錄因子和關鍵酶基因導入長春花毛狀根中，獲得了TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根無性系。TIAs高產(chǎn)長春花毛狀根的獲得，可以顯著增加長春花毛狀根中重要抗癌TIAs的含量，毛狀根中長春堿和長春新堿的含量分別是非轉化對照根的197.3倍和3.8倍，對解決抗癌TIAs藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1長春花orca3和g10h基因的克隆1.組織分離(Isolation)將長春花種子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaClO浸泡10min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige andSkoog，1962)固體培養(yǎng)基中，25℃、12h/12h光照培養(yǎng)，即可獲得長春花無菌苗，待苗長至5cm左右后，切取葉片和莖段用于RNA提取。
2.RNA的分離(RNA isolation)稱取0.5g所述的長春花無菌試管苗，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200μL氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于4℃、12,000g離心15min；將上清液(約600μL)吸入干凈的1.5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4℃、12,000g離心10min；棄上清，加1mL 75％乙醇清洗，振蕩后，于4℃、7,500g離心5min；室溫干燥15-20min后溶于適量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因克隆(Cloning of the genes)3.1.第一鏈cDNA的合成3.2.長春花orca3和g10h基因編碼區(qū)的PCR擴增根據(jù)所述orca3基因的編碼序列(SEQ ID NO.1)和g10h基因的編碼序列(SEQ ID NO.2)，分別設計擴增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈eDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術服務有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的長春花orca3基因(SEQ ID NO.1)和g10h基因(SEQ ID NO.2)編碼序列一致。
本實施例采用基因克隆方法從長春花中獲得序列正確的轉錄因子orca3和TIAs生物合成關鍵酶基因str和g10h，為通過轉錄因子和關鍵酶基因轉化策略提高長春花TIAs含量提供了兩個重要基因。
實施例2含orca3和g10h基因的植物雙元表達載體的構建1.中間載體pCAMBIA1304+的構建選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構建雙元植物表達載體pCAMBIA1304+。具體地，HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121的GUS表達盒和pCAMBIA1304大片段；連接回收產(chǎn)物，轉化篩選，抽質粒酶切驗證。
2.植物表達載體pCAMBIA1304++orca3的構建以所述的pCAMBIA1304+為表達載體，用實施例1中orca3替換其上的gus基因。具體地，XbaI/SacI雙酶切pGEM T-easy+str和pCAMBIA1304+，回收orca3和pCAMBIA1304+大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
3.植物表達載體pCAMBIA1304++orca3+g10h的構建以所述的pCAMBIA1304++orca3為基礎，用實施例1中的g10h替換pCAMBIA1304++orca3上的gfp+gus基因。具體地，BglII/BstEII雙酶切pCAMBIA1304++orca3和pGEM T-easy+g10h，回收pCAMBIA1304++orca3大片段和g10h基因小片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。結果表明，g10h基因已被成功構建到植物表達載體pCAMBIA1304++orca3中，從而獲得含orca3和g10h的植物表達載體pCAMBIA1304++orca3+g10h。
本實施例將轉錄因子orca3和TIAs生物合成途徑關鍵酶基因g10h可操作性地連于表達調控序列，形成含orca3和g10h基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高長春花TIAs含量。
實施例3發(fā)根農(nóng)桿菌介導orca3和g10h基因遺傳轉化長春花獲得轉基因毛狀根1.含orca3和g10h基因雙元植物表達載體發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實施例2中含orca3和g10h基因的植物雙元表達載體轉入發(fā)根農(nóng)桿菌(如C58C1)，并進行PCR驗證。結果表明，含orca3和g10h基因植物雙元表達載體已成功構建到發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導orca3和g10h基因轉化長春花2.1.外植體的預培養(yǎng)剪取實施例1中長春花無菌苗葉片(0.5cm×0.5cm)和莖段(0.5cm)外植體，接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+AS 100μmol/L)上，25℃暗培養(yǎng)2d。
2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的預培養(yǎng)長春花葉片和莖段外植體，放入含活化好的所述發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡5min(輕輕搖動使外植體與菌液充分接觸)后，倒出懸液，用無菌吸水紙吸干表面余菌，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，暗培養(yǎng)2d。以浸泡在不帶有發(fā)根農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基中的葉片和莖段外植體為對照。
2.3.毛狀根的誘導和繼代培養(yǎng)將所述的共培養(yǎng)2d的長春花外植體轉入到脫菌固體培養(yǎng)基(1/2MS+Cef250mg/L)上于25℃、16h/8h光照培養(yǎng)20天左右，可從外植體邊緣切口處長出毛狀根。剪取毛狀根(大約2-3cm)，將起源于一個單細胞的每條根作為一個無性系，接種于脫菌培養(yǎng)基(1/2MS+Cef 250mg/L)中暗培養(yǎng)兩周，選擇生長快、分枝好的毛狀根轉入脫菌培養(yǎng)基(1/2MS+Cef 250mg/L)中繼代篩選，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過5-6次繼代后即可完全脫菌。再將生長良好的長春花毛狀根轉入無抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右，轉基因毛狀根生長迅速、根毛和分枝逐漸增多、向地性喪失并可以在無植物激素的培養(yǎng)基上快速生長，具有典型的毛狀根特征。
3.轉基因長春花毛狀根的PCR檢測設計Ri質粒T-DNA區(qū)rol基因特異性引物，用PCR方法對所述毛狀根進行分子檢測。由于目的基因orca3和g10h在植物表達載體上與潮霉素抗性基因(hpt)在同一個邊界內，檢測hpt基因以確認轉基因毛狀根。根據(jù)目的基因orca3序列(SEQ ID NO.1)和g10h序列(SEQ ID NO.2)設計引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用rolB、rolC和hpt基因的PCR特異引物，能分別擴增出423bp、622bp和812bp的特異DNA片段。而以非轉化長春花普通根基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。用目的基因orca3和g10h的PCR引物擴增長春花毛狀根DNA，能擴增出與預期結果一致的特異目的片段。這說明誘導毛狀根形成的rolB、rolC基因和T-DNA區(qū)的hpt、orca3和g10h基因已經(jīng)整合到長春花基因組中。
本實施例將所述的植物表達載體轉化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉化長春花的含orca3和g10h基因植物表達載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株，利用所構建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因毛狀根。轉基因長春花毛狀根的獲得為篩選獲得TIAs含量高產(chǎn)的毛狀根提供了直接素材。
實施例4熒光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達1.引物的設計和合成根據(jù)長春花TIAs生物合成代謝途徑基因(orca3、g10h、dxs、ggpps、asα、cpr、str、tdc、sgd、d4h和dat，共11個)和看家基因18S rRNA全序列設計引物。引物擴增基因片段長度在150-400bp之間。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2.RNA的提取、標準品的制備和標準工作曲線參照實施例1中所述方法，從長春花毛狀根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因組DNA，用反轉錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA為模板，分別用11對引物進行PCR擴增獲得相應的11條基因的擴增條帶。
PCR產(chǎn)物電泳回收，用紫外分光光度計測定所有目的基因原液的濃度和純度。標準品用10倍梯度稀釋法得到系列濃度的目的基因標準品。每個標準品用熒光定量PCR方法測定，得到Ct值。以每個標準濃度的對數(shù)對它們的Ct值作圖，得到滿意的11個基因標準工作曲線。得到的11個基因相關系數(shù)(斜率-3.3左右，相關系數(shù)大于0.95)表明初始模板濃度的對數(shù)與循環(huán)閾值Ct之間存在著極強的線性關系，這為定量的準確性提供了基礎。標準曲線同時顯示，熒光定量PCR(FQ-PCR)反應線性范圍極寬，可達5個log值的范圍(10-9-10-5μg/μL)，敏感度高，起始濃度在10-9μg/μL也可獲得良好的定量效果。參照標準品工作曲線，可以準確地得到樣品中起始模板的濃度。
3.熒光定量PCR檢測看家基因18S rRNA基因的表達為調整各樣品間在RNA抽提和逆轉錄過程中反應效率的差異，檢測目的基因表達量的同時需檢測看家基因18S rRNA基因的表達。檢測18S rRNA和目的基因的熒光定量PCR的反應體系如下

PCR反應條件熱啟動和變性94℃15min，50個循環(huán)(94℃變性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec并檢測熒光，80℃20sec并檢測熒光)。
4.熔解曲線分析和熒光定量PCR產(chǎn)物的檢測所有PCR產(chǎn)物經(jīng)50個循環(huán)完成以后，以0.2℃/sec的速度使溫度從72℃緩慢上升到95℃。擴增產(chǎn)物雙鏈DNA隨溫度的升高逐漸變性解鏈為單鏈，SYBRGreen I染料逐漸釋放出來，熒光信號逐漸減弱，儀器每升高0.2℃檢測一次反應管內熒光強度的變化，最后得到擴增產(chǎn)物熒光信號強度對溫度變化的熔解曲線(Melting curve)，定量PCR儀自動以dF/dT對溫度T作圖。根據(jù)熔解曲線的形狀和峰值對反應管中的擴增產(chǎn)物進行鑒定。為消除引物二聚體對Ct的影響，將每個循環(huán)中的讀板溫度調高到80℃，在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結合的SYBR-Green染料，從而消除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號。
根據(jù)標準曲線，求出各待測樣品cDNA中各目的基因的原始濃度，然后以每份cDNA中目的基因濃度除以每份cDNA中的看家基因18S rRNA的濃度對每個樣品中目的基因的濃度進行校正。每份樣品目的基因的校正濃度除以非轉化對照根中該目的基因的校正濃度，則表示樣品對非轉化對照根的相對表達量，非轉化對照根的表達量即為1。
通過研究，本發(fā)明中提供了一種實時熒光定量PCR測定長春花TIAs生物合成基因表達量的方法。應用本發(fā)明的方法，具有快速、準確、靈敏度高、擴增污染小等優(yōu)點，同時，同一樣本可同時分析TIAs生物合成途徑中多個目的基因的表達，大大節(jié)約了成本。
5.熒光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中12個基因的表達用熒光定量PCR技術測定實施例3轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達情況，結果表明，orca3和g10h基因導入長春花毛狀根可誘導初級代謝中ggpps的表達，還可誘導次級代謝中g10h、str、tdc、sgd和dat的表達。
本實施例采用熒光定量PCR技術測定轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達，通過基因表達量的高低可以初步篩選出TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根。
實施例5利用HPLC測定轉基因長春花毛狀根中TIAs含量1.毛狀根液體培養(yǎng)選取實施例3中生長迅速的長春花毛狀根無性系，在超凈工作臺上取出毛狀根培養(yǎng)物，無菌水沖洗掉瓊脂后，用無菌濾紙吸干表面水分，將毛狀根切成約5cm長的根段，放入裝有30mL 1/2MS液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，起始接種量為0.5-1.0g鮮重/瓶。將培養(yǎng)瓶置于轉速為110rpm的旋轉式搖床上，于25℃黑暗下振蕩培養(yǎng)。每隔3d隨機抽取毛狀根培養(yǎng)物3瓶，用濾紙吸干毛狀根表面水分后，稱取鮮重，并計算毛狀根培養(yǎng)物的鮮重增值倍數(shù)。通過研究，在本發(fā)明中長春花毛狀根接種后的1-9d，毛狀根生長較緩慢，處于毛狀根生長的停滯期。9-21d毛狀根生長迅速，為快速生長的對數(shù)期，毛狀根繁殖系數(shù)從3.89增至47.87。21d后，生長速率開始下降，進入生長平臺期。培養(yǎng)40d后，由于培養(yǎng)基內營養(yǎng)成分的消耗，培養(yǎng)物開始褐化衰老，并逐漸變成淺黃色。
2.色譜條件及系統(tǒng)適用性以及標準溶液的配制色譜柱C-18反相硅膠柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)。流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(體積比25∶75)。檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度(AUFS＝1.0)，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計算不低于2000。
精密稱取長春堿、長春新堿和阿嗎堿標準品10.0mg、5.0mg和10.0mg，用1mL甲醇完全溶解，分別得到10mg/mL長春堿、5mg/mL長春新堿和10mg/mL阿嗎堿對照品溶液，作為標準品貯備液，保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> HPLC流動相是由乙腈和5mM Na2HPO4(用H3PO4調節(jié)pH值至6.0)組成的混合液。本發(fā)明中流動相乙腈-磷酸緩沖液在體積比25∶75時，長春新堿、阿嗎堿和長春堿的保留時間分別為3.195min、4.727min和6.232min，峰型良好，且可保證三種萜類吲哚生物堿良好分離。理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿計算不低于2000。
3.標準曲線的制作將所述對照品溶液分別稀釋1、2、5、10倍，在相應色譜條件下進樣，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品濃度(X，mg/L)進行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中長春堿在2.5-25mg/L、長春新堿在2.5-25mg/L、阿嗎堿在2.5-25mg/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。長春堿、長春新堿和阿嗎堿對照品的線性回歸方程分別為

4.樣品的制備和TIAs含量的測定收集所述液體培養(yǎng)30d的長春花轉基因毛狀根，用濾紙吸干表面培養(yǎng)基，稱取鮮重，于60℃烘干48h至恒重，稱其干重。將毛狀根放入研缽中，加入少量石英砂，研磨，加入95％乙醇(1∶5，W/V)，50℃超聲提取30min，冷卻至室溫，對提取液離心(12,000rpm)10min，吸取上清液，于12,000rpm再離心10min，吸取上清液，用HPLC法測量TIAs含量。
分別吸取所述對照品溶液和供試樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄各組分峰面積，代入線性回歸方程，計算即得樣品TIAs含量。
在本發(fā)明中共轉orca3/g10h基因顯著提高長春花毛狀根TIAs含量。共轉orca3/g10h基因長春花毛狀根中長春堿和長春新堿的平均含量分別為51.30mg/g DW和6.93mg/g DW，是非轉化普通根的197.3倍和3.8倍(0.26mg/g DW長春堿和1.81mg/g DW長春新堿)。共轉orca3/g10h基因毛狀根總TIAs含量為58.23mg/g DW，是非轉化普通根的27.5倍(2.12mg/g DW)。在所測試的共轉orca3/g10h長春花毛狀根無性系中，OG28中TIAs含量最高(60.33mg/g DW)。
本實施例采用HPLC法測定了轉基因長春花毛狀根TIAs含量。采用共轉化orca3和g10h基因的代謝工程策略獲得了TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根，為規(guī)?；a(chǎn)長春花TIAs并最終解決TIAs匱乏提供了一種理想方法。
本發(fā)明涉及的序列和記號分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學<120>用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法<140>
<141>2005-12-05<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>612<212>DNA<213>長春花(Catharanthus roseus)<400>1atgtccgaag aaatcatttc cgtctcagat cgatttcttc tttccttaat cgaagaacat 60cttctcagcg ataattctga tgattccagc tcggaattga cttctacaga ggaaaattgg120gaagaaattt ttgcagattt tctaaattgg tcgggatccg aaatacagaa acgcggtagc180ccgagttccg aaagctgtca atcgaattca atggcggaaa gctgtcagga ggattctgtt240gtgggaaccc cgccagaagc ggcggccgga ggaggttgtt cgaaggattg gaaccggtat300aagggcgtta gacggcggcc gtgggggaag ttcgcggcgg agataaggga tccgaaaaag360aaaggatcca ggatttggtt gggtacatac gagacacctg aggatgcagc attggcttat420gatgcagccg cgtttaatat gcgtggagct aaagctaggc ttaattttcc tcatttgatt480ggttcgaata tttccggacc cgttagagta aacccgagaa aacgtttccc tgcggagcct540tctacgacgt cgtcgtcttc ttcttcttct tcgtctgaaa atagtggagg aaggaagaag600agacgatatt aa612SEQ ID NO.2的信息
<210>2<211>1482<212>DNA<213>長春花(Catharanthus roseus)<400>2atggattacc ttaccataat attaacttta ctatttgcct tgactctcta tgaagccttc 60agctacctat ccagaagaac caaaaacctt cctccaggac catcgccatt gccgttcatc 120ggaagcctcc atttattagg cgaccaacca cacaaatcct tagcaaaact ttccaaaaaa 180cacggtccaa ttatgagtct caaattaggc cagatcacta caatcgtcat atcttcatca 240acaatggcga aagaagttct tcaaaaacag gatttagcat tttcaagcag atcagttcca 300aacgcactcc acgctcacaa tcaattcaaa ttctccgttg tatggcttcc ggtagcctca 360cgatggagaa gtcttcgaaa agttttgaat tctaatatat tttccggcaa tcggctcgac 420gctaatcaac atttgagaac tagaaaagta caggaactaa ttgcgtattg ccggaaaaat 480agccagagcg gagaagcggt tgacgtcggc cgagctgctt ttagaacttc gttgaatttg 540ttgtcgaatt tgattttttc aaaggatttg acggatcctt attcggattc tgccaaggaa 600ttcaaggatt tggtttggaa tataatggtt gaggcgggga aacctaattt ggtcgatttt 660tttcccctgc ttgaaaaagt tgatcctcaa ggtatacgac atcgtatgac gattcacttt 720ggggaagttc ttaagctttt tggtggactt gttaatgaaa gattggagca aagaagatca 780aaaggggaaa aaaatgatgt gttggatgta cttctaacta ccagccaaga aagccctgag 840gaaatcgata gaactcacat tgagcgaatg tgcttggacc tgtttgtagc agggacggac 900acaacatcaa gcacattaga atgggcaatg tcagaaatgc ttaaaaaccc agacaaaatg 960aagaaaaccc aagatgaact tgcacaagta atcggcagag gaaaaacaat agaagaatcc1020gatattaacc gcttacctta cttaagatgc gttatgaaag aaaccttaag gatacatcca1080ccagttccct tcttaattcc tcgcaaagtg gaacaaagtg ttgaggtttg tggatacaat1140gtccctaaag gatcacaagt tcttgtgaat gcttgggcaa ttggacgtga tgaaactgtt1200tgggatgatg ctttggcatt caaacccgag agatttatgg aatctgaatt ggatatccgt1260ggaagagatt tcgagctgat tccgttcggt gctggccgaa gaatttgccc agggttgcca1320
ttggcactaa ggactgtgcc tttgatgctt ggttctttgt tgaactcttt taattggaag1380cttgaaggtg ggatggctcc aaaagatttg gatatggagg agaagtttgg tattacactg1440cagaaggctc atcctttgcg tgctgtacca agcacccttt aa
權利要求
1.一種用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征在于，從長春花中克隆orca3和g10h基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用發(fā)根農(nóng)桿菌介導，將orca3和g10h基因同時導入長春花細胞并再生出毛狀根，PCR和熒光定量PCR檢測外源目的基因orca3和g10h的整合和表達情況，液相色譜測定長春花毛狀根中生物堿含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得長春花轉錄因子orca3和關鍵酶基因g10h；(2)把orca3和g10h基因可操作性地連于表達調控序列，形成含orca3和g10h基因的植物表達載體；(3)將含orca3和g10h基因的植物表達載體轉化發(fā)根農(nóng)桿菌，獲得用于轉化長春花的含orca3和g10h基因植物表達載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因毛狀根；(5)熒光定量PCR測定長春花毛狀根中生物堿生物合成相關基因的表達；(6)對獲得的轉基因毛狀根中生物堿含量進行液相色譜法測定，獲得生物堿含量顯著提高的轉基因長春花毛狀根。
3.根據(jù)權利要求1所述的用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測的轉基因毛狀根，分別設計合成rolB、rolC、hpt、orca3和g10h基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因長春化毛狀根。
4.根據(jù)權利要求1所述的用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的液相色譜法測定長春花毛狀根中生物堿含量的方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩沖液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數(shù)按長春堿、長春新堿和阿嗎堿峰計算≥2000。
5.根據(jù)權利要求1所述的用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法，其特征是，所述的熒光定量PCR測定長春花毛狀根中生物堿生物合成相關基因的表達的方法為分別設計合成長春花生物堿生物合成途徑中的11個基因和看家基因18S rRNA的引物，進行熒光定量PCR擴增，用相對定量法分析基因相對表達量。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術領域的用轉錄因子提高長春花毛狀根萜類吲哚生物堿含量的方法。本發(fā)明從長春花中克隆str和g10h基因，構建含str和g10h基因的植物表達載體，遺傳轉化長春花獲得轉基因長春花毛狀根，液相色譜法測定長春花毛狀根中生物堿含量，熒光定量PCR測定長春花毛狀根生物堿生物合成相關基因的表達。本發(fā)明獲得的轉基因長春花毛狀根中重要生物堿的含量顯著提高，其中長春堿含量比非轉化對照根提高了234倍，從而提供了一種提高長春花毛狀根生物堿的方法，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物長春堿和長春新堿提供了一種新方法。
文檔編號C12N15/82GK1807631SQ20061002323
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權日2006年1月12日
發(fā)明者唐克軒, 龔一富, 廖志華, 苗志奇, 孫小芬 申請人:上海交通大學