專利名稱：利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)技術(shù)及其次生代謝產(chǎn)物有效成分提取方法，特別是利用虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)白藜蘆醇虎杖內(nèi)生菌來源于虎杖(Polygonum cuspidatum Siebet Zucc)植物，經(jīng)初步鑒定為內(nèi)生真菌為青霉屬，內(nèi)生細(xì)菌為G桿菌假單胞菌屬。虎杖為蓼科蓼屬小灌木，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代藥學(xué)研究證明其白藜蘆醇(Resveratrol)(3，4’，5三羥基二苯乙烯)具有多種藥理作用，主要表現(xiàn)在抗癌和治療心血管疾病等方面。
查新發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于“從虎杖中提取白藜蘆醇”方面的文獻(xiàn)和專利已有報(bào)道。如中國(guó)專利CN1251361與法國(guó)專利FR2795964的提取工藝為在粉術(shù)狀虎杖原料中加入復(fù)合酶在恒溫下進(jìn)行酶解反應(yīng)，48-72小時(shí)獲得酶解原料，再用溶劑萃取、濃縮獲得含白藜蘆醇的半成品，置24-120d，時(shí)，并攪拌，然后用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，再經(jīng)進(jìn)一步純化處理，制得白藜蘆醇和白藜蘆醇甙?！短旖蛩帉W(xué)》(1999.11.07)發(fā)表的“虎杖的化學(xué)成份、藥理作用與提取分離”是將虎杖根粗粉用乙醇回流提取，回收乙醇至浸膏狀，加水溶解、過濾，水液濃縮，濃縮液用聚酰胺層析，再用20％乙醇洗脫得到白藜蘆醇甙。中國(guó)專利CN1239141公開了一種從葡萄莖根葉提取白藜蘆醇產(chǎn)品的工藝方法。中國(guó)專利513823A公開了采用超臨界CO2提取白藜蘆醇工藝。但總的來說，這類方法工藝操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，質(zhì)量產(chǎn)品較低。
目前國(guó)內(nèi)外均是從植物中提取白藜蘆醇，未見利用微生物發(fā)酵提取的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)及提取白藜蘆醇的方法，其克服了白藜蘆醇僅從植物中提取的單一途徑，可避免植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、地域和環(huán)境等因素的限制；虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)條件較寬松，成本很低；提取物較高且較干凈，環(huán)境污染少，操作性強(qiáng)。
為達(dá)到目的，本發(fā)明的實(shí)施方案為一種利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、用葡萄糖作為碳源、硝酸銨作為氮源，用產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)虎杖內(nèi)生真菌或虎杖內(nèi)生細(xì)菌；(2)、菌液取出后在100r/min下均質(zhì)15min以使其細(xì)胞壁破碎，再用超聲波處理30min；(3)、用乙酸乙酯萃取12h，靜置分層；(4)、收集萃取液，將萃取液濃縮至干。
所述步驟(3)中所得下相應(yīng)第二次用乙酸乙酯萃取6h，乙酸乙酯∶下相液＝1∶0.5。
所述產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生菌的分離方法主要為A、對(duì)虎杖根狀莖進(jìn)行表面升汞殺菌，接種根狀莖組織塊于固體培養(yǎng)劑(MS)上，培養(yǎng)10-15天，并接種數(shù)次；B、對(duì)根狀莖產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其中愈傷組織仍有微生物生長(zhǎng)，對(duì)其中微生物進(jìn)行分離；C、對(duì)分離出的微生物進(jìn)行逐個(gè)分離，純化；D、對(duì)每個(gè)微生物分別進(jìn)行培養(yǎng)，并用乙酸乙酯提取培養(yǎng)液及破碎細(xì)胞中的白藜蘆醇；E、用薄板層析法對(duì)提取液進(jìn)行分離，并采用薄層掃描儀進(jìn)行檢測(cè)白藜蘆醇含量；F、經(jīng)過分離，篩選和檢測(cè)，找到產(chǎn)生白藜蘆醇微生物，一種為G-桿菌，另一種為青霉素真菌；所述虎杖內(nèi)生真菌培養(yǎng)液的制備方法是取馬鈴薯200g，去皮煮沸30min，過濾，濾液用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得馬鈴薯培養(yǎng)液；所述虎杖內(nèi)生真菌的最佳培養(yǎng)條件為20g葡萄糖/L馬鈴薯培養(yǎng)液、2g硝酸銨/L馬鈴薯培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度為26℃，自然pH值和培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g氯化鈣/L馬鈴薯培養(yǎng)液，0.5g氯化鐵/L馬鈴薯培養(yǎng)液，80-100r/min振蕩速度。
所述虎杖內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液的制備方法是取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，混合，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液。
虎杖內(nèi)生細(xì)菌(革蘭氏陰性G-桿菌假單胞菌屬)在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件為20g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、2g硝酸銨/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為37℃，pH值7.2和培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g氯化鈣/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，0.5g氯化鎂/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，80r/min-100r/min振蕩速度。
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)白藜蘆醇的新資源，即從虎杖內(nèi)生菌中提取白藜蘆醇，可以克服白藜蘆醇僅從植物中提取的單一途徑，避免了受植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、地域和環(huán)境等因素的限制，掩蓋了提取率相對(duì)較低、產(chǎn)品質(zhì)量不高等不足，而虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)條件較寬松，白藜蘆醇的提取與檢測(cè)過程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，可大大降低成本，對(duì)環(huán)境污染小，提取溶劑以乙酸乙酯為主，可循環(huán)使用。


附圖為本發(fā)明流程圖1、制備馬鈴薯培養(yǎng)液或牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液；2、虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)；3、菌懸液處理；4、乙酸乙酯萃取；5、下相再次用乙酸乙酯萃??；6、收集兩次萃取液、濃縮、定容；6、HPLC檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1虎杖內(nèi)生真菌培養(yǎng)及提取白藜蘆醇的方法，具體步驟為(1)、取馬鈴薯200g，去皮煮沸30min，過濾，濾液用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得馬鈴薯培養(yǎng)液；(2)、產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生真菌在馬鈴薯培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20g葡萄糖/L馬鈴薯培養(yǎng)液、2g硝酸銨/L馬鈴薯培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度為26℃，自然pH值和培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g氯化鈣/L馬鈴薯培養(yǎng)液，0.5g氯化鐵/L馬鈴薯培養(yǎng)液、，80r/min-100r/min振蕩速度。
(3)、菌液取出后在100r/min下均質(zhì)15min以使其細(xì)胞壁破碎(可酌情加入石英砂，以增大其擊打面積)，再用超聲波處理30min；(4)、用乙酸乙酯萃取12h，乙酸乙酯∶處理液＝1∶1，靜置分層；(5)、下相第二次用乙酸乙酯萃取6h，乙酸乙酯∶下相液＝1∶0.5；(6)、收集兩次的萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至干；(7)、高效液相檢測(cè)用甲醇定容至1mL，柱系C-18反向硅膠柱(Dikma 250×4.6mm)恒速洗脫，流速1mL/min，流動(dòng)相43.2％乙腈，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)UV306nm，進(jìn)樣量10μL，保留時(shí)間為6.7min，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量。其虎杖內(nèi)生真菌的白藜蘆醇含量為51ug/100mL。
實(shí)施例2虎杖內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)及提取白藜蘆醇的方法，具體步驟為(1)、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，混合，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液；(2)、產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、2g硝酸銨/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度為35℃，pH值7.2和培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g氯化鈣/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液和0.5g氯化鎂/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，80r/min-100r/min振蕩速度。
(3)、菌液取出后在100r/min下均質(zhì)15min以使其細(xì)胞壁破碎(可酌情加入石英砂，以增大其擊打面積)，再用超聲波處理30min；(4)、用乙酸乙酯萃取12h，乙酸乙酯∶處理液＝1∶1，靜置分層；(5)、下相第二次用乙酸乙酯萃取6h，乙酸乙酯∶下相液＝1∶0.5；(6)、收集兩次的萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至干；(7)、高效液相檢測(cè)用甲醇定容至1mL，柱系C-18反向硅膠柱(Dikma 250×4.6mm)恒速洗脫，流速1mL/min，流動(dòng)相43.2％乙腈，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)UV306nm，進(jìn)樣量10μL，保留時(shí)間為6.7min，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量?；⒄葍?nèi)生細(xì)菌的白藜蘆醇含量為42ug/100mL。
權(quán)利要求
1.一種利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、用葡萄糖作為碳源、硝酸銨作為氮源，用產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)虎杖內(nèi)生真菌或虎杖內(nèi)生細(xì)菌。(2)、菌液取出后在在100r/min下均質(zhì)15min以使其細(xì)胞壁破碎，再用超聲波處理30min。(3)、用乙酸乙酯萃取12h，靜置分層。(4)、收集萃取液，將萃取液濃縮至干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所得下相應(yīng)第二次用乙酸乙酯萃取6h，乙酸乙酯∶下相液＝1∶0.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生菌的分離方法為A、對(duì)虎杖根狀莖進(jìn)行表面升汞殺菌，接種根狀莖組織塊于固體培養(yǎng)劑(MS)上，培養(yǎng)10-15天，并接種數(shù)次。B、對(duì)根狀莖產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其中愈傷組織仍有微生物生長(zhǎng)，對(duì)其中微生物進(jìn)行分離。C、對(duì)分離出的微生物進(jìn)行逐個(gè)分離，純化。D、對(duì)每個(gè)微生物分別進(jìn)行培養(yǎng)，并用乙酸乙酯提取培養(yǎng)液及破碎細(xì)胞中的白藜蘆醇。E、用薄板層析法對(duì)提取液進(jìn)行分離，并采用薄層掃描儀進(jìn)行檢測(cè)白藜蘆醇含量。F、經(jīng)過分離，篩選和檢測(cè)，找到產(chǎn)生白藜蘆醇微生物，一種為革蘭氏陰性G-桿菌，另一種為青霉屬真菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生真菌的培養(yǎng)條件為20g葡萄糖/L馬鈴薯培養(yǎng)液、2g硝酸銨/L馬鈴薯培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度為26-30℃，自然pH值和培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g/L氯化鈣和0.5g/L氯化鐵，80r/min-100r/min振蕩速度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，產(chǎn)白藜蘆醇的虎杖內(nèi)生細(xì)菌的最佳培養(yǎng)條件為20g/L葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、2g/L硝酸銨/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為30-37℃，pH值7.2，培養(yǎng)基裝量100mL/250mL，接種量為培養(yǎng)基裝量的1/10，0.5g氯化鈣/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液和0.5g氯化鎂/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，80r/min-100r/min振蕩速度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，所述虎杖內(nèi)生真菌培養(yǎng)液的制備方法是取馬鈴薯200g，去皮煮沸30min，過濾，濾液用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得馬鈴薯培養(yǎng)液；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，其特征在于，所述虎杖內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液的制備方法是取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，混合，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用虎杖產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌培養(yǎng)提取白藜蘆醇的方法，包括以下步驟(1)用馬鈴薯制備馬鈴薯培養(yǎng)液；(2)用葡萄糖作為碳源、硝酸銨作為氮源，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)虎杖內(nèi)生真菌或細(xì)菌；(3)菌液取出后在在100r/min下均質(zhì)15min以使其細(xì)胞壁破碎，再用超聲波處理30min；(4)用乙酸乙酯萃取12h，靜置分層；(5)收集萃取液，將萃取液濃縮至干。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)白藜蘆醇的新資源，可以克服白藜蘆醇僅從植物中提取的單一途徑，避免了受植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、地域和環(huán)境等因素的限制，掩蓋了提取率相對(duì)較低、產(chǎn)品質(zhì)量不高等不足，而虎杖內(nèi)生菌培養(yǎng)條件較寬松，白藜蘆醇的提取與檢測(cè)過程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，可大大降低成本，對(duì)環(huán)境污染小。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1824634SQ200510136668
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者曹庸 申請(qǐng)人:曹庸