專利名稱：轉(zhuǎn)化釀酒酵母和使用其大量生產(chǎn)lk8蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種LK8蛋白的制備方法，更具體地，一種用釀酒酵母來大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法，所述釀酒酵母用編碼具有血管發(fā)生抑制活性的LK8蛋白的基因轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是給器官或組織提供新血管的生物學(xué)過程。特別地，新的毛細(xì)血管從舊的微血管生成，生長(zhǎng)成為血管。血管發(fā)生，作為一種正常的生理過程，只在人體內(nèi)有限的情形中觀察到，例如在胎兒與胚胎發(fā)育期間、子宮成熟期間、胎盤增殖期間、黃體形成的過程中以及用于傷口愈合。即使對(duì)于這樣的情形，當(dāng)完成其工作時(shí)，血管發(fā)生也被精確地調(diào)控和終止。血管發(fā)生被一種血管發(fā)生調(diào)控因子嚴(yán)格地調(diào)控(Folkman，J.Nature Med.，127-31，1995)，血管發(fā)生的表型看來不同于血管發(fā)生刺激因子增量調(diào)節(jié)和血管發(fā)生抑制因子減量調(diào)節(jié)之間的平衡。
即使血管發(fā)生過程是很復(fù)雜和精細(xì)的，它也可以被描述如下。首先，血管發(fā)生的刺激被傳輸?shù)脚f血管，產(chǎn)生血管擴(kuò)張和膜通透性增加。其次，血纖蛋白從擴(kuò)張的血管中出來，然后在血管周圍的細(xì)胞溶質(zhì)中積累。第三，一種分解舊血管基底膜的酶被激活。第四，基底膜被破壞以致內(nèi)皮細(xì)胞從血管中出來并在周圍的細(xì)胞溶質(zhì)中增殖，然后再遷移。最后，那些內(nèi)皮細(xì)胞排列起來形成血管，產(chǎn)生新血管。
與血管發(fā)生有關(guān)的疾病例舉為包括關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的炎性疾病、包括糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)趦?nèi)的眼科疾病、包括牛皮癬在內(nèi)的皮膚病和癌癥這個(gè)在其他血管發(fā)生相關(guān)疾病中最有代表性的疾病(Folkman，J.，Nature Med.，127-31，1995)。特別地，血管發(fā)生對(duì)于原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的生長(zhǎng)是必需的(Folkman，J.，New Engl.J.Med.，2851182-1186，1971；Folkman，J.，J.Biol.Chem.，26710931-10934，1992)。那意味著當(dāng)血管發(fā)生被抑制或終止時(shí)，腫瘤不能生長(zhǎng)，表明血管發(fā)生的抑制作用也許對(duì)于腫瘤的長(zhǎng)期治療是一種有效的途徑。
因此，急需發(fā)展一種新的血管發(fā)生抑制劑來抑制或終止血管發(fā)生，進(jìn)而通過血管發(fā)生抑制劑有效地大量生產(chǎn)，以中等價(jià)格為使用者提供抑制劑。
血管發(fā)生抑制劑被認(rèn)為是最有利的癌癥治療方法之一，因?yàn)樗怨?yīng)營(yíng)養(yǎng)到腫瘤的血管為對(duì)象，取代了直接攻擊癌細(xì)胞，意味著它會(huì)降低耐藥性。各種抑制腫瘤血管發(fā)生的抑制劑，例如在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然抑制劑、合成抑制劑、整聯(lián)蛋白抑制劑、信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和蛋白水解抑制劑，已經(jīng)被證實(shí)是有效的并正在臨床試驗(yàn)中(Brower，V.，Nat.Biotechnol.，17963-8，1999；Carmeliet，P.和Jain，R.K.，Nature，407249-57，2000)。在國(guó)際專利公布WO 01/19868中宣稱，在臨床試驗(yàn)的那些抑制劑中，LK6、LK7和LK8作為人載脂蛋白Apo(a)的第36th、37th和38th的三環(huán)亞基，已經(jīng)知道其具有血管發(fā)生抑制活性，以及上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和遷移抑制活性。特別是，LK8蛋白表現(xiàn)出了最高的活性。為了對(duì)LK8蛋白的生產(chǎn)提供中等價(jià)格，以檢驗(yàn)該蛋白的效應(yīng)、用于臨床試驗(yàn)和商業(yè)使用，開發(fā)一種通過培養(yǎng)LK8基因轉(zhuǎn)化的重組菌株來實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法是必要的。
因而，本發(fā)明人研究了LK8蛋白的功能和該蛋白有效商業(yè)應(yīng)用的方法。最后，本發(fā)明人通過用含有LK8基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或?qū)K8基因插入到宿主染色體中來制備重組釀酒酵母，然后從中選擇了大量生產(chǎn)LK8蛋白的菌株。本發(fā)明人也確定了對(duì)菌株生長(zhǎng)最適的培養(yǎng)條件，并通過證實(shí)在所述的條件下高質(zhì)量的LK8蛋白能夠被大量生產(chǎn)，最終完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種能夠大量生產(chǎn)血管發(fā)生抑制劑LK8蛋白的轉(zhuǎn)化酵母菌株的制備方法，提供一種通過培養(yǎng)該菌株大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含有LK8表達(dá)盒的MδLK8重組表達(dá)載體，所述表達(dá)盒由啟動(dòng)子、分泌序列、SEQ ID No1表示的LK8cDNA和終止子依次組成。
本發(fā)明也提供了通過用所述重組載體轉(zhuǎn)染宿主菌株而制備的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了一種高表達(dá)LK8蛋白的轉(zhuǎn)化體的制備方法，包括如下步驟(1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌株；(2)用G418硫酸鹽抗生素處理后，培養(yǎng)第1步中制備的轉(zhuǎn)化體；(3)用免疫測(cè)定法篩選LK8高表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明也提供了一種LK8蛋白大量生產(chǎn)的方法，包括如下步驟(1)通過將重組LK8基因表達(dá)載體M LK8插入到宿主菌株中制備一株轉(zhuǎn)化菌株；(2)將第1步制備的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)和將該菌株在含有葡萄糖與半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)空氣供應(yīng)和攪拌速度保持溶氧穩(wěn)定；(3)第2步的培養(yǎng)液在含有半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)；和(4)從第3步得到的培養(yǎng)液中純化LK8蛋白。
在下文中，本發(fā)明被詳細(xì)描述。
本發(fā)明提供了一種含有LK8表達(dá)盒、δ序列和新霉素抗性基因的MδLK8重組表達(dá)載體，其中LK8表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子、分泌序列、由SEQ ID No1表示的LK8cDNA和終止子，δ序列是為了將LK8表達(dá)盒在宿主菌株的染色體上多重插入(multiple insertion)，新霉素抗性基因(neo)是為了多重插入后的選擇。在本發(fā)明的MδLK8重組表達(dá)載體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是GAL1啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的分泌序列是SEQ ID No2表示的α-因子分泌信號(hào)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的終止子是CYC1終止子。
特別地，在這里，含有α-因子分泌信號(hào)和LK8cDNA的DNA片段是通過用限制性內(nèi)切酶處理pMBRI-LK8表達(dá)載體(韓國(guó)專利公布No2004-0069840)，這個(gè)載體常用在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株中生產(chǎn)LK8蛋白(見圖1)。DNA片段被插入到p426GAL1載體中而構(gòu)建了表達(dá)載體pMCLK8(6.9kb)，可用于酵母菌株中重組LK8表達(dá)盒的生產(chǎn)(見圖2)。然后，構(gòu)建了重組體MδLK8的表達(dá)載體(見圖5)，用來將含有啟動(dòng)子、分泌序列、LK8cDNA序列和終止子的重組體LK8表達(dá)盒插入到酵母的染色體中，接下來是多重插入。
本發(fā)明也提供了一株用上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主菌株而得到的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該宿主菌株是選自由釀酒酵母BJ3501、釀酒酵母BY4742、釀酒酵母CEN.PK2-1D和釀酒酵母2805組成的組。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主菌株是釀酒酵母BJ3501。
在這里，一株宿主菌株釀酒酵母BJ3501被含有LK8基因的重組表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后，染色體中特異性地帶有若干LK8基因的轉(zhuǎn)化酵母菌株被選擇出來。用菌落免疫印跡、斑點(diǎn)印跡和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)方法將超量分泌LK8蛋白的菌株選擇出來，命名為釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36(見圖6和圖7)。這個(gè)菌株在2004年1月13日被保藏在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(#52，Aeun-dong yousung-ku，Daejeun city，Korea)(保藏編號(hào)KCTC 10582BP)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種高表達(dá)LK8蛋白的轉(zhuǎn)化體的制備方法，包括如下步驟(1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌株；(2)在G418硫酸鹽抗生素處理后，培養(yǎng)第1步中制備的轉(zhuǎn)化體；和(3)用免疫測(cè)定法選擇LK8高表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。在步驟2中，抗生素不只限于G418硫酸鹽，但在本發(fā)明中優(yōu)選5-20g/L的G418硫酸鹽處理該菌株。在步驟3中，選擇方法不只限于一種特定的免疫測(cè)定法，但優(yōu)選菌落免疫印跡、斑點(diǎn)印跡測(cè)定或ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)方法。還優(yōu)選另外實(shí)行上述步驟3，在初步選擇中更優(yōu)選進(jìn)行菌落免疫印跡，然后從初步選擇所得菌株中實(shí)行二次選擇時(shí)優(yōu)選斑點(diǎn)印跡，最后用ELISA法從二次選擇所得菌株中進(jìn)行最終選擇。
當(dāng)LK8在本發(fā)明方法制備的在其染色體中含有多拷貝LK8基因的轉(zhuǎn)化酵母菌株中表達(dá)時(shí)，與常規(guī)附加型表達(dá)方法相比，LK8蛋白的分泌量加倍或增至三倍，常規(guī)的附加型表達(dá)是外源基因以附加體的形式引入來表達(dá)和分泌外源基因。
本發(fā)明也提供了一種大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法，包括如下步驟(1)通過將重組LK8基因表達(dá)載體插入到宿主菌株中制備一株轉(zhuǎn)化菌株；(2)將第1步制備的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)和將該菌株在含有葡萄糖與半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)空氣供應(yīng)和攪拌速度保持溶氧穩(wěn)定；(3)將第2步的培養(yǎng)液在含有半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)；和(4)從第3步的培養(yǎng)液中純化LK8蛋白。
本發(fā)明的大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法在下文中將更加清晰地被逐步解釋。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的第1步是為了制備一株轉(zhuǎn)化菌株，是將重組LK8基因表達(dá)載體插入到宿主菌株中而產(chǎn)生的。更特別地是，含有LK8表達(dá)盒的重組載體被引入到宿主菌株中，以致LK8基因的表達(dá)或分泌在質(zhì)粒上被誘導(dǎo)。然后進(jìn)行LK8基因和分泌序列在菌株染色體上的多重插入。表現(xiàn)出最佳LK8表達(dá)/分泌能力的菌株被選擇出來，即轉(zhuǎn)化的釀酒酵母菌株。
在本發(fā)明方法的步驟2中，上述步驟1的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后在含有葡萄糖與半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)，在此過程中通過調(diào)節(jié)空氣供應(yīng)和/或攪拌速度來保持溶氧穩(wěn)定。這時(shí)，種子培養(yǎng)液優(yōu)選的接種體積是5-10％(w/v)。分批培養(yǎng)優(yōu)選在1-3vvm(5-801/minute)的通氣量和/或200-1000rpm的攪拌速度條件下進(jìn)行、液體培養(yǎng)基中含有1-5％(w/v)葡萄糖和1-5％(w/v)半乳糖作為碳源，溶氧調(diào)控在最大溶氧的40-90％。這時(shí)，液體培養(yǎng)基可以另外包含1-50g/l的酵母膏、1-10g/l的酪蛋白氨基酸、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的組氨酸。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)化酵母菌株被分裝到數(shù)百或數(shù)千個(gè)無菌的貯存瓶中。它在同樣的條件下被貯藏，這是為保存和控制菌株而建立的“工作細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)”，以使它們?cè)谏a(chǎn)重組蛋白的每一次種子培養(yǎng)中都作為同樣種子被使用。
在步驟2中，所述的種子培養(yǎng)進(jìn)行24小時(shí)以保證從工作細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)來的細(xì)胞達(dá)到所需的細(xì)胞量。本發(fā)明的分批培養(yǎng)是細(xì)胞生長(zhǎng)階段，其間細(xì)胞數(shù)目增加以及細(xì)胞變得適應(yīng)表達(dá)誘導(dǎo)劑半乳糖。在分批培養(yǎng)的后期，由于細(xì)胞旺盛的呼吸使溶氧下降。為了防止溶氧下降，空氣供應(yīng)和攪拌速度應(yīng)該被調(diào)節(jié)來保持溶氧在40％以上，直到分批培養(yǎng)結(jié)束。
本發(fā)明方法的第3步是第2步的培養(yǎng)液在含有半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。這時(shí)，溶氧必須保持在最大溶氧的20-80％，液體培養(yǎng)基優(yōu)選包含20-50％(w/v)的半乳糖作為碳源。還優(yōu)選調(diào)節(jié)半乳糖的供應(yīng)速度以保持半乳糖在培養(yǎng)基中的含量在0.5-5％(w/v)之間。液體培養(yǎng)基可以另外包含1-50g/l的酵母膏、1-30g/l的蛋白胨、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的組氨酸。
半乳糖的供應(yīng)是從補(bǔ)料分批培養(yǎng)開始進(jìn)行控制的，以便在培養(yǎng)基中保持規(guī)則的半乳糖含量。也就是說，通過必要時(shí)加入半乳糖使培養(yǎng)基中半乳糖含量保持在低于5％(w/v)，為此必須在整個(gè)培養(yǎng)過程中檢查溶氧，因此LK8蛋白的表達(dá)得到提高。通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)，每1升培養(yǎng)上清液中可以獲得幾百毫克的LK8蛋白(見圖8和圖9)。
本發(fā)明方法第4步是為了從上述第3步的培養(yǎng)液中純化LK8蛋白。LK8蛋白是分子量為9-10kD的親水分子。在中性pH條件下，它有特性上的低溶解度。在培養(yǎng)液里L(fēng)K8蛋白表達(dá)過程中，偶爾會(huì)產(chǎn)生分子量小于或大于LK8蛋白的衍生物。因而，為了從培養(yǎng)液中分離純的LK8蛋白，利用LK8蛋白物理化學(xué)特性的純化過程是需要的。
為了純化本發(fā)明中的LK8蛋白，任何常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法都可以無限制地加以使用，但是色譜法是優(yōu)選的。更優(yōu)選包括離子交換色譜和疏水作用色譜在內(nèi)的色譜法(見圖10-圖13)。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的離子交換色譜是陽離子交換色譜，LK8蛋白的洗脫優(yōu)選在含有0-5M NaCl的洗脫液中在pH4.0-8.0之間進(jìn)行。在使用疏水作用色譜的情況下，LK8蛋白的洗脫優(yōu)選在含有0.1-5M的硫酸銨和0-500mM NaCl的磷酸鈉洗脫溶液中在pH4-8之間進(jìn)行。
特別地，在本發(fā)明方法的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，LK8蛋白借助于陽離子交換色譜吸附在陽離子交換樹脂上，然后通過調(diào)節(jié)pH或鹽度除去雜質(zhì)。LK8蛋白的洗脫在適當(dāng)濃度下進(jìn)行。這時(shí)，pH水平和鹽濃度依賴于陽離子交換樹脂的類型。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了SP(磺丙基)強(qiáng)離子交換樹脂。在本領(lǐng)域人員中通常理解，當(dāng)強(qiáng)離子交換色譜被用到時(shí)，與弱離子交換色譜相比，由于它的更強(qiáng)的離子鍵，LK8蛋白的沖洗和洗脫是在高鹽濃度和高水平pH條件下進(jìn)行的。因而，本發(fā)明不僅限于使用SP(磺丙基)陽離子交換樹脂和緩沖液條件的實(shí)施方案，提示本發(fā)明可以包括在除去附著于LK8的雜質(zhì)后，使用常規(guī)的陽離子交換樹脂來濃縮LK8的任何純化方法。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用所述的陽離子交換色譜純化得到的樣品進(jìn)一步用疏水作用色譜純化。精確地講，樣品中親水的LK8蛋白在高鹽濃度下附著于疏水樹脂，然后通過降低鹽濃度除去雜質(zhì)，隨后是在適當(dāng)?shù)柠}濃度下LK8的洗脫。在比適當(dāng)洗脫鹽濃度低的鹽濃度下，高疏水雜質(zhì)被除去。通常，疏水作用色譜用來純化疏水蛋白。此時(shí)，不能被陽離子交換樹脂除去的殘留雜質(zhì)必須利用其疏水特性來除去，由此純化的LK8蛋白能夠被大量生產(chǎn)。然而，本發(fā)明范圍不局限于上述的疏水作用樹脂和緩沖條件。本發(fā)明包括使用常規(guī)的疏水作用樹脂除去LK8的雜質(zhì)可能的純化方法。


圖1是瓊脂糖凝膠電泳照片，表示GAL1啟動(dòng)子的DNA片段(6.4kbp)和含有SEQ ID No2表示的MATα(α-因子分泌信號(hào))與SEQ ID No1表示的LK8cDNA的DNA片段(500bp)，上述片段是用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamH I處理pMBRI-LK8表達(dá)載體而制備的。
圖2是pMCLK8(6.9kb)表達(dá)載體酶切圖的示意圖，表示pMCLK8是通過在p426GAL1載體的GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子之間插入一個(gè)含有SEQ ID No2表示的α-因子分泌信號(hào)(MATα)和SEQ ID No1表示的LK8cDNA的DNA片段而構(gòu)建的，用于酵母中重組LK8蛋白的生產(chǎn)。
圖3是表示考察LK8分泌和殘?zhí)堑囊合嗌V結(jié)果的一組曲線圖。為了挑選一個(gè)用于重組LK8蛋白生產(chǎn)的最佳宿主，釀酒酵母BJ3501，BY4742，CEN.PK2-1D和2805被LK8表達(dá)載體pMCLK8(6.9kb)轉(zhuǎn)染。得到的轉(zhuǎn)化酵母菌株被培養(yǎng)來附加地表達(dá)LK8蛋白。
圖4是電泳照片，表示了在30和40小時(shí)培養(yǎng)后在每一個(gè)菌株中產(chǎn)生的LK8蛋白量免疫雜交檢測(cè)的結(jié)果。
圖5是表示重組載體MδLK8酶切圖的示意圖，MδLK8是為了將含有GAL1啟動(dòng)子、SEQ ID No2表示的α-因子分泌信號(hào)、SEQ ID No1表示的LK8cDNA和CYC1終止子的表達(dá)盒插入到酵母的染色體中而構(gòu)建的。
圖6是表示菌株初篩的一組照片。精確地講，為了從染色體上含有LK8表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化酵母菌株中選擇一個(gè)帶有強(qiáng)G418硫酸鹽抗性的菌株，進(jìn)行了菌落印跡。膠片上的陰影被觀察到A用5g/l的G418硫酸鹽處理，B用10g/l的G418硫酸鹽處理，和C用15g/l的G418硫酸鹽處理。
圖7是表示一個(gè)菌株的第二輪篩選的照片。通過使用斑點(diǎn)印跡試劑盒，從初篩挑選到的菌株被固定在硝化纖維膜上。然后通過使用檢測(cè)試劑盒，膠片中的陰影被觀察到。
圖8是曲線圖，表示了在轉(zhuǎn)化酵母菌株釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36的發(fā)酵過程中隨時(shí)間變化的細(xì)胞生長(zhǎng)(●)、補(bǔ)加的半乳糖累積量()和殘余半乳糖(■)。
圖9是轉(zhuǎn)化酵母菌株釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36發(fā)酵過程中培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE照片泳道1梯狀標(biāo)記，泳道2培養(yǎng)開始38小時(shí)后，泳道3培養(yǎng)開始86小時(shí)后，泳道4培養(yǎng)開始110小時(shí)后，泳道5培養(yǎng)開始134小時(shí)后，泳道6培養(yǎng)開始158小時(shí)后，泳道7培養(yǎng)開始184小時(shí)后，泳道8培養(yǎng)開始211小時(shí)后，泳道9對(duì)照LK8蛋白(200mg/l)，泳道10對(duì)照LK8蛋白(100mg/l)，圖10是電泳照片。為了比較兩種方法(LK8基因的質(zhì)粒表達(dá)和插入染色體后的表達(dá))的LK8蛋白表達(dá)和分泌效果，轉(zhuǎn)化的酵母菌株釀酒酵母BJ3501/pMCLK8和釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36被分批培養(yǎng)。分泌的LK8蛋白隨時(shí)間的變化通過免疫印跡被定量泳道1LK8標(biāo)準(zhǔn)，10mg/L，泳道2LK8標(biāo)準(zhǔn)，50mg/L，泳道3釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始20小時(shí)后，泳道4釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始30小時(shí)后，泳道5釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始40小時(shí)后，泳道6釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始20小時(shí)后，泳道7釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始30小時(shí)后，泳道8釀酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培養(yǎng)開始40小時(shí)后，泳道9釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培養(yǎng)開始20小時(shí)后，泳道10釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培養(yǎng)開始30小時(shí)后，泳道11釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培養(yǎng)開始40小時(shí)后。
圖11是表示用陽離子交換色譜進(jìn)行LK8蛋白純化步驟的色譜圖。
沖洗0.1-1M磷酸鈉溶液，洗脫0.1-1M磷酸鈉，0-2M氯化鈉溶液，清洗0-2M氯化鈉溶液。
圖12是SDS-PAGE照片，表示SP-Sepharose陽離子交換色譜的每一個(gè)洗脫級(jí)分中的LK8蛋白。
泳道1梯狀標(biāo)記，泳道2最終培養(yǎng)液的上清，泳道3最終培養(yǎng)液上清稀釋5倍后的樣品，泳道4未結(jié)合樹脂的稀釋樣品，泳道5用于沖洗樹脂的樣品，泳道6洗脫組分#1，泳道7洗脫組分#2，泳道8洗脫組分#3，泳道9洗脫組分#4，和泳道10用氫氧化鈉洗脫的樣品。
圖13是色譜圖，表示在LK8蛋白的整個(gè)分泌和純化過程中間，用疏水作用色譜進(jìn)行特異的LK8蛋白純化。
沖洗0.1-1M磷酸鈉溶液，洗脫0.1-3M硫酸銨，0.1-1M磷酸鈉，氯化鈉溶液，和清洗氯化鈉溶液。
圖14是聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片，表示了SP-苯基瓊脂糖(phenylsepharose)6FF(fast flow)疏水作用色譜的每一個(gè)級(jí)分中LK8蛋白含量。
泳道1標(biāo)記，泳道2從SP-sepharose陽離子交換樹脂上洗脫的樣品，泳道3未吸附樹脂的樣品，泳道4洗脫級(jí)分#1，泳道5洗脫級(jí)分#2，泳道6洗脫級(jí)分#3，泳道7用磷酸鈉洗脫的樣品，泳道8用蒸餾水洗脫的樣品，和泳道9梯狀標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)用的和目前優(yōu)選的實(shí)施方案在如下的實(shí)施例中說明。
然而，應(yīng)當(dāng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員，考慮到本公開內(nèi)容，可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。
<實(shí)施例1>重組LK8表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建了一種在酵母中基因表達(dá)的載體，其中含有LK8cDNA基因，它是由人載脂蛋白[apolipoprotein(a)]三環(huán)區(qū)域的V38氨基酸序列組成的。
特別地，為了一起分離α-因子分泌信號(hào)和LK8cDNA，本發(fā)明人使用了pMBRI-LK8表達(dá)載體(韓國(guó)專利公布No.2004-0069840)，它已經(jīng)用于巴斯德畢赤酵母中的重組LK8蛋白生產(chǎn)。用到了購(gòu)自Invitrogen(荷蘭)的pPIC9載體(8.0kb)，它作為一個(gè)構(gòu)建pMBRI-LK8表達(dá)載體的空載體。精確地講，pPIC9表達(dá)載體的AOX1啟動(dòng)子通過甲醇來誘導(dǎo)LK8基因的表達(dá)，在LK8蛋白分泌出細(xì)胞的過程中起作用，通過將目的基因LK8cDNA結(jié)合到α-因子分泌信號(hào)后的區(qū)域進(jìn)行表達(dá)。為此目的，以pET15b/LK8(國(guó)際專利公開No.WO 01/19868)為模板用PCR擴(kuò)增LK8基因。然后，擴(kuò)增的基因用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I消化。進(jìn)行亞克隆將基因片段插入到pPIC9載體中，結(jié)果構(gòu)建成pMBRI-LK8(8.25kb)。
pMBRI-LK8表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶EcoR I處理7小時(shí)，接下來用PCR純化試劑盒(Qiagen，美國(guó))沖洗。載體用限制性內(nèi)切酶BamH I處理7小時(shí)。DNA用電泳分離，含有SEQ ID No2表示的α-因子分泌信號(hào)和SEQ ID No1表示的LK8cDNA核苷酸序列的DNA片段用凝膠提取試劑盒(QIAGEN)獲得(圖1)。得到的DNA片段被插入到p426GAL1載體(ATCC 87833，美國(guó))的GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子之間，以構(gòu)建用于酵母中重組LK8生產(chǎn)的pMCLK8表達(dá)載體(6.9kb)。因?yàn)楸磉_(dá)載體中含有GAL1啟動(dòng)子，蛋白的表達(dá)是被半乳糖誘導(dǎo)的。URA3標(biāo)記用來在選擇培養(yǎng)基中挑選轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
<實(shí)施例2>表達(dá)LK8蛋白的宿主菌株選擇為了選擇用于LK8蛋白表達(dá)的最佳宿主菌株，在多種釀酒酵母中，選擇了BJ3501(ATCC 208280，美國(guó))，BY4742(EUROSCARF Y10000，德國(guó))，CEN.PK2-1D(EUROSCARF 30000B，德國(guó))和2805(Sohn，J.H.，J.Microbiol.Biotechnol.，1266-273，1991)用于實(shí)驗(yàn)。
特別地，利用堿性陽離子酵母試劑盒(Q-Biogene，加拿大)，上述每一個(gè)菌株都被上述實(shí)施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。為了確定轉(zhuǎn)化是否成功完成，菌株在無脲嘧啶的酵母氮基培養(yǎng)基
中培養(yǎng)。為了重組LK8的生產(chǎn)，每一株菌株在生物反應(yīng)器(Biostat Q，B.Braun Biotech International，德國(guó))中用YPDG培養(yǎng)基(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的葡萄糖，3％的半乳糖)培養(yǎng)(30℃，pH5.5，700rpm)。在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基每4小時(shí)回收，含有LK8蛋白的上清液通過離心(15,000rpm，5分鐘)收集。培養(yǎng)液上清中的殘?zhí)菨舛扔靡合嗌V進(jìn)行研究(圖3)，用免疫印跡法定量分析分泌的重組LK8蛋白(圖4)。
結(jié)果，LK8蛋白在每個(gè)轉(zhuǎn)化菌株中分泌，表明pMCLK8表達(dá)載體成功地被引入。特別地，釀酒酵母BJ3501被證明是最佳的宿主，表現(xiàn)出了最高的每個(gè)細(xì)胞LK8蛋白分泌量。
<實(shí)施例3>LK8基因整合盒的構(gòu)建和它在酵母染色體中的多重插入構(gòu)建了用于LK8表達(dá)盒插入酵母染色體的重組載體，所述表達(dá)盒由GAL1啟動(dòng)子、α-因子分泌信號(hào)、LK8cDNA的核苷酸序列和CYC1終止子組成。得到了一株被上述載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化菌株。
特別地，能夠插入目的基因到δ序列(一種酵母染色體的過渡元件)中的pδneo載體(Lee，F(xiàn)WF.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，48339，1997)被用作母載體。pδneo載體包括用于以同源重組進(jìn)行多重插入的δ序列和用于插入載體選擇的新霉素抗性基因(neo)。LK8表達(dá)盒和pδneo載體帶有Sal I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。重組載體中的Sal I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于載體在酵母染色體中的插入是必需的。因而，LK8表達(dá)盒中的Sal I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)用DNA平端試劑盒(Takara，日本)除去。與此同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I切去上述實(shí)施例1中構(gòu)建的pMCLK8載體的GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子的兩端，將LK8表達(dá)盒分離出來。由于pδneo載體不具有Kpn I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，pδneo載體的Xba I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)和分離出的LK8表達(dá)盒的Kpn I限制性酶識(shí)別位點(diǎn)都被制成平末端。然后，通過將LK8表達(dá)盒插入到以上構(gòu)建的重組pδneo載體中，而構(gòu)建了重組載體，命名為MδLK8(圖5)。
通過用Sal I限制性內(nèi)切酶處理，MδLK8被線性化。然后，用堿性陽離子酵母試劑盒(Q-Biogene，加拿大)將線性化的MδLK8轉(zhuǎn)染一株酵母菌。為了使LK8表達(dá)盒能夠大量地插入到酵母染色體中，線性化的MδLK8被濃縮到3μg/μl。
本發(fā)明中以線性化MδLK8重組整合盒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化酵母利用含有G418硫酸鹽的YPD平板(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的葡萄糖，2％的瓊脂)進(jìn)行篩選。這時(shí)，G418硫酸鹽的濃度分別調(diào)整到5g/l，10g/l和15g/l，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株。
結(jié)果，當(dāng)LK8表達(dá)盒被大量插入酵母菌染色體中時(shí)，酵母甚至能夠在高濃度G418硫酸鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，LK8的活力也高(圖6)。因此，由于LK8基因大量插入酵母染色體中，得到了數(shù)萬個(gè)具有G418硫酸鹽(甚至超過15g/l的濃度)抗性的轉(zhuǎn)化酵母菌落。
<實(shí)施例4>用菌落免疫印跡法初篩LK8蛋白高產(chǎn)菌株在上述實(shí)施例3選擇得到的那些轉(zhuǎn)化酵母菌株中，用菌落免疫印跡法初篩超量分泌LK8蛋白的菌株。
特別地，將轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，接下來在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后，觀察到菌落的形成。無菌的纖維素膜被放在菌落上，然后小心地將其取下。與此同時(shí)，將硝化纖維膜放在YPD固體培養(yǎng)基上，把上述纖維素膜小心地放在硝化纖維膜上，不要產(chǎn)生氣泡，使菌落附著在硝化纖維膜的上表面。然后，含有菌落的固體培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)48小時(shí)。將纖維素膜小心地取下，放在一個(gè)新的YPD固體培養(yǎng)基上。取下殘留的硝化纖維膜用作印跡。
將硝化纖維膜放在添加了PBS緩沖液的溶液中，其中含有0.1％(v/v)的吐溫20和5％(w/v)的脫脂奶粉，在室溫下輕輕攪拌2小時(shí)。兔LK8抗體加入到同一溶液中，也在室溫下輕輕攪拌1小時(shí)，接下來用含有0.1％吐溫20的PBS緩沖液沖洗五次。將抗兔IgG-HRP(Sigma，美國(guó))置于含有0.1％吐溫20和5％脫脂奶粉的PBS緩沖溶液中，上述處理的硝化纖維膜被浸入其中，接下來在室溫下輕輕攪拌1小時(shí)。用含有0.1％吐溫20的PBS緩沖溶液沖洗五次。然后，硝化纖維膜被取出并轉(zhuǎn)移到檢測(cè)試劑盒(SuperSignal West Pico kit，Pierce，美國(guó))提供的檢測(cè)溶液(Pierce，美國(guó))中，固定在放射膠片上?？疾炷z片上的陰影。
結(jié)果，陰影隨表達(dá)的LK8的量而不同(圖6)，特別地，那些顯示更深陰影的菌株被初步選擇出來。
<實(shí)施例5>用斑點(diǎn)印跡進(jìn)行LK8蛋白高產(chǎn)菌株的第二輪篩選在上述實(shí)施例4第一輪菌落篩選所得菌株中，分泌更多LK8蛋白的菌株用斑點(diǎn)印跡進(jìn)行二次選擇。
特別地，在實(shí)施例4初步選擇得到的菌株被接種到含有YPG(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的半乳糖)液體培養(yǎng)基的試管中，接下來在30℃用180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，培養(yǎng)液在5,000rpm離心5分鐘，只收獲上清。上清液用PBS稀釋10倍，利用斑點(diǎn)印跡試劑盒(Bio-Rad，美國(guó))將其附著于硝化纖維膜上。硝化纖維膜在0.5％(v/v)的戊二醛溶液中放5-10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到50mM的甘氨酸溶液中，接下來用PBS緩沖液沖洗。然后，取出硝化纖維膜轉(zhuǎn)移到固定在放射性膠片上的檢測(cè)溶液中。通過檢測(cè)試劑盒研究膠片上的陰影，和上述實(shí)施例4中描述的步驟類似。
結(jié)果，陰影隨表達(dá)的LK8的量而不同(圖7)，特別地，那些顯示更深陰影的菌株被二次選擇出來。
<實(shí)施例6>用ELISA法進(jìn)行LK8蛋白高產(chǎn)菌株的第三輪篩選在上述實(shí)施例5第二輪菌落篩選所得菌株中，大量分泌LK8蛋白的菌株用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法最終挑選。
特別地，二次選擇得到的菌株被接種到含有YPD液體培養(yǎng)基的試管中，接下來在30℃用180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)液接種到含有50ml YPG液體培養(yǎng)基的搖瓶中。然后，用YPG液體培養(yǎng)基調(diào)整OD，搖瓶中的終體積設(shè)定到50ml。在30℃下用180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)液進(jìn)行離心，只收獲上清。
兔抗LK8抗體以0.25μg/孔的量置于免疫組件(MaxisorpTMImmunomodule，Nunc，美國(guó))上，接下來用包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.6)進(jìn)行包被用于ELISA。包被的免疫組件用含有1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％吐溫20的PBS緩沖溶液處理，然后在室溫下放置2小時(shí)。上清液用含有0.1％吐溫20的PBS緩沖液稀釋1000倍，放在免疫組件中在37℃進(jìn)一步反應(yīng)1小時(shí)。然后，免疫組件用含有1％BSA和0.1％吐溫20的PBS緩沖溶液沖洗。
另一方面，大鼠抗LK8抗體用含有1％BSA和0.1％吐溫20的PBS緩沖溶液稀釋。溶液置于免疫組件中，接下來在37℃反應(yīng)1小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，免疫組件用含有1％BSA和0.1％吐溫20的PBS緩沖溶液沖洗。
為上述反應(yīng)過程，每一個(gè)免疫組件用TMB染色試劑(TMB過氧化物酶底物，KPL，美國(guó))染色15分鐘，然后用1M的磷酸鹽溶液終止染色反應(yīng)。測(cè)定OD405來定量LK8蛋白的表達(dá)。
表1用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量LK8的表達(dá)

用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量LK8的表達(dá)(表1)。總之，表現(xiàn)了最佳LK8表達(dá)的菌株是B36，命名為釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36’。這個(gè)菌株于2004年1月13日被保藏在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(#52，Aeun-dong yousung-ku，Daejeun city，Korea)(保藏編號(hào)KCTC10582BP)。
用DNA印跡雜交來研究菌株的重組LK8cDNA的拷貝數(shù)。結(jié)果，確定約有8個(gè)拷貝的LK8基因被成功地插入。
<實(shí)施例7>釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36的種子培養(yǎng)、分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)<7-1>種子培養(yǎng)在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36菌株被分裝在數(shù)百或數(shù)千個(gè)無菌貯存瓶中，在同樣的條件下保管，這就是本發(fā)明人為保存菌株而建立的“工作細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)”，以使菌株適合在生產(chǎn)重組蛋白的種子培養(yǎng)時(shí)作為一個(gè)種子被使用。作為種子，轉(zhuǎn)化菌株在YPD培養(yǎng)基(1％的酵母膏，2％的蛋白胨，2％葡萄糖)中培養(yǎng)24小時(shí)來保證所要的細(xì)胞量[和活力(在稀釋20倍的情況下，OD600＝0.8-1.2)]。
<7-2>分批培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)。然后，在接種了上述實(shí)施例7-1的種子培養(yǎng)液的初始培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)。在這個(gè)階段，種子培養(yǎng)液接種量在1％以上，葡萄糖和半乳糖用作碳源以提高細(xì)胞數(shù)目并讓它們適應(yīng)半乳糖。初始培養(yǎng)基由1-5％(w/v)的葡萄糖、1-5％(w/v)的半乳糖，1-50g/l的酵母膏、1-10g/l的酪蛋白氨基酸、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的組氨酸組成。
依照培養(yǎng)基的組成，通氣量調(diào)節(jié)到1-3vvm，攪拌速度控制在200-1000rpm。結(jié)果，在整個(gè)分批培養(yǎng)階段溶氧保持在40％以上。
在這個(gè)階段，細(xì)胞濃度達(dá)到了O.D.(600nm)為30以上。
<7-3>補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是通過加入用作誘導(dǎo)劑和唯一碳源的半乳糖來提高細(xì)胞量和LK8蛋白分泌水平的階段。
特別地，補(bǔ)料培養(yǎng)基含有20-50％(w/v)的半乳糖、1-50g/l的酵母膏、1-30g/l的蛋白胨、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的組氨酸，用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)。這時(shí)，為了誘導(dǎo)LK8蛋白的超量分泌，以1ml/hr-30ml/hr的速度補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中半乳糖的含量在5％(w/v)以下。
為了在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中保持半乳糖濃度不變，定期測(cè)定它在培養(yǎng)液中的含量，然后在整個(gè)發(fā)酵過程中控制半乳糖的補(bǔ)加速度，使得LK8表達(dá)和分泌的增加(圖8)。從補(bǔ)料分批培養(yǎng)看，培養(yǎng)液上清的LK8蛋白分泌了有每升幾百毫克之多(圖9)。
<實(shí)施例8>LK8的附加體表達(dá)和LK8染色體表達(dá)的比較為了比較LK8蛋白在附加體表達(dá)和LK8染色體表達(dá)的分泌效能，在實(shí)施例2中表現(xiàn)出最高LK8表達(dá)效能的釀酒酵母BI3501/pMCLK8和在實(shí)施例6中制備的釀酒酵母BI3501/MδLK8#36用實(shí)施例7-2中的分批培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，然后測(cè)定它們中最大的LK8分泌量(圖10)。結(jié)果，如圖9所示，在分批培養(yǎng)30小時(shí)后，被染色體表達(dá)(釀酒酵母BI3501/MδLK8#36)所誘導(dǎo)的LK8分泌量是附加體表達(dá)(釀酒酵母BI3501/pMCLK8)所誘導(dǎo)的兩倍。
<實(shí)施例9>用色譜法進(jìn)行LK8蛋白的純化LK8蛋白是分子量為9-10kDa的親水分子，其特征在于在中性pH條件下或有機(jī)溶劑中的低溶解度。在LK蛋白的表達(dá)過程中，培養(yǎng)液中觀察到了其他比LK8蛋白更高或更低分子量的衍生物。那些衍生物似乎是從LK8蛋白的C-末端或N-末端切下的氨基酸或化學(xué)衍生物?；贚K8蛋白這樣的物理化學(xué)特性和培養(yǎng)條件，為了生產(chǎn)高純度的LK8蛋白，在本發(fā)明中建立了利用陽離子交換色譜和疏水作用色譜的純化方法。精確地講，通過陽離子交換色譜調(diào)節(jié)pH和鹽濃度以除去雜質(zhì)，接下來是LK8蛋白的洗脫。然后，進(jìn)行疏水作用色譜使高親水的LK8蛋白在高鹽濃度條件下附著在固定的樹脂上。通過降低鹽濃度將雜質(zhì)除去。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下進(jìn)行LK8蛋白的洗脫，然后疏水雜質(zhì)(疏水蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或包括內(nèi)毒素在內(nèi)的非蛋白污染物)通過降低鹽濃度被除去。本發(fā)明的純化方法在下文中更加精確地逐步加以解釋。
<9-1>陽離子交換色譜純化實(shí)施例7中獲得的培養(yǎng)液在8,000rpm離心獲得上清液。上清液用0.1-1M磷酸鈉(一堿價(jià)的)溶液稀釋4倍，pH調(diào)節(jié)到4以下。溶液用0.45μm的濾膜過濾。用SP-sepharose FF(fast flow)樹脂填充柱子，接下來用0.1-1M磷酸鈉溶液(一堿價(jià)的)平衡。然后，稀釋的上清液被加載到SP-sepharose柱上。0.1-1M的磷酸鈉溶液流過柱子到基線走直。用0.1-1M的磷酸鈉溶液(pH5-7)沖洗柱子以除去雜質(zhì)。然后，用含有0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)溢流進(jìn)行LK8蛋白的洗脫。
從色譜圖(圖11)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖12)確定，大部分雜質(zhì)被0.1-1M的磷酸鈉溶液沖洗而除去，只有LK8蛋白被含有0-2MNaCl的磷酸鈉溶液從級(jí)分中洗脫出來。
<9-2>疏水作用色譜純化用SP-sepharose 6FF(fast flow)樹脂填充柱子，接下來用含有0.1-3M硫酸銨和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)平衡柱子。實(shí)施例9-1中洗脫的樣品用硫酸銨溶解(終濃度0.1-3M)。然后，溶液被加載到SP-sepharose柱上。含有0.1-3M硫酸銨和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)流過柱子到基線走直。柱子用含有0.1-3M硫酸銨和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)沖洗。然后，用含有0.1-2M硫酸銨和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)溢流進(jìn)行LK8蛋白的洗脫。用濾膜(10,000D，Sigma，美國(guó))以0.1-1M的磷酸鈉溶液對(duì)洗脫的LK8蛋白進(jìn)行透析。
從色譜圖(圖1)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖13)確定，大部分雜質(zhì)被含有0-2M NaCl的0.1-1M磷酸鈉溶液(pH5-9)沖洗除去，只有LK8蛋白用硫酸銨和NaCl溶液從級(jí)分中洗脫出來。
表2


上文說明了，通過陽離子交換色譜從實(shí)施例7制備的培養(yǎng)液中純化LK8蛋白的回收率是80.1％，疏水作用色譜的回收率是66％(表2)。
工業(yè)適用性在上文中說明了，通過在釀酒酵母菌株中插入LK8基因表達(dá)的染色體整合盒而制備了轉(zhuǎn)化菌株。通過為上述菌株的分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)提供優(yōu)化的培養(yǎng)條件，LK8基因能夠在大規(guī)模發(fā)酵罐中有效地表達(dá)和分泌。利用本發(fā)明中有效的純化方法，可以實(shí)現(xiàn)LK8蛋白的大量生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的LK8蛋白的轉(zhuǎn)化菌株和生產(chǎn)方法有望對(duì)LK8蛋白這一新型血管發(fā)生抑制劑的商業(yè)化做出巨大的貢獻(xiàn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明同樣的目的，前面說明書中公開的概念和特定實(shí)施方案可能容易地被用作修改或設(shè)計(jì)其他實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，這樣等價(jià)的實(shí)施方案沒有背離如后附權(quán)利要求所闡明的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
序列表SEQ ID No1是編碼LK8蛋白的cDNA序列。
SEQ ID No2是編碼釀酒酵母α-因子分泌信號(hào)的DNA序列。
序列表<110>財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所<120>轉(zhuǎn)化釀酒酵母和使用其大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法<130>4fpo-11-16<150>KR10-2004-0005033<151>2004-01-27<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>258<212>DNA<213>人類<220>
<221>基因<222>(1)..(258)<223>LK8cDNA<400>1gaacaggact gcatgtttgg gaatgggaaa ggataccggg gcaagaaggc aaccactgtt60actgggacgc catgccagga atgggctgcc caggagcccc atagacacag cacgttcatt120ccagggacaa ataaatgggc aggtctggaa aaaaattact gccgtaaccc tgatggtgac180atcaatggtc cctggtgcta cacaatgaat ccaagaaaac tttttgacta ctgtgatatc240cctctctgtg catcctct 258<210>2<211>255<212>DNA<213>釀酒酵母
<220>
<221>信號(hào)肽<222>(1)..(255)<223>α-因子分泌信號(hào)<400>2atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaaga 25權(quán)利要求
1.一種MδLK8重組表達(dá)載體，其包括依次含有啟動(dòng)子、分泌序列、SEQ ID No1表示的LK8 cDNA和終止子的LK8表達(dá)盒，用于將LK8表達(dá)盒多重插入到宿主菌株染色體中的6序列，和在多重插入后用于選擇的新霉素抗性基因(neo)。
2.權(quán)利要求1所述的MδLK8重組表達(dá)載體，其中，所述啟動(dòng)子是GAL1啟動(dòng)子，分泌序列是SEQ ID No2表示的α-因子分泌信號(hào)，終止子是CYC1終止子。
3.通過用權(quán)利要求1所述載體轉(zhuǎn)染宿主菌株而制備的一種轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
4.權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株，其中所述宿主菌株選自由釀酒酵母BJ3501、釀酒酵母BY4742、釀酒酵母CEN.PK2-1D和釀酒酵母2805組成的組。
5.權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株，其中所述菌株是釀酒酵母BJ3501/MδLK8#36(保藏編號(hào)KCTC 10582BP)。
6.一種制備高表達(dá)LK8蛋白的轉(zhuǎn)化體的方法，該方法包括如下步驟(1)用權(quán)利要求1所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌株；(2)用G418硫酸鹽抗生素處理后，培養(yǎng)步驟1中制備的轉(zhuǎn)化體；和(3)用免疫測(cè)定法選擇LK8高表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述G418的處理濃度為5-20g/L。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述免疫測(cè)定法選自由菌落免疫印跡測(cè)定、斑點(diǎn)印跡測(cè)定和ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)組成的組。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的步驟3重復(fù)一到三次。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的步驟3由如下步驟組成1)用菌落免疫印跡進(jìn)行初步選擇；2)用斑點(diǎn)印跡從初步選擇所得菌株中進(jìn)行二次選擇；和3)用ELISA法從二次選擇所得菌株中進(jìn)行最后選擇。
11.一種大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法，該方法包括如下步驟(1)通過在宿主菌株中插入權(quán)利要求1所述的重組LK8基因表達(dá)載體，制備一種轉(zhuǎn)化菌株；(2)將第1步制備的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)和將所述菌株在含有葡萄糖與半乳糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)空氣供應(yīng)和/或攪拌速度來保持溶氧穩(wěn)定；(3)用含有半乳糖的補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)步驟2的培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)；和(4)從步驟3的培養(yǎng)液中純化LK8蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的步驟1的轉(zhuǎn)化菌株是權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中第2步所述的分批培養(yǎng)是在1-3vvm(5-80l/分鐘)的通氣量和/或200-1000rpm的攪拌速度的條件下在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的，所述液體培養(yǎng)基中含有1-5％(w/v)的葡萄糖和1-5％(w/v)的半乳糖作為碳源，其中將溶氧調(diào)節(jié)在最大溶氧的40-90％。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中第3步所述的補(bǔ)料分批培養(yǎng)是用含有10-50％(w/v)半乳糖為碳源的液體培養(yǎng)基完成的，其中調(diào)整補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料速度以保持所述培養(yǎng)基中半乳糖的含量為0.5-5％(w/v)。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中第4步所述的LK8蛋白的純化是通過色譜法完成的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的色譜法包括離子交換色譜和疏水作用色譜。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的交換色譜是陽離子交換色譜，LK8蛋白的洗脫是用含有0-5M NaCl的洗脫緩沖液(pH 4.0-8.0)完成的。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的疏水作用色譜是用含有0.1-5M硫酸銨和0-500mM NaCl的0-100mM磷酸鈉洗脫緩沖液(pH4-8)洗脫LK8蛋白而完成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備LK8蛋白的方法，更精確地講，一種利用釀酒酵母而大量生產(chǎn)LK8蛋白的方法，所述釀酒酵母被編碼具有血管發(fā)生抑制活性的LK8蛋白的基因轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化菌株和LK8蛋白的生產(chǎn)方法有望對(duì)LK8蛋白這一新的血管發(fā)生抑制劑的商業(yè)化做出巨大貢獻(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1914317SQ200580003281
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月27日
發(fā)明者林瀅權(quán), 樸政奐, 金圣根 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所