專利名稱:二肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì);具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的制備方法;使用具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的二肽制備方法;產(chǎn)生具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)、二肽合成用蛋白質(zhì)的微生物或轉(zhuǎn)化體;以及使用該微生物或轉(zhuǎn)化體的二肽制備方法。
背景技術(shù):
作為大量合成二肽的方法,已知有化學(xué)合成法(液相法、固相法),酶合成法以及使用DNA重組法的生物合成法。目前,對于50個殘基以上的長鏈肽,使用酶合成法或生物合成法,對于二肽,主要使用化學(xué)合成法和酶合成法。
由化學(xué)合成法進(jìn)行二肽的合成中,官能團(tuán)的保護(hù)·脫保護(hù)等操作是必需的,而且由于也會合成外消旋體,因此化學(xué)合成法不能說是一種經(jīng)濟(jì)而有效率的方法。此外,由于化學(xué)合成法使用大量的有機(jī)溶劑等,因此在環(huán)境衛(wèi)生上也不是一種優(yōu)選的方法。
關(guān)于由酶法進(jìn)行二肽的合成,已知的有利用蛋白分解酶(protease)的逆反應(yīng)的方法(J.Biol.Chem.,119,707-720(1937))、利用耐熱性氨酰基t-RNA合成酶的方法(特開昭58-146539號公報、特開昭58-209991號公報、特開昭58-209992號公報、特開昭59-106298號公報),利用非脂質(zhì)體肽合成酶(以下稱為NRPS)的方法(Chem.Biol.,7,373-384(2000)、FEBS Lett.,498,42-45(2001)、美國專利第5795738號、美國專利第5652116號)。
但是,在利用蛋白分解酶的逆反應(yīng)的方法中,作為底物的氨基酸的官能團(tuán)的保護(hù)和脫保護(hù)是必需的,存在難以實現(xiàn)肽形成反應(yīng)的有效化和對肽分解反應(yīng)的抑制的問題。利用耐熱性氨酰基t-RNA合成酶的方法存在酶的表達(dá)、難以抑制目的產(chǎn)物以外的副反應(yīng)的問題。對于利用NRPS的方法,由于酶分子很大,難以使用DNA重組法表達(dá)該酶,必需供給輔酶4’-磷酸泛酰巰基乙胺(4’-phosphopantetheine),不能稱之為有效的制備方法。
一方面,已知有酶分子比NRPS小、不需要輔酶4’-phosphopantetheine的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase)、谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase)、D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)連接酶(D-Ala-D-Alaligase)、多聚-γ-谷氨酸合成酶(poly-γ-glutamatesynthetase)等一系列的肽合成酶。這些肽幾乎都是用D-氨基酸作底物的,此外,因為具有催化在γ位的羧基形成肽鍵等特征,所以不能用于在L-氨基酸的α位羧基以肽鍵結(jié)合的二肽的合成。
已知具有通過在L-氨基酸的α位羧基形成肽鍵的形成活性的只有來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物的二肽抗生素—桿菌溶素(bacilysin)合成酶。已知桿菌溶素合成酶具有合成桿菌溶素(L-丙氨酸-L-抗莢膜菌素,L-Ala-L-anticapsin)和L-丙氨?;?L-丙氨酸的活性,但尚不知道對其它的二肽的合成活性(J.Ind.Microbiol.,2,201-208(1987)、Enzyme.Microbial.Technol.,29,400-406(2001))。
已知有一種微生物能產(chǎn)生兩種由2個氨基酸連成的環(huán)狀二肽(二聚體哌嗪二酮(DKP),)結(jié)構(gòu)的化合物(J.Nat.Prod.59,293-296(1996),Tetrahedron,28,2999(1972),J.Appl.Microbiol.,86,29-53(1999))。據(jù)報道,對于二聚體哌嗪二酮的生物合成,在酸性瘡痂鏈霉菌(Streptomyces acidiscabies)的Thaxtomin生物合成過程中通過NRPS合成環(huán)-(L-4-硝基色氨?;?L-苯丙氨酸)(cyclo-(L-4-nitrotryptophyl-L-phenylalanine))結(jié)構(gòu)(Mol.Microbiol.,38,794-804(2000)),以及芽孢桿菌屬細(xì)菌NRPS的一部分調(diào)節(jié)(module)作用,由苯丙氨酸和脯氨酸生成環(huán)(苯丙氨?;滨;彼醕yclo(phenylalanyl-proline)(J.Biol.Chem.,273,22773-22781)。
一方面,作為抗生素白諾氏菌素(albonoursin)的產(chǎn)生株而為人所知的Streptomyces noursei ATCC11455株中存在與NRPS酶完全不相似的蛋白質(zhì)(albC基因產(chǎn)物)承擔(dān)著合成環(huán)(L-苯丙氨?;?L-亮氨酸)[cyclo(L-phenylalanyl-L-leucine)]的結(jié)構(gòu)的作用。據(jù)報道導(dǎo)入albC基因的大腸桿菌和淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)的培養(yǎng)液中檢測出由環(huán)二肽氧化酶作用得到的白諾氏菌素[Chemistry & Biol.,9,1355-1364(2002)],但無albC基因產(chǎn)物生成直二肽的報道。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì);編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA;含該DNA的重組體DNA、帶有該重組體DNA的轉(zhuǎn)化體;具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的制備方法;使用具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的二肽的酶合成法;將具有產(chǎn)生二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)能力的微生物或轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物等用作酶源的二肽的制備方法。
用于解決課題的方法本發(fā)明涉及以下的(1)-(24)。
(1)下述[1]~[3]中的任一項記載的蛋白質(zhì)(不過,由序列號1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)除外)[1]具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì);[2]由在序列號1或2所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的活性的蛋白質(zhì);[3]與序列號1或2所示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)。
(2)下述[1]~[3]中的任一項記載的二肽合成用蛋白質(zhì)[1]具有序列號1所示的氨基酸序列的二肽合成用蛋白質(zhì);[2]由在序列號1所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì);[3]與序列號1所示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì)。
(3)下述[1]~[3]中的任一項記載的DNA(不過,除了序列號3所示的堿基序列組成的DNA之外)[1]編碼上述(1)的蛋白質(zhì)的DNA;[2]具有序列號4所示的堿基序列的DNA;[3]和具有與序列號4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有合成式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。
(4)含有上述(3)的DNA的重組DNA。
(5)具有上述(4)的重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
(6)上述(5)的轉(zhuǎn)化體,其中該轉(zhuǎn)化體是以微生物作為宿主而得到的轉(zhuǎn)化體。
(7)上述(6)的轉(zhuǎn)化體,其中所述微生物是屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物。
(8)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)在上述(5)~(7)任一項中記載的轉(zhuǎn)化體,使上述(1)的蛋白質(zhì)在上述培養(yǎng)物中生成、積累,從該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì)的上述(1)的蛋白質(zhì)的制備方法。
(9)在培養(yǎng)基中具有產(chǎn)生上述(1)的蛋白質(zhì)的能力的微生物培養(yǎng),使該蛋白質(zhì)在上述培養(yǎng)基中生成、累積,從該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì)的上述(1)的蛋白質(zhì)的制備方法。
(10)上述(9)的制備方法,所述微生物是屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物。
(11)上述(10)的制備方法,其中屬于鏈霉菌屬的微生物是具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物。
(12)上述(11)的制備方法,所述具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物是白諾氏鏈霉菌(Streptomyces alborus)或諾爾斯氏鏈霉菌(Streptomyces noursei)的微生物。
(13)二肽的制備方法,使上述(1)的蛋白質(zhì)或上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)、一種以上的氨基酸、和ATP存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中使式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽生成、積累,從該介質(zhì)收集該二肽。
(14)二肽的制備方法,從下述[1]~[3]中選出的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源,使該酶源、一種以上的氨基酸存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中使式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的蛋白質(zhì)生成、積累,從該介質(zhì)收集該二肽,其中[1]上述(5)~(7)任一項記載的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物;[2]具有產(chǎn)生上述(1)的蛋白質(zhì)的能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物;[3]具有產(chǎn)生上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物。
(15)上述(14)的制備方法,所述具有產(chǎn)生上述(1)的蛋白質(zhì)的能力的微生物是屬于鏈霉菌屬的微生物。
(16)上述(14)的制備方法,所述具有產(chǎn)生上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物是屬于鏈霉菌屬的微生物。
(17)上述(15)或(16)的制備方法,所述屬于鏈霉菌屬的微生物是具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物。
(18)上述(17)的制備方法,所述具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物是白諾氏鏈霉菌或諾爾斯氏鏈霉菌。
(19)上述(14)的制備方法,具有產(chǎn)生上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物,是以編碼上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物。
(20)上述(19)的制備方法,以編碼上述(2)的二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物是屬于埃希氏菌屬的微生物。
(21)上述(14)~(20)的任一項的制備方法,其特征在于培養(yǎng)物的處理物是培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、離心分離培養(yǎng)物得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的凍干物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械性粉碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的蛋白質(zhì)分級物、該菌體的固定化物或由該菌體抽提得到的酶標(biāo)準(zhǔn)品。
(22)上述(13)~(21)的任一項的制備方法,其中,一種以上的氨基酸是L型或D型氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或它們的衍生物。
(23)上述(13)~(22)的任一項的制備方法,其中二肽是式(II)R3-R4(II)(式中,R3和R4表示相同或不同的L型或D型氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或它們的衍生物)所示的二肽。
(24)上述(22)~(23)的任一項的制備方法,其中的L型或D型氨基酸選自丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、α-氨基丁酸、氮絲氨酸、茶氨酸、4-羥基脯氨酸、3-羥基脯氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸以及6-重氮基-5-氧代正亮氨酸。
發(fā)明的效果按照本發(fā)明,可以提供具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì);編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA;含該DNA的重組體DNA、帶有該重組體DNA的轉(zhuǎn)化體;具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的制備方法;使用具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的二肽的酶合成法;將具有產(chǎn)生二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)能力的微生物或轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物等用作酶源的二肽的制備方法。
圖1表示具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒載體pAL-nou和pAL-alb的構(gòu)建過程。
符號的說明Ampr氨芐青霉素抗性基因lacIq乳糖抑制子基因albCalbC基因或albC近似基因具體實施方式
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì),可列舉下述[1]~[3]記載的蛋白質(zhì)(不過,由序列號1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)除外)[1]具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì);[2]由在序列號1或2所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的活性的蛋白質(zhì),和 與序列號1或2所示的氨基酸序列具有65%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上的同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)。
此外,作為本發(fā)明的二肽合成用蛋白質(zhì),可列舉下述[4]~[6]記載的二肽合成用蛋白質(zhì)[4]具有序列號1所示的氨基酸序列的二肽合成用蛋白質(zhì);[5]由在序列號1所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì)。
與序列號1所示的氨基酸序列具有65%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上的同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì)。
下面,有時將上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)和二肽合成用蛋白質(zhì)合稱為本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
可以通過下述方法獲得上述的缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成的,且具有式(I)所示二肽的合成活性的蛋白質(zhì)采用Molecular Cloning,A laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor laboratory Press(1989)(以下簡稱為《分子克隆》第3版),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons(1987-1997)(以下稱為分子生物學(xué)通用操作手冊),NucleicAcids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等中記載的位點特異性突變導(dǎo)入法,通過向編碼序列號1或2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入位點特異性突變。
對于缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)目沒有限定,不過,通過上述的位點特異性突變法等眾所周知的方法,能夠取代或添加程度的數(shù)量、從1個到數(shù)十個,優(yōu)選1~20個、更優(yōu)選1~10個、更優(yōu)選1~5個。
所說的在序列號1或2所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加1個以上的氨基酸,也可以是在同一個序列的任意位置上缺失、取代或添加1個或多個氨基酸。
作為可以進(jìn)行氨基酸取代的氨基酸,可列舉例如在使用公知的比對軟件比較序列號1或2所示的氨基酸序列時,不能在所有的氨基酸序列中保存的氨基酸。作為公知的比對軟件,可以列舉包括基因解析軟件Genetyx(軟件開發(fā)株式會社)的比對解析軟件。作為該解析軟件的解析參數(shù),可以使用默認(rèn)值。
此外,作為可以缺失、或添加的氨基酸的位置,可以列舉序列號1或2所示氨基酸序列的N末端側(cè)以及C末端側(cè)。
即使同時發(fā)生缺失、取代或添加也可以,不論缺失或添加的氨基酸為天然型和非天然型。作為天然型氨基酸,可以列舉L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸。
以下表示可以相互替代的氨基酸的例子。同一組中含有的氨基酸可以相互取代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己氨酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3二氨基丙酸
E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸此外,因為本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有式(I)所示二肽的合成活性,所以期望與序列號1或2所示的氨基酸序列具有65%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上的同源性。
氨基酸序列或堿基序列的同源性可以根據(jù)Karlin and Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Aca.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))進(jìn)行確定,根據(jù)該算法BLAST,開發(fā)出稱為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Boil.,215,403(1990)],在以基于BLAST的BLASTN分析堿基序列時,參數(shù)設(shè)為例如score=100,wordlength=12。另外,在以基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列時,參數(shù)設(shè)為例如score=50,wordlength=3。此外,使用BLAST和Gapped BLAST程序時,使用各個程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體的方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
作為確認(rèn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有式(I)所示二肽合成活性的手段,例如可以列舉使用DNA重組法制備表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體,使用該轉(zhuǎn)化體,制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)后,使本發(fā)明的蛋白質(zhì)、1種以上的氨基酸、以及ATP存在于水性介質(zhì)中,用HPLC等分析是否在上述水性介質(zhì)中生成、累積上述式(I)所示的二肽的方法。
作為本發(fā)明的DNA,可以列舉下述[1]~[3]中記載的DNA(不過,除了序列號3所示的堿基序列之外)[1]編碼序列號2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA;[2]具有序列號4所示的堿基序列的DNA,和[3]和具有與序列號4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。
此外,作為可用于本發(fā)明的式(I)所示二肽的制備方法中的DNA,除了上述[1]~[3]中記載的DNA之外,可列舉下述[4]~[6]記載的DNA[4]編碼序列號1所示氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA;[5]具有序列號3所示的堿基序列的DNA,和[6]和具有與序列號3所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有式(I)所示二肽的合成活性的蛋白質(zhì)的DNA。
這里所稱的“雜交”是指DNA與具有特定堿基序列的DNA或該DNA的一部分雜交的步驟。因此,具有該特定堿基序列的DNA或該DNA的一部分的堿基序列可用作Northern或Southern印跡分析的探針,或也可以是可作為PCR分析的寡核苷酸引物使用的長度的DNA。作為用作引物的DNA,可以是至少100個以上的堿基,優(yōu)選200個以上的堿基,更優(yōu)選500個以上的堿基的DNA,但是也可以是至少10個以上的堿基,優(yōu)選15個以上的DNA。
DNA的雜交實驗的方法是眾所周知的,例如只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以按照本申請說明書,確定雜交條件。這種雜交條件,可以按照《分子克隆》(Molecular Cloning)第2版、第3版(2001年),Methodsfor General and Molecular Bacteriology,ASM Press(1994),Immunology methods manual.Academic press(Molecular)中記載的內(nèi)容以及其它各種標(biāo)準(zhǔn)教科書進(jìn)行。
上述所稱的嚴(yán)格條件,優(yōu)選例如在含有50%甲酰胺,5×SSC溶液(750mM氯化鈉,75mM檸檬酸鈉),50mM磷酸鈉(pH 7.6),5×Denhardt溶液,10%的硫酸葡聚糖和20μg/l的變性的鮭精DNA的溶液中將固定了DNA的濾膜和探針42℃下溫育過夜后,例如約65℃下在0.2×SSC溶液中洗滌該濾膜的條件,但也可以使用嚴(yán)格度較低的條件。嚴(yán)格條件的變化可以通過甲酰胺的濃度調(diào)整(甲酰胺的濃度越低嚴(yán)格度越低)、鹽濃度和溫度條件的變化而變化。作為低嚴(yán)格條件,可以例舉有例如在含有6×SSCE溶液(20×SSCE是,3mol/l氯化鈉,0.2mol/l磷酸二氫鈉,0.02mol/l的EDTA,pH7.4),0.5%SDS,30%甲酰胺,100μg/l的變性鮭精DNA的溶液中于37℃下溫育過夜后,在50℃下用1×SSC溶液,0.1%SDS洗滌的條件。此外,作為更為低嚴(yán)格的條件,可以例舉有在上述低嚴(yán)格條件中,用高鹽濃度(例如5×SSC)的溶液進(jìn)行雜交后,進(jìn)行洗滌的條件。
上述各種條件也可以通過添加或改變用于抑制雜交實驗的背景的封閉試劑來設(shè)定,上述封閉試劑的添加,也可以伴隨雜交條件的改變進(jìn)行以適應(yīng)條件。
作為在上述嚴(yán)格條件下可以雜交的DNA,可以例舉有例如當(dāng)使用上述的BLAST或FASTA以上述參數(shù)等為基礎(chǔ)進(jìn)行計算時與序列號3或4表示的堿基序列至少具有90%以上,優(yōu)選95%以上,再優(yōu)選98%以上,更為優(yōu)選99%以上的同源性的DNA。
與序列號3或4所示堿基序列DNA在雜交條件下雜交的DNA,是編碼具有式(I)所示二肽的合成活性的蛋白質(zhì)的情況,例如,可以通過如上所述,使用重組法制備由該DNA所編碼的蛋白質(zhì),測定該蛋白質(zhì)的活性來確認(rèn)。
(i)本發(fā)明的DNA、和本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽的制備方法中使用的DNA的制備本發(fā)明的DNA、和本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽的制備方法(以下單獨稱為本發(fā)明的制備方法)中使用的DNA,例如可以使用根據(jù)序列號3或4所示的堿基序列設(shè)計得到的引物,與屬于鏈霉菌屬的微生物的染色體DNA文庫進(jìn)行southern雜交,使用根據(jù)序列號3或4所示的堿基序列設(shè)計得到的引物DNA,以屬于鏈霉菌屬的微生物的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR(PCR Protocol,Academic Press(1990))而獲得。
此外,也可以對各種基因序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行具有與編碼序列號1或2表示的堿基序列的DNA具有75%以上,優(yōu)選85%以上,更優(yōu)選90%以上,進(jìn)一步優(yōu)選具有95%以上,特別優(yōu)選98%以上,最優(yōu)選99%以上的同源性的序列的檢索,根據(jù)通過該檢索得到的堿基序列,由具有該堿基序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫等通過上述的方法等得到本發(fā)明的DNA或用于本發(fā)明的制備方法的DNA。
將該DNA照原樣或用適當(dāng)?shù)南拗泼傅惹袛啵ㄟ^常規(guī)的方法重組到載體中,將獲得的重組體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后,以通常使用的堿基序列分析方法,例如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74,5463(1977)]或使用373A·DNA測序儀(Perkin Elmer公司制)等堿基序列分析裝置進(jìn)行分析,可以確定該DNA的堿基序列。
在測定堿基序列的結(jié)果為獲得的DNA是部分長度DNA時,使用該部分長度DNA作為探針,通過對染色體DNA文庫進(jìn)行Southern雜交法等,可以獲得全長DNA。
進(jìn)而,也可以基于測定的DNA的堿基序列,用PerceptiveBiosystems公司制造的8905型DNA合成裝置等通過化學(xué)合成制備目的DNA。
作為如上所獲得的DNA,例如,可以列舉具有序列號3或4所示的堿基序列的DNA。
作為用于本發(fā)明的DNA的制備方法中使用的DNAD重組載體,可以例舉pBluescript II KS(+)(Stratagene公司制),pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)],pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene公司制)、pT7 Blue(Novagene公司制)、pCRII(Invitrogen公司制)和pCR-TRAP(ジ一ンハンタ一公司制)等。
作為宿主細(xì)胞,可以列舉屬于埃希氏菌屬的微生物等,作為屬于埃希氏菌屬的微生物,例如可以列舉大腸桿菌(Escherichiacoli)XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、大腸桿菌ME8415等。
作為導(dǎo)入重組體DNA的方法,可以使用上述將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法中的任意一種,例如例舉有使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 69,2110(1972)],原生質(zhì)體方法(特開昭63-248394)和電穿孔法[Nucleic Acids Res,16,6127(1988)]等。
作為根據(jù)上述方法得到帶有用于本發(fā)明的制備方法的DNA的微生物,例如可列舉含有具有序列號3所示的序列的DNA的重組子DNA的微生物大腸桿菌NM522/pAL-nou。
(ii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和本發(fā)明的二肽合成用蛋白質(zhì)的制備方法本發(fā)明的蛋白質(zhì)和本發(fā)明的二肽合成用蛋白質(zhì)可以采用分子克隆第3版、Current Protocols in Molecular Biology等中記載的方法,通過例如下述方法,使通過上述方法得到的本發(fā)明的DNA和用于本發(fā)明的制備方法的DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)、制造。
使用本發(fā)明的DNA或用于本發(fā)明的制備方法的DNA做為原料,根據(jù)需要制備成包括編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的部分的適當(dāng)長度的DNA片段。此外,通過堿基取代將編碼該蛋白質(zhì)的部分的堿基序列改變成最適于在宿主中表達(dá)的密碼子,可以使該蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率提高。
通過在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動子的下游插入該DNA片段,制備重組型DNA。
通過將該重組型DNA導(dǎo)入到適合該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中,可以獲得生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。
作為宿主細(xì)胞,可以是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等、植物細(xì)胞等,只要是能表達(dá)目的基因者都可以使用??闪信e優(yōu)選屬于細(xì)菌、更優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或棒桿菌屬的微生物,更優(yōu)選屬于埃希氏菌屬的微生物。
作為表達(dá)載體,是在生物體內(nèi)可以自主復(fù)制或可以整合到染色體中的表達(dá)載體,可以使用在可以轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的DNA或本發(fā)明的制備方法中使用的DNA的位置含有啟動子的表達(dá)載體。
使用細(xì)菌等原核生物作為宿主細(xì)胞時,具有本發(fā)明的DNA或用于本發(fā)明的制備方法中的DNA的重組體DNA,優(yōu)選為可以在原核生物中自主復(fù)制的同時,由啟動子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的DNA或本發(fā)明的制備方法中使用的DNA、轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組型DNA。也可以包含控制啟動子的基因。
作為表達(dá)載體,可列舉pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均為biochem.roche.com公司制)、pHelix(Roche Diagnostics公司制)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promage公司制)、pQE8(Qiagen公司制)、pQE60(Qiagen公司制)、pET-3(Novagene公司制)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(Agric.Biol.Chem.,48,669(1984))、pLSA1(Agric.Biol.Chem.,53,277(1989))、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306(1985))、pBluescript II SK(+)、pBluescript II KS(-)(Stratagene公司制)、pTrS30(由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制)、pTrS32(由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備)、pPAC31(WO98/12343)、pUC19(Gene,33,103(1985))、pSTV28(寶酒造公司制)、pUC118(寶酒造公司制)、pPA1(特開昭63-233798)等。
作為啟動子,只要是在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子可以是任意啟動子。例如,可以使用例如trp啟動子(Ptrp)啟動子、lac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子和PSE啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體的啟動子、SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子等。也可以使用2個Ptrp線性串連的啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子和let I啟動子等這樣的人為設(shè)計和改變的啟動子等。
另外,也可以使用用于在屬于芽孢桿菌屬的微生物中表達(dá)的xylA啟動子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,35,594-599(1991))、或在屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物中表達(dá)的P54-6啟動子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))、在屬于鏈霉菌屬的微生物中表達(dá)的xylA啟動子(Genetic Manipulation ofStreptomycesa Laboratory ManualJohn Innes Foundation)等。
優(yōu)選使用核糖體結(jié)合序列Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間的距離調(diào)節(jié)成適當(dāng)距離(例如6~18個堿基)的質(zhì)粒。
在本發(fā)明的DNA或與在用于本發(fā)明的制備方法中的DNA結(jié)合表達(dá)載體的重組體DNA中,轉(zhuǎn)錄終止序列并不總是必要的,但是優(yōu)選在結(jié)構(gòu)基因的緊下方直接配置轉(zhuǎn)錄終止序列。
作為這樣的重組體DNA,可以例舉有例如pAL-nuo和pAL-alb。
作為原核生物,可以例舉有埃希氏菌屬,沙雷氏菌屬(Serratia),芽孢桿菌屬,短桿菌屬(Brevibacterium),棒狀桿菌屬(Corynebacterium),微桿菌屬(Microbacterium),假單胞菌屬(Pseudomonas),土壤桿菌屬(Agrobacterium),脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus),魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena),組囊藍(lán)細(xì)菌屬(Anacystis),節(jié)桿菌屬(Arthrobacter),固氮桿菌屬(Azotobacter),著色菌屬(Chromatium),歐文氏菌屬(Erwinia),甲基桿菌屬(Methylobacterium),席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium),紅細(xì)菌屬(Rhodobacter),紅甲單胞菌屬(Rhodopseudomonas),紅螺菌屬(Rhodospirillum),柵藻屬(Scenedesmus),鏈霉菌屬(Streptomyces),聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechococcus)和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)。例如是大腸桿菌XL1-Blue,大腸桿菌XL2-Blue,大腸桿菌DH1,大腸桿菌DH5α,大腸桿菌MC1000,大腸桿菌KY 3276,大腸桿菌W1485,大腸桿菌JM109,大腸桿菌HB101,大腸桿菌No.49,大腸桿菌W3110,大腸桿菌NY49,大腸桿菌MP347,大腸桿菌NM522,枯草芽孢桿菌ATCC 33712,巨大芽孢桿菌,芽孢桿菌屬種(Bacillussp.)FERM BP-6030,解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes),未成熟短桿菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC 14068,解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066,黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067,產(chǎn)乳酸棒桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869,谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032,谷氨酸棒桿菌ATCC14297,嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870,嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354,無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria),居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola),液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens),粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens),假單胞菌屬種(Pseudomonas sp.)D-0110,放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter),發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes),懸鉤子土壤桿菌(Agrobacteriumrubi),柱孢魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena cylindrica),桶形魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena doliolum),水華魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena flos-aquae),金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens),檸檬節(jié)桿菌(Arthrobactercitreus),球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globformis),Arthrobacterhydrocarboglutamicus,邁索爾節(jié)桿菌(Arthrobacter mysorens),煙草節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotianae),石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus),原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae),玫瑰色石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter roseoparaffinus),硫磺節(jié)桿菌(Arthrobacter sulfureus),產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens),巴氏著色菌(Chromatium buderi),微溫著色菌(Chromatium tepidum),酒色著色菌(Chromatium vinosum),沃氏著色菌(Chromatium warmingii),Chromatium fluviatile,噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora),胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora),菠蘿歐文氏菌(Erwinia ananas),草生歐文氏菌(Erwinia herbicola),Erwinia punctata,Erwinia terreus,羅得西亞甲基桿菌(Methylobacterium rhodesianum),扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens),席藍(lán)細(xì)菌屬種(Phormidiumsp.)ATCC 29409,莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus),類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides),生芽紅假單胞菌(Rhodopseudomonas blastica),海紅菌(Rhodopseudomonas marina),血色紅假單孢菌(Rhodops eudomonas palustris),深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum),需鹽紅螺菌(Rhodospirillumsalexigens),鹽場紅螺菌(Rhodospirillum salinarium),產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens),金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens),金色鏈霉菌(Streptomyces aureus),殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus),灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes),灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus),淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans),橄欖灰鏈霉菌(Streptomycesolivogriseus),枝鏈霉菌(Streptomyces rameus),田無鏈霉菌(Streptomyces tanashiensis),酒紅鏈霉菌(Streptomyces vinaceus)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等,優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬或棒狀桿菌屬的微生物。
作為導(dǎo)入重組體DNA的方法,可以使用上述將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法中的任意一種,例如例舉有使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 69,2110(1972)],原生質(zhì)體方法(特開昭63-248394),電穿孔法[Nucleic Acids Res,16,6127(1988)]等。
使用酵母菌株作為宿主細(xì)胞時,作為表達(dá)載體,可列舉YEp13(ATCC37115)、Yep24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動子,只要能在酵母菌株中發(fā)揮功能者即可使用,例如PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克多肽啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。
作為宿主細(xì)胞,可列舉酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)等。具體可列舉啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸許旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)等。
作為導(dǎo)入重組體DNA的方法,可以使用上述將DNA導(dǎo)入酵母的方法中的任意一種,例如例舉有使用電穿孔法[MethodsEnzymol.,194,182(1990)]、球形原生質(zhì)體方法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984)、醋酸鋰法[J.Bacteriol.153,163(1983)]等。
以動物細(xì)胞作為宿主時,作為表達(dá)載體,例如可以使用pcDNAI、pcDM8(購自Funakoshi公司)、pAGE107(特開平3-22979)、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103[J.Biochem,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等。
作為啟動子,只要能在動物細(xì)胞中發(fā)揮功能即可使用,例如巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的啟動子、SV40早期啟動子或金屬硫蛋白啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子等。此外,也可以將啟動子與人CMV的IE基因的增強(qiáng)子一起使用。
作為宿主細(xì)胞,可列舉小鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞、小鼠雜交瘤細(xì)胞、人細(xì)胞的Namalwa細(xì)胞或Namalwa KJM-1細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、非洲綠猴腎臟細(xì)胞、中國倉鼠細(xì)胞CHO細(xì)胞、HBT5637(特開昭63-299)等。
作為小鼠骨髓瘤細(xì)胞,可列舉SP2/0、NSO等;作為大鼠骨髓瘤細(xì)胞,可列舉YB2/0等、作為人胚腎細(xì)胞可列舉HEK293(ATCC CR1-1573),作為人白血病細(xì)胞可列舉BALL-1等、作為非洲綠猴腎臟細(xì)胞,可列舉COS-1、COS-7等。
作為導(dǎo)入重組體DNA的方法,可以使用上述將DNA導(dǎo)入動物的方法中的任意一種,例如例舉有使用電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84,7413(1987)]、Virology,52,456(1973)中記載的方法等。
使用昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時,例如可根據(jù)BaculovirusExpression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman andCompany,New York(1992),Current Protocols in MolecularBiology,Molecular Biology,A Laboratory Manual,Bio/Technology,6,47(1988)等中記載的方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
即,將重組基因?qū)胼d體和桿狀病毒(Baculovirus)共導(dǎo)入到昆蟲細(xì)胞中,從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清中得到重組病毒之后,再用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞,生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
作為在該方法中使用的基因?qū)胼d體,例如可以是pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均為Invitrogen公司制)等。
作為桿狀病毒,例如,可以使用可感染夜盜蛾科昆蟲的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)等。
作為昆蟲細(xì)胞,可以使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細(xì)胞、銀紋夜蛾(Trichoplusiani)的卵細(xì)胞,來自蠶的卵細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞等。
作為草地貪夜蛾的卵細(xì)胞,可列舉Sf9、Sf21(BaculovirusExpression Vectors,A Laboratory Manual)等,作為銀紋夜蛾的卵細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞,可列舉High5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen公司制)等,作為來自蠶的卵細(xì)胞,可列舉家蠶(Bombyx mori)N4等。
作為為了制備重組病毒而向昆蟲細(xì)胞中共同導(dǎo)入上述重組基因?qū)胼d體和上述桿狀病毒的方法,可列舉磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413(1987)]等。
使用植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時,作為表達(dá)載體可使用例如Ti質(zhì)粒、煙草花葉病毒載體等。
作為啟動子,只要是能在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能者即可使用,例如花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動子、RiceActl啟動子等。
作為宿主細(xì)胞,可列舉煙草、馬鈴薯、西紅柿、胡蘿卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麥、大麥等植物細(xì)胞。
作為重組載體的導(dǎo)入方法,只要是能向植物細(xì)胞中導(dǎo)入的方法即可使用,例如使用土壤桿菌(Agrobacterium)的方法(特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977)、電穿孔法(特開昭60-251887)、粒子槍(基因槍)方法((日本)專利第2606856、(日本)專利第2517813)等。
通過酵母、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)時,可以得到添加了糖或糖鏈的蛋白質(zhì)。
將如上得到的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),使本發(fā)明的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中生成并累積,通過從該培養(yǎng)物中收集,可制造該蛋白質(zhì)。
作為用于制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的上述轉(zhuǎn)化體的宿主,可以是細(xì)菌、酵母動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等任何一種細(xì)胞,優(yōu)選細(xì)菌、更優(yōu)選屬于埃希氏菌屬的微生物,更優(yōu)選屬于大腸桿菌的微生物。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的方法,可按照在宿主培養(yǎng)中通常使用的方法進(jìn)行。
作為培養(yǎng)以大腸桿菌等原核生物或酵母等真核生物作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基,只要是含有該微生物能夠同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等,能有效地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體,可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任意一種。
作為碳源,只要是該微生物可以同化的碳源即可,可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它們的糖蜜、淀粉和淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合物;醋酸和丙酸等有機(jī)酸;乙醇和丙醇等醇類。
作為氮源,可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨等有機(jī)酸或無機(jī)酸銨鹽、含氮化合物、以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、豆餅、豆餅水解產(chǎn)物和各種發(fā)酵的微生物菌體和其消化的產(chǎn)物。
作為無機(jī)鹽,可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。
通常在振蕩培養(yǎng)或在深度通氣攪拌培養(yǎng)等需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度可以為15~40℃,培養(yǎng)時間通常是5小時至7天。在培養(yǎng)過程中,將pH維持在3.0~9.0。使用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。
此外,根據(jù)培養(yǎng)需要,在培養(yǎng)過程中還可以向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和四環(huán)素等抗生素。
當(dāng)培養(yǎng)經(jīng)采用誘導(dǎo)性啟動子作為啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時,根據(jù)需要,還可以向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如,在培養(yǎng)經(jīng)采用lac啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時,可以向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等;在培養(yǎng)經(jīng)采用trp啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時,可以向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸等。
作為培養(yǎng)以動物細(xì)胞作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基,通??梢允褂肦PMI1640培養(yǎng)基[J.Am.Med.Assoc.,199,519(1967)]、Eagle氏MEM培養(yǎng)基[Science,122,501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基[Virology,8,396(1959)]、199培養(yǎng)基[Proc.Soc.Biol.Med.,73,1(1950)],此外,還可以使用向這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清等的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)通常在pH6-8、25-40℃,5%CO2存在下等的條件下進(jìn)行1-7天。
此外,對應(yīng)于培養(yǎng)過程中的需要,也可以向培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素、鏈霉素等抗生素。
作為培養(yǎng)以昆蟲細(xì)胞作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基,通??梢允褂肨NM-FH(Pharmingen公司制)、Sf-900II SFM培養(yǎng)基(LifeTechnologies公司制)ExCel1400、ExCel1405(均為JRH Bio Sciences公司制)、Grace’s Insect Medium[Naure,195,788(1962)]等。
培養(yǎng)通常在pH6-7、25-30℃等的條件下進(jìn)行1-5天。
此外,培養(yǎng)過程中,根據(jù)需要,也可以向培養(yǎng)基中添加慶大霉素等抗生素。
可以將植物細(xì)胞作為宿主得到轉(zhuǎn)化體,作為細(xì)胞,或使之分化為植物的細(xì)胞或器官進(jìn)行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基,通??梢允褂肕urashige Skoog(MS)培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、或向這些培養(yǎng)基中添加了二氯苯氧乙酸(オ一キシン)、細(xì)胞因子等、植物激素的培養(yǎng)基等。
培養(yǎng)通常在pH5-9、20-40℃等的條件下進(jìn)行3-60天。
此外,對應(yīng)于培養(yǎng)過程中的需要,也可以向培養(yǎng)基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
如上所述,可以按照常規(guī)的培養(yǎng)方法,培養(yǎng)帶有與表達(dá)載體連接的本發(fā)明的DNA或用于本發(fā)明的制備方法的DNA的微生物、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、或來自植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體,使本發(fā)明的蛋白質(zhì)生成并累積,從該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì),制造該蛋白質(zhì)。
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法有在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的方法、向宿主細(xì)胞外分泌的方法、或在宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)的方法,可以根據(jù)選擇的方法,選擇使用的宿主細(xì)胞,改變生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)時,參照Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.264,17619(1989)],Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989),Genes Develop.,4,1288(1990)],或特開平05-336963、WO94/23021等記載的方法,能夠使該蛋白質(zhì)積極地向細(xì)胞外分泌。
即,使用基因重組的方法,通過以在含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性部位的蛋白質(zhì)的前面添加信號肽的形式進(jìn)行生產(chǎn),能夠使該蛋白質(zhì)積極地向宿主細(xì)胞外分泌。
此外,參照特開平2-227075記載的方法,利用二氫葉酸還原酶基因等基因擴(kuò)增系統(tǒng)能夠使產(chǎn)量提高。
再通過使導(dǎo)入基因的動物或植物的細(xì)胞再分化,制備導(dǎo)入了基因的動物個體(轉(zhuǎn)基因的非人動物)或植物個體(轉(zhuǎn)基因的植物),可以使用這些個體制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體是動物個體或植物個體時,可以按照常規(guī)的培養(yǎng)方法,培養(yǎng)或栽培,使該蛋白質(zhì)生成并累積,從該動物個體或植物個體收集該蛋白質(zhì),制造該蛋白質(zhì)。
作為使用動物個體制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法,可列舉例如按照公知的方法[Am.J.Clin.Nutr.,63,639S(1996),Am.J.Clin.Nutr.,63,627S(1996),Bio/Technology,9,830(1991)],導(dǎo)入基因,在得到的動物中生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
是動物個體的情況下,可以例如可以飼養(yǎng)導(dǎo)入了本發(fā)明的DNA或用于本發(fā)明的制備方法的DNA的轉(zhuǎn)基因的非人動物,使本發(fā)明的蛋白質(zhì)在該動物中生成并累積,從該動物中收集該蛋白質(zhì),制造該蛋白質(zhì)。作為在該動物中的生成、累積的場所,可列舉該動物的乳汁(特開昭63-309192)、卵(蛋)等。作為此時使用的啟動子,只要是在動物中具有功能的即可使用。例如適宜使用乳腺細(xì)胞特異性啟動子α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子、乳清酸性蛋白質(zhì)啟動子等。
使用植物個體作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制備方法,可列舉例如,參照公知方法[組織培養(yǎng),20(1994),組織培養(yǎng),21(1995),TrendsBiotechnol.,15,45(1997)]栽培導(dǎo)入了編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)基因植物。使該蛋白質(zhì)在該植物中生成并累積,從該植物中收集該蛋白質(zhì),制造該蛋白質(zhì)。
作為分離、純化使用生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法,可以使用常規(guī)的酶的分離、純化方法。
例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)以在細(xì)胞內(nèi)溶解狀態(tài)生產(chǎn)時,在培養(yǎng)結(jié)束后,通過離心分離回收細(xì)胞,在水類緩沖液中懸浮后,通過超聲波破碎儀、弗氏壓釜、マントンガウリン勻漿機(jī)、珠粒磨碎機(jī)等破碎細(xì)胞,得到無細(xì)胞提取液。
由通過離心分離該無細(xì)胞提取液得到的上清,單獨或組合使用下述常規(guī)的酶的分離方法,能夠得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品,所述的方法包括溶媒提取法、通過硫酸銨的鹽析法、脫鹽法,以有機(jī)溶劑的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-Sepharose、DIAION HPA-75(三菱化成公司制)等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-SepharoseFF(Pharmacia公司制)等的樹脂的陽離子交換層析法,使用butyl-Sepharose、phenyl-Sepharose等樹脂的疏水性層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、等電點電泳等電泳方法等。
此外,該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體進(jìn)行生產(chǎn)時,同樣回收細(xì)胞后破碎,由通過離心分離的得到的沉淀級分中通過常規(guī)方法回收該蛋白質(zhì)后,用蛋白質(zhì)變性劑溶解該蛋白質(zhì)的包涵體。
可以將該溶解液在不含蛋白質(zhì)變性劑或蛋白質(zhì)變性劑的濃度不使蛋白質(zhì)變性程度的稀釋的溶液中稀釋或透析,使該蛋白質(zhì)形成正常的立體結(jié)構(gòu)后,通過與上述同樣的分離純化方法得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
可以在本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其糖修飾體等的衍生物向細(xì)胞外分泌時,回收培養(yǎng)上清中的該蛋白質(zhì)或其糖附加體等的衍生物。
即,將該培養(yǎng)物通過與上述相同的離心分離等方法得到可溶性級分,從該可溶性級分通過使用與上述相同的分離方法得到純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
作為這樣得到的蛋白質(zhì),可列舉例如序列號1或2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
此外,作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn),可以利用對融合蛋白質(zhì)具有親和性的物質(zhì)的親和層析進(jìn)行純化。
作為被融合的蛋白質(zhì),可列舉β-半乳糖苷酶、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)域、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸鏈(His-tag)、S肽、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、Tac抗原、硫氧化還原蛋白、綠色熒光蛋白質(zhì)、FLAG肽、以及任何抗體表位[山川彰夫,實驗醫(yī)學(xué),13,469-474(1995)]。
作為對上述被融合的蛋白質(zhì)具有親和性的物質(zhì),可列舉識別β-半乳糖苷酶、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)域、氯霉素乙?;D(zhuǎn)移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸鏈(His-tag)、S肽、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、Tac抗原、硫氧化還原蛋白、綠色熒光蛋白質(zhì)、FLAG肽、以及任何抗體表位的抗體,例如IgG。
此外,根據(jù)上述得到的蛋白質(zhì)的氨基酸信息,可以通過Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成方法,制造本發(fā)明的蛋白質(zhì),此外,也可以利用Advanced ChemTech公司,PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津制作所等的肽合成儀,進(jìn)行化學(xué)合成。
(iii)本發(fā)明的二肽的制備方法(1)酶的制備方法作為二肽酶的制備方法,可列舉使本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)、一種以上的氨基酸、以及ATP存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中生成、累積式(I)所示的二肽,從該介質(zhì)中回收該二肽的方法。
在上述制備方法中,作為用作底物的1種以上的氨基酸,優(yōu)選1或2種氨基酸,可列舉選自L型或D型氨基酸、甘氨酸(Gly)、β-丙氨酸(βAla)及其衍生物的氨基酸,優(yōu)選L-氨基酸,從由Gly和β-丙氨酸及其衍生物組成的組中選出的氨基酸,只要是該氨基酸,也可以使用任何氨基酸的任何組合。作為L型或D型氨基酸,可列舉丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和α-氨基丁酸(α-AB)、重氮絲氨酸(Azaserine)、茶氨酸(theanine)、4-羥基脯氨酸(4-HYP)、3-羥基脯氨酸(3-HYP)、鳥氨酸(Orm)、瓜氨酸(Cit)、6-重氮基-5-氧代正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-norleucine)等。作為L型的氨基酸,可以例舉L-Ala、L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp和L-α-AB、L-Azaserine、L-theanine、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orm、L-Cit、L-6-diazo-5-oxo-norleucine等。
作為氨基酸的衍生物,可以例舉有羥氨基酸(β-羥谷氨酰胺、β-羥谷氨酸、γ-羥谷氨酸、α-羥甘氨酸、β-羥纈氨酸、γ-羥纈氨酸、β-羥亮氨酸、γ-羥亮氨酸、δ-羥亮氨酸、β-羥異亮氨酸、γ-羥異亮氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、β-羥苯丙氨酸、3,4-二羥苯丙氨酸,2,4,5三羥苯丙氨酸,β-羥色氨酸、5-羥色氨酸、α-羥蛋氨酸、β-羥絲氨酸、γ-羥蘇氨酸、S-羥半胱氨酸、β-羥天冬酰胺、β-羥酪氨酸、β-羥賴氨酸、γ-羥賴氨酸、δ-羥賴氨酸、N-羥賴氨酸、β-羥精氨酸、δ-羥精氨酸、N-羥精氨酸、β-羥組氨酸、β-羥天冬氨酸、β-羥鳥氨酸、γ-羥鳥氨酸、N-羥鳥氨酸)、N-甲基-氨基酸(N-甲基-丙氨酸、N-甲基-谷氨酰胺、N-甲基-谷氨酸、N-甲基-甘氨酸、N-甲基-纈氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-異亮氨酸、N-甲基-脯氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-蛋氨酸、N-甲基-絲氨酸、N-甲基-蘇氨酸、N-甲基-半胱氨酸、N-甲基-天冬酰胺、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-賴氨酸、N-甲基-精氨酸、N-甲基-組氨酸、N-甲基-天冬氨酸、N-甲基-鳥氨酸)等。
作為在上述制備方法中使用的更優(yōu)選的1種或2種氨基酸,可列舉選自L-Ala、L-Leu以及L-Phe中的1種或2種氨基酸,更優(yōu)選選自L-Ala、L-Leu以及L-Phe中的1種氨基酸,或由L-Leu和L-Phe組成的2種氨基酸。
上述制備方法中使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)按照使用的底物氨基酸每1mg添加0.01-100mg,優(yōu)選添加0.1mg-10mg。
在上述制備方法中,在初始或反應(yīng)過程中向水性介質(zhì)中添加作為底物使用的氨基酸使之以總量計達(dá)到0.1-500g/L的濃度、優(yōu)選0.2~200g/L的濃度。
作為在上述制備方法中使用的水性介質(zhì),只要不抑制二肽的生成反應(yīng),可以為任何成分、組成的水性介質(zhì),可以例舉有水,磷酸鹽緩沖液,碳酸鹽緩沖液,醋酸鹽緩沖液,硼酸鹽緩沖液,檸檬酸鹽緩沖液和Tris緩沖液等緩沖液?;?,甲醇、乙醇等醇類,醋酸乙酯等酯類,丙酮等酮類,和乙酰胺等酰胺類等。
二肽的生成反應(yīng),于水性介質(zhì)中,為pH5-11,優(yōu)選pH6-10,20-50℃,優(yōu)選25-45℃的條件下進(jìn)行2~150小時,優(yōu)選進(jìn)行6~120小時。
作為以上述制備方法制備的二肽,可以例舉有由上述式(I)表示的二肽,優(yōu)選,式中,R1和R2相同或不同,為L型或D型的氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或其衍生物的二肽,優(yōu)選L型的氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或其衍生物的二肽。
作為L型的氨基酸和氨基酸的衍生物,可以列舉前述物質(zhì)。
作為以上述方法制造的,更優(yōu)選的二肽,可列舉L-亮氨?;?L-苯丙氨酸、L-苯丙氨?;?L-亮氨酸、L-丙氨酰基-L-丙氨酸、L-亮氨酰基-L-亮氨酸和L-苯丙氨?;?L-苯丙氨酸等。
(2)使用轉(zhuǎn)化體、或微生物的培養(yǎng)物、或培養(yǎng)物的處理物作為酶源的制備方法作為使用轉(zhuǎn)化體、或微生物的培養(yǎng)物、或培養(yǎng)物的處理物作為酶源的制備方法,可列舉將具有產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的轉(zhuǎn)化體、或具有產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物的培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的處理物作為酶源,使該酶源以及一種以上的氨基酸存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中生成、累積式(I)所示的二肽,從該介質(zhì)中回收該二肽的方法的二肽的制備方法。
作為在上述制備方法中使用的轉(zhuǎn)化體,可以列舉能夠通過上述(ii)的方法制造的、生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。作為該轉(zhuǎn)化體的宿主,可列舉細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等、植物細(xì)胞等,優(yōu)選細(xì)菌,更優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬或棒桿菌屬的微生物。
作為屬于埃希氏菌屬的微生物,優(yōu)選可列舉屬于大腸桿菌的微生物,作為屬于芽孢桿菌屬的微生物,優(yōu)選可列舉屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的微生物,作為屬于鏈霉菌屬的微生物,優(yōu)選可以列舉淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans),作為屬于棒桿菌屬的微生物,可列舉屬于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的微生物。
用于上述制備方法的微生物,只要是具有產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)能力的微生物,可以是任何微生物,優(yōu)選屬于鏈霉菌屬的微生物,更優(yōu)選具有白諾氏菌素合成活性的屬于鏈霉菌屬的微生物,進(jìn)一步優(yōu)選屬于選自白諾氏鏈霉菌(Streptomyces alborus)或諾爾斯氏鏈霉菌(Streptomyces noursei)的種的微生物,最優(yōu)選白諾氏鏈霉菌IFO14147、諾爾斯氏鏈霉菌ATCC11455或IFO15452株。
作為培養(yǎng)物的處理物,只要維持與培養(yǎng)物相同的活性,可以是實施了任何公知處理的培養(yǎng)物的處理物,作為該處理物,可以例舉有培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、通過離心分離培養(yǎng)物獲得的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑的處理物、該菌體的溶劑的處理物、該菌體的酶處理物和該菌體的固定化物等含有活菌體的處理物,以及這些菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械研磨處理物、該菌體的蛋白質(zhì)級分物、以及從該菌體中提取純化獲得的酶標(biāo)準(zhǔn)品等。
在上述制備方法中,用作底物的氨基酸的種類、使用濃度以及添加時間,以及生產(chǎn)的二肽與上述(iii)的(1)的基于酶的制備方法相同。
此外,作為以微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源的制備方法中使用的水性介質(zhì),可以使用添加上述(iii)的(1)的基于酶的制備方法中使用的水性介質(zhì)、作為酶源使用的轉(zhuǎn)化體的或微生物的培養(yǎng)液也可以作為水性介質(zhì)。
在上述制備方法中,根據(jù)需要,作為ATP的供給源,ATP或轉(zhuǎn)化體或微生物代謝能夠產(chǎn)生ATP的化合物,可以向水性介質(zhì)中加入例如葡萄糖之類的糖類、乙醇之類的醇類、醋酸之類的有機(jī)酸類等。
此外,根據(jù)需要,也可以添加表面活性劑或有機(jī)溶劑。作為表面活性劑,可以使用例如聚氧乙烯十八烷基胺(例如Nymeen S-215,日本油脂公司制)等非離子表面活性劑,例如溴化十六烷基三甲銨和烷基二甲基芐基氯化銨(例如Cation F2-40E,日本油脂公司制)等陽離子表面活性劑,例如月桂酰肌氨酸酯(ザルコシネ一ト)等陰離子表面活性劑,和例如烷基二甲胺(例如叔胺FB,日本油脂公司制)等叔胺等,只要能促進(jìn)二肽的生成任何物質(zhì)即可,可以單獨使用或也可以多種混合使用。表面活性劑通常以0.1至50g/l的濃度使用。作為有機(jī)溶劑,可例舉有二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、醋酸乙酯等,通常以0.1至50ml/l的濃度使用。
以培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源使用時,該酶源的量因所用的該酶源的比活性等而不同,例如每1mg用作底物的氨基酸以濕菌體的重量計為5-1000mg,優(yōu)選10-400mg添加。
二肽的生成反應(yīng),于水性介質(zhì)中,pH5-11,優(yōu)選pH6-10,20-65℃,優(yōu)選25-55℃,更優(yōu)選30-45℃的條件下通常進(jìn)行1分鐘~150小時,優(yōu)選進(jìn)行3分鐘~120小時,更優(yōu)選進(jìn)行30分鐘-100小時。
在上述(iii)的(1)或(2)的制備方法中,水性介質(zhì)中生成、累積的二肽的回收,可以通過使用活性炭、離子交換樹脂等的常規(guī)的分離和純化方法,或通過有機(jī)溶劑抽提、結(jié)晶、薄層層析、高效液相層析等進(jìn)行。
下面展示了本發(fā)明的實施例,但是本發(fā)明并不受這些實施例的限制。
實施例1albC基因以及其類似基因的獲得根據(jù)諾爾斯氏鏈霉菌的albC基因的堿基序列[Chemistry & Biol.,9,1355(2002)],用以下的方法獲得來自諾爾斯氏鏈霉菌和白諾氏鏈霉菌的albC基因及其類似基因。
首先,諾爾斯氏鏈霉菌IFO15452株和白諾氏鏈霉菌IFO14147分別接種到添加了1%的甘氨酸的KM73培養(yǎng)基[2g/l酵母提取物(Difco公司制)、10g/l可溶性淀粉(和光純藥工業(yè)公司制造)、KP培養(yǎng)基[15g/L葡萄糖、10g/l的甘油、10g/l多蛋白胨(日本制藥株式會社制)、10g/l肉膏(極東制藥工業(yè)株式會社制)、4g/l碳酸鈣]中,在28℃下振搖過夜。并且,諾爾斯氏鏈霉菌IFO15452株和白諾氏鏈霉菌IFO14147株是從獨立行政法人制品評價技術(shù)基地機(jī)構(gòu)生物資源部門[National Institute of Technology and Evalution(NITE)Biological Resource Center(BRC)]( 292-0818,千葉縣木更津市和佐(かずさ)鐮足2-5-8)轉(zhuǎn)讓獲得。
培養(yǎng)后,按Genetic Manipulation of StreptomycesaLaboratory ManualJohn Inners Foundation中記載的方法從該微生物中分離純化該微生物的染色體DNA。
基于albC基因的堿基序列,用Perceptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成儀,合成具有序列號5和6表示的堿基序列的DNA(以下分別稱為引物A,引物B)。引物A為添加了含諾爾斯氏鏈霉菌的染色體DNA的albC基因的起始密碼子區(qū)域的5’末端上含有NcoI識別序列的堿基序列。引物B為添加了與含albC基因的終止密碼子的序列相互補(bǔ)的堿基序列的5’末端上含有BglII識別序列的堿基序列。
使用上述引物A和引物B作為引物組,以諾爾斯氏鏈霉菌或白諾氏鏈霉菌的染色體DNA作為模板,進(jìn)行PCR。PCR通過以下方式進(jìn)行使用50μl反應(yīng)液,其中含0.1μg染色體DNA,引物各0.5μmol/l,2.5units的ExTaq DNA聚合酶(寶生物公司制),5μl用于ExTaq DNA聚合酶的×10緩沖液(寶生物公司制),dNTP(dATP dGTP dCTP和dTTP)各200μmol/l,5μl二甲基亞砜,重復(fù)進(jìn)行30次94℃1分鐘,55℃30秒,72℃1分鐘的步驟。
將1/10的量的該反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)擴(kuò)增約0.7kb的DNA片段后,添加與剩余的反應(yīng)液等量的TE[10mmol/lTris-HCl(pH8.0)、1mmol/l EDTA]飽和苯酚/氯仿(1vol/vol),混合。離心分離該混合液后,在所得上層中加入2倍體積的冷乙醇,混合,于-80℃放置30分鐘。將離心分離該溶液獲得的DNA沉淀后,分別溶解于20μl的TE中。
分別使用該溶解液5μl,用限制酶NcoI和BglII切斷擴(kuò)增后的DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后,使用基因純化II試劑盒(GENECLEANII kit BIO101公司制),分別回收700bp的DNA片段。
用限制性酶NcoI和BglII切斷0.2μg的含噬菌體T5啟動子的表達(dá)載體pQE60(QIAGEN公司制)后,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,通過與上述同樣的方法回收3.4kb的DNA片段。
將由上述得到的來自各放線菌的0.7kb的片段和來自pQE60的3.4kb的DNA片段使用連接試劑盒(寶生物公司制),在16℃下反應(yīng)16小時進(jìn)行連接。
使用該反應(yīng)液,通過使用鈣離子法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA69,2110(1972)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522株(Stratagene公司制),將該轉(zhuǎn)化體涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌胰蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、5g/l氯化鈉、瓊脂20g/l]后,在30℃下培養(yǎng)過夜。
通過公知的方法從生長繁殖的轉(zhuǎn)化體的克隆中提取質(zhì)粒,使用限制性內(nèi)切酶,進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,確認(rèn)得到了在噬菌體T5啟動子下游連接了來自諾爾斯氏鏈霉菌的DNA的表達(dá)載體pAL-nou,和連接了來自白諾氏鏈霉菌的DNA的表達(dá)載體pAL-alb(圖1)。
使用堿基序列測定裝置373A·DAN測序儀分別對插入到質(zhì)粒中的來自放線菌的DNA部分的堿基序列進(jìn)行測定,確認(rèn)在pAL-alb中具有編碼序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA,即含有具有序列號3所示堿基序列的DNA;在pAL-nou中具有編碼序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA,即含有具有序列號4所示的堿基序列的DNA。
實施例2以菌體作為酶源制備二肽將帶有實施例1中得到的帶有pAL-nou或pAL-alb的大腸桿菌NM522(大腸桿菌NM522/pAL-nou株或大腸桿菌NM522/pAL-alb株)以及不帶有質(zhì)粒的NM522株接種到裝有含50μg/ml氨芐青霉素的10ml LB培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌胰蛋白胨(Difco公司制)、5g/l酵母提取物(Difco公司制)、5g/l氯化鈉]的試管中(不帶有質(zhì)粒株的情況下,不添加氨芐青霉素,以下相同)后,在30℃下培養(yǎng)17小時。將0.5ml該培養(yǎng)液接種到裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml容量的三角燒瓶中,在30℃下振搖培養(yǎng)1小時后,添加異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mmol/l,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心分離該培養(yǎng)液,得到濕菌體。
制備含有終濃度100mg/ml的該濕菌體、3.0ml的60mmol/l的磷酸鉀緩沖液(pH7.2),10mmol/l的氯化鎂,10mmol/l的ATP,1g/L的L-亮氨酸,1g/L的L-苯丙氨酸的反應(yīng)液,在30℃下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)1小時后取樣,添加乙腈至20%(v/v)后,用HPLC分析反應(yīng)生成物。
分離柱ODS-HA柱(YMC公司制)洗脫液30%(v/v)乙腈流動速度0.6ml/min檢測紫外吸收215nm其結(jié)果,確認(rèn)大腸桿菌NM522/pAL-nuo株的反應(yīng)液中累積了36.7mg/ml的cyclo(L-Leu-L-Phe),在大腸桿菌NM522株的反應(yīng)液中幾乎檢測不出cyclo(L-Leu-L-Phe)。相同的反應(yīng)液以下述條件進(jìn)行HPLC分析,測定直鏈狀的二肽L-亮氨?;?L-苯丙氨酸(L-Leu-L-Phe)和L-苯丙氨?;?L-亮氨酸(L-Phe-L-Leu)。
用F-moc法衍生化直鏈二肽之后,進(jìn)行HPLC分析。
分離柱野村化學(xué)公司制的ODS-HG-5柱洗脫液A液-6ml/L醋酸、20%(v/v)乙腈(用三乙胺調(diào)節(jié)到pH4.8)洗脫液B液-6ml/L醋酸、70%(v/v)乙腈(用三乙胺調(diào)節(jié)到pH4.8)流動速度0.6ml/min檢測激發(fā)波長254nm,熒光波長630nm洗脫液混合比如表1所示表1
其結(jié)果,確認(rèn)大腸桿菌NM522/pAL-nuo株的反應(yīng)液中累積了21.9mg/ml的L-Leu-L-Phe和12.0mg/ml L-Phe-L-Leu。在作為對照株的大腸桿菌NM522株的反應(yīng)液中未檢測出任何直鏈二肽。所以,可以明確本發(fā)明得到的二肽合成酶具有合成直鏈狀二肽的能力。
實施例3使用純化酶制備二肽(1)同實施例2一樣培養(yǎng)大腸桿菌NM522/pAL-nuo株。培養(yǎng)結(jié)束后,通過離心得到濕菌體,用60mmol/l的磷酸鉀緩沖液(pH7.2)洗滌后,重懸在含有10mmol/l咪唑的含20mmol/l的磷酸鉀緩沖液中。將該混懸液在4℃下超聲波處理,得到菌體破碎液。將該菌體破碎液(10ml,含0.863mg蛋白質(zhì))流過Amersham公司制的His-tag純化柱,通過流過柱子15ml含有10mmol/l咪唑的含20mmol/l的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行洗滌,在柱內(nèi)進(jìn)行附有His-tag的albC蛋白質(zhì)的純化。然后,將該附有His-tag的albC蛋白質(zhì)保持的柱子,用2ml與實施例2相同組成的反應(yīng)液(反應(yīng)液組成60mmol/l的磷酸L-鉀緩沖液(pH7.2)、10mmol/l的氯化鎂,10mmol/l的ATP,1g/L的L-亮氨酸,1g/L的L-苯丙氨酸組成的反應(yīng)液)流過柱子,以在柱子內(nèi)保持底物的狀態(tài),在30℃下孵育,用2ml相同組成的反應(yīng)液洗脫柱內(nèi)的反應(yīng)液,通過與實施例2相同的方法定量反應(yīng)液中的環(huán)二肽和二肽。
其結(jié)果,可知生成了cyclo(L-Leu-L-Phe)6.8mg/L、L-Leu-L-Phe28.7mg/L和L-Phe-L-Leu 18.5mg/L。用不含ATP的反應(yīng)液進(jìn)行同樣溫育時,未檢測出環(huán)二肽、二肽。
實施例4用純化酶制備二肽(2)除了用其它氨基酸替換底物氨基酸之外,用與實施例3相同的方法進(jìn)行酶反應(yīng),分析生成物。反應(yīng)液除了將底物氨基酸換成1g/L的L-丙氨酸、L-亮氨酸或L-苯丙氨酸之外,使用與實施例2相同組成的溶液。
其結(jié)果,可知在反應(yīng)開始24小時后,分別生成了9.41mg/L的L-Ala-L-Ala、7.85mg/L的L-Leu-L-Leu或5.20mg/L的L-Phe-L-Phe。
序列表free-text序列號5-人工序列的說明合成DNA序列號6-人工序列的說明合成DNA
序列表序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社<120>二肽的制備方法<130>1679<150>JP2004-125486<151>2004-04-21<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>239<212>PRT<213>諾爾斯氏鏈霉菌IFO 15452(Streptomyces noursei IFO15452)<400>1Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Pro Asp His Gly Met Arg Glu Glu1 5 10 15Ile Leu Gly Asp Arg Ser Arg Leu Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala20 25 30Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Thr35 40 45Val Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln Arg Phe Glu Arg Thr Asp Val50 55 60Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Arg65 70 75 80Ser Ala Gln Glu Ala Glu Arg Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu85 90 95Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ala Glu100 105 110Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Leu Gln Glu Thr Pro Glu Tyr115 120 125
Arg Ala Val Arg Glu Arg Thr Asp Arg Ala Phe Glu Glu Asp Ala Glu130 135 140Phe Ala Thr Ala Cys Glu Asp Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg145 150 155 160Pro Gly Asp Gly Val Gly Ile Ser Ala Glu His Leu Arg Ala Gly Leu165 170 175Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val180 185 190Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr Hi s Ile Asp Thr ProIle195 200 205Thr Ala Phe Leu Ser Arg Arg Glu Thr Gly Phe Arg Ala Ala Glu Gly210 215 220Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala225 230 235<210>2<211>239<212>PRT<213>Streptomyces alborus IFO15452<400>2Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Leu Asp His Ser Met Arg Glu Glu1 5 10 15Ile Leu Gly Asn Arg Gly Arg Lys Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala20 25 30Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Val35 40 45Thr Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln His Phe Glu Arg Thr Asp Val50 55 60Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Asp Met Leu Met Ala Asp Gly Arg65 70 75 80
Ser Ala Gln Glu Ala Glu Lys Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu85 90 95Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ser Glu100 105 110Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Ile Gln Glu Thr Pro Glu Tyr115 120 125Arg Ala Ala Arg Glu Ser Thr Asp Arg Ala Phe Arg Glu Asp Gly Glu130 135 140Phe Ala Thr Val Cys Glu Glu Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg145 150 155 160Pro Gly Asp Gly Val Asp Ile Ser Glu Glu His Leu Arg Ala Gly Leu165 170 175Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val180 185 190Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Pro Thr Pro Val195 200 205Ser Thr Phe Leu Ala His Arg Glu Thr Gly Phe Gln Ala Ala Gln Gly210 215 220Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala225 230 235<210>3<211>717<212>DNA<213>Streptomyces noursei IFO15452<400>3atg ctt gca ggc tta gtt ccc gcg ccg gac cac gga atg cgg gaa gaa48Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Pro Asp His Gly Met Arg Glu Glu1 5 10 15ata ctt ggc gac cgc agc cga ttg atc cgg caa cgc ggt gag cac gcc96Ile Leu Gly Asp Arg Ser Arg Leu Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala20 25 30
ctc atc gga atc agt gcg ggc aac agt tat ttc agc cag aag aac acc144Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Thr35 40 45gtc atg ctg ctg caa tgg gcc ggg cag cgt ttc gag cgc acc gat gtc192Val Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln Arg Phe Glu Arg Thr Asp Val50 55 60gtc tat gtc gac acc cac atc gac gag atg ctg atc gcc gac ggc cgc240Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Arg65 70 75 80agc gcg cag gag gcc gag cgg tcg gtc aaa cgc acg ctc aag gat ctg288Ser Ala Gln Glu Ala Glu Arg Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu85 90 95cgg cgc aga ctc cgg cgc tcg ctg gag agc gtg ggc gac cac gcc gag336Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ala Glu100 105 110cgg ttc cgt gtc cgg tcc ctg tcc gag ctc cag gag acc cct gag tac384Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Leu Gln Glu Thr Pro Glu Tyr115 120 125cgg gcc gta cgc gag cgc acc gac cgg gcc ttc gag gag gac gcc gaa432Arg Ala Val Arg Glu Arg Thr Asp Arg Ala Phe Glu Glu Asp Ala Glu130 135 140ttc gcc acc gcc tgc gag gac atg gtg cgg gcc gtg gtg atg aac cgg480Phe Ala Thr Ala Cys Glu Asp Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg145 150 155 160ccc ggt gac ggc gtc ggc atc tcc gcg gaa cac ctg cgg gcc ggt ctg528Pro Gly Asp Gly Val Gly Ile Ser Ala Glu His Leu Arg Ala Gly Leu165 170 175aac tac gtg ctg gcc gag gcc ccg ctc ttc gcg gac tcg ccc gga gtc576Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val180 185 190ttc tcc gtc ccc tcc tcg gtg ctc tgc tac cac atc gac acc ccg atc624Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Asp Thr Pro Ile195 200 205
acg gcg ttc ctg tcc cgg cgc gag acc ggt ttc cgg gcg gcc gag gga672Thr Ala Phe Leu Ser Arg Arg Glu Thr Gly Phe Arg Ala Ala Glu Gly210 215 220cag gcg tac gtc gtc gtc agg ccc cag gag ctg gcc gac gcg gcc717Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala225 230 235<210>4<211>717<212>DNA<213>Streptomyces alborus IFO15452<400>4atg ctt gca ggc tta gtt ccc gcg ctg gac cac agc atg cgg gaa gaa 48Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Leu Asp His Ser Met Arg Glu Glu1 5 10 15ata ctt ggc aat cgc ggc cga aag atc cgg caa cgc ggt gag cac gct 96Ile Leu Gly Asn Arg Gly Arg Lys Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala20 25 30ctc att gga atc agt gcg ggc aac agt tat ttc agc cag aag aac gtc144Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Val35 40 45acc atg ctg ctg caa tgg gcc ggg cag cat ttc gag cgc acg gat gtc192Thr Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln His Phe Glu Arg Thr Asp Val50 55 60gtc tac gtg gac acg cac atc gac gac atg ctg atg gcg gac ggc cgc240Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Asp Met Leu Met Ala Asp Gly Arg65 70 75 80agc gcg cag gaa gcc gag aag tcg gtc aag cgc acg ctc aag gat ctg288Ser Ala Gln Glu Ala Glu Lys Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu85 90 95cgg cgc agg ctg cgg cgc tcg ttg gaa agc gtg ggc gac cac agc gag336Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ser Glu100 105 110
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>5agagccatgg gacttgcagg cttagttccc gc 32
<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNAagagagatct ggccgcgtcg gccagctcc 29
權(quán)利要求
1.下述[1]~[3]中的任一項記載的蛋白質(zhì)(不過,含有序列號1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)除外)[1]具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì);[2]由在序列號1或2所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸);[3]由與序列號1或2所示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)。
2.下述[1]~[3]中的任一項記載的二肽合成用蛋白質(zhì)[1]具有序列號1所示的氨基酸序列的二肽合成用蛋白質(zhì);[2]由在序列號1所示的氨基酸序列中,缺失、取代或添加了1個以上的氨基酸的氨基酸序列組成,且具有合成式(I)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸);[3]由與序列號1所示的氨基酸序列具有65%以上同源性的氨基酸序列組成、并且具有合成式(I)所示二肽的活性的二肽合成用蛋白質(zhì)。
3.下述[1]~[3]中的任一項記載的DNA(不過,除了序列號3所示的堿基序列組成的DNA之外)[1]編碼權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的DNA;[2]具有序列號4所示的堿基序列的DNA;[3]和具有與序列號4所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有合成式(I)所示二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNAR1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)。
4.含有權(quán)利要求3記載的DNA的重組DNA。
5.具有權(quán)利要求4記載的重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
6.上述權(quán)利要求5記載的轉(zhuǎn)化體,其中該轉(zhuǎn)化體是以微生物作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體。
7.權(quán)利要求6記載的轉(zhuǎn)化體,其中所述微生物是屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物。
8.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的制備方法,是將權(quán)利要求5~7任一項中記載的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),在上述培養(yǎng)物中生成、積累權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì),從該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的制備方法,是將具有產(chǎn)生權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的能力的微生物在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)物中生成、累積該蛋白質(zhì),從該培養(yǎng)物收集該蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求9記載的制備方法,所述微生物是屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物。
11.權(quán)利要求10記載的制備方法,其中屬于鏈霉菌屬的微生物是具有產(chǎn)生白諾氏菌素能力的屬于鏈霉菌屬的微生物。
12.權(quán)利要求11記載的制備方法,所述具有產(chǎn)生白諾氏菌素能力的屬于鏈霉菌屬的微生物是白諾氏鏈霉菌(Streptomyces alborus)或諾爾斯氏鏈霉菌(Streptomyces noursei)。
13.二肽的制備方法,使權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)、一種以上的氨基酸和ATP存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中使式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示二肽生成、積累,從該介質(zhì)收集該二肽。
14.二肽的制備方法,將從下述[1]~[3]中選出的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源,使該酶源、一種以上的氨基酸存在于水性介質(zhì)中,在該介質(zhì)中使式(I)R1-R2(I)(式中,R1和R2表示相同或不同的氨基酸)所示直鏈二肽生成、積累,從該介質(zhì)收集該二肽,其中所述[1]-[3]為[1]權(quán)利要求5~7中任一項記載的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物;[2]具有產(chǎn)生權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物;[3]具有產(chǎn)生權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物。
15.權(quán)利要求14記載的制備方法,所述具有產(chǎn)生權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)的能力的微生物是屬于鏈霉菌屬的微生物。
16.權(quán)利要求14記載的制備方法,所述具有產(chǎn)生權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物是屬于鏈霉菌屬的微生物。
17.權(quán)利要求15或16記載的制備方法,所述屬于鏈霉菌屬的微生物是具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物。
18.權(quán)利要求17記載的制備方法,所述具有產(chǎn)生白諾氏菌素的能力的屬于鏈霉菌屬的微生物是白諾氏鏈霉菌或諾爾斯氏鏈霉菌。
19.權(quán)利要求14記載的制備方法,具有產(chǎn)生權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)的能力的微生物,是以編碼權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物。
20.權(quán)利要求19記載的制備方法,以編碼權(quán)利要求2記載的二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化的微生物是屬于埃希氏菌屬的微生物。
21.權(quán)利要求14~20中任一項記載的制備方法,其特征在于培養(yǎng)物的處理物是培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、離心分離培養(yǎng)物得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的凍干物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械性磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的蛋白質(zhì)分級物、該菌體的固定化物或由該菌體抽提得到的酶標(biāo)準(zhǔn)品。
22.權(quán)利要求13~21中任一項記載的制備方法,其中,一種以上的氨基酸是L型或D型氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或它們的衍生物。
23.權(quán)利要求13~22中任一項記載的制備方法,其中二肽是式(II)所示的二肽R3-R4(II)(式中,R3和R4表示相同或不同的L型或D型氨基酸、甘氨酸、β-丙氨酸或它們的衍生物)。
24.權(quán)利要求22或23記載的制備方法,其中L型或D型氨基酸選自丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、α-氨基丁酸、氮絲氨酸、茶氨酸、4-羥基脯氨酸、3-羥基脯氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸以及6-重氮基-5-氧代正亮氨酸。
全文摘要
按照本發(fā)明,可以提供具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì);編碼具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的DNA;含該DNA的重組體DNA、帶有該重組體DNA的轉(zhuǎn)化體;具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)的制備方法;使用具有二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的二肽的酶合成法;將具有產(chǎn)生二肽合成活性的蛋白質(zhì)或二肽合成用蛋白質(zhì)的能力微生物或轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物等用作酶源的二肽的制備方法。
文檔編號C12N1/21GK1946847SQ20058001249
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者橋本信一, 田畑和彥, 野口文子, 足立雄悟 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社