技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化合物的新用途，具體涉及二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的新用途。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是一種全球性的傳染性極強(qiáng)的疾病，全世界有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年由于結(jié)核病導(dǎo)致的死亡人數(shù)達(dá)百萬(wàn)以上（Andreu N, Fletcher T, Krishnan N, Wiles S, Robertson BD.. J Antimicrob Chemother. 2012, 67: 404–414）。由于結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)速度非常緩慢，在常用的羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養(yǎng)基中一般需要28天的時(shí)間才能形成肉眼可見(jiàn)的菌落，這給結(jié)核病的診斷、分型鑒定及藥敏試驗(yàn)帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著多藥耐藥結(jié)核分支桿菌(MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核分支桿菌(XDR-TB)的大量出現(xiàn)（Espinal M A, Laszlo A, Simonsen L, et al. N Engl J Med. 2001,344:1294-1303），結(jié)核病的快速診斷和藥敏檢測(cè)顯得尤為重要，這樣可以更好的管理和治療結(jié)核病人，減少耐藥菌的傳播。盡管現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，但是結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)在結(jié)核病的診斷、流行病學(xué)指標(biāo)、結(jié)核菌的分型鑒定、藥敏試驗(yàn)、結(jié)核病藥物的研究等方面依然有著不可替代的作用。因此，開(kāi)發(fā)新的促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基對(duì)結(jié)核病的診斷、分型鑒定及藥敏試驗(yàn)具有非常重要的意義。

目前，結(jié)核分枝桿菌病的培養(yǎng)基主要有固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩種。固體培養(yǎng)基主要有改良羅氏（Lownstein-Jenson，L-J）培養(yǎng)基、小川辰次（Tatsujiogawa）雞蛋培養(yǎng)基和美國(guó)Becton-Diskinson（BD）公司研制的Middle brook 7H10、7H11等瓊脂培養(yǎng)基等。液體培養(yǎng)基主要蘇通（Sauton）培養(yǎng)基和美國(guó)BD公司的Middle brook 7H9、7H12等液體培養(yǎng)基。其中羅氏培養(yǎng)基和小川辰次雞蛋培養(yǎng)基是以雞卵液為關(guān)鍵成分，在制備培養(yǎng)基時(shí)，要充分考慮雞卵液的新鮮程度以及營(yíng)養(yǎng)成分是否受到破壞，制備培養(yǎng)基的過(guò)程繁多而復(fù)雜，而且結(jié)核分枝桿菌在其上的生長(zhǎng)速度要明顯慢于BD公司的Middle brook 7H10和7H11固體培養(yǎng)基。以蘇通培養(yǎng)基和BD公司的 Middle brook系列培養(yǎng)基主要是由瓊脂、無(wú)機(jī)鹽類及一系列的有機(jī)化合物等成分組成（Saito H. Laboratory media for the cultivation of tubercle bacillus. Kekkaku,1998,73(5):329-337.WHO. Laboratory services in tuberculosis control,1998.）。目前，美國(guó)BD公司的Middle brook系列培養(yǎng)基是國(guó)外最常用于結(jié)核桿菌研究、診斷和藥敏檢測(cè)的培養(yǎng)基，其培養(yǎng)時(shí)間短，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。國(guó)內(nèi)的醫(yī)院及各級(jí)疾病預(yù)防控制中心主要還是采用傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行結(jié)核菌的分離培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)培養(yǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，通過(guò)研究結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)及復(fù)蘇機(jī)制，從結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra的培養(yǎng)液中，通過(guò)色譜分離得到具有促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌快速生長(zhǎng)活性的化合物二肽meso-DAP-D-Ala（內(nèi)消旋二氨基庚二酸-D-丙氨酸）及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala（L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-賴氨酸- D-丙氨酸）兩種化合物。迄今為止，尚未見(jiàn)到有關(guān)上述兩種肽類化合物有促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌快速生長(zhǎng)的報(bào)道，也未見(jiàn)到以這兩種肽類化合物中的任意一種或組合物為組分的結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)分枝桿菌培養(yǎng)基上市，并依此提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala兩種肽類化合物的新用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制備結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基或卡介苗分枝桿菌培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制備結(jié)核菌診斷培養(yǎng)基、結(jié)核菌分離傳代培養(yǎng)基或結(jié)核病藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的有效濃度為0.1-10μmol/mL。

本發(fā)明所述的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala是兩種白色粉末狀物質(zhì)，無(wú)氣味,易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。其中二肽meso-DAP-D-Ala分子式為C₁₀H₁₉N₃O₅，分子量261；四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala分子式為C₁₇H₃₁N₅O₇，分子量417。這2種肽類化合物最初由結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra的培養(yǎng)液中分離純化得到，并由上海楚肽生物科技有限公司化學(xué)合成驗(yàn)證，試驗(yàn)所用肽類樣品均由上海楚肽生物科技有限公司合成，兩種樣品的純度均為96.5%。

為了獲得二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)活性，本發(fā)明采取了以下技術(shù)路線與步驟：

1、結(jié)核分枝桿菌7H9-S液體培養(yǎng)基的配制：所述的7H9-S培養(yǎng)基組成為0.47% 7H9（購(gòu)自美國(guó)BD公司，貨號(hào)271310），0.2%甘油，0.05%吐溫-80,0.085%氯化鈉，0.5%小牛血清組分Ⅴ（Roche公司，貨號(hào)10735094001），0.2%葡萄糖，0.003%過(guò)氧化氫酶（Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)C9322-1G）。配制時(shí)先稱取0.47克7H9粉末，0.2ml甘油，0.05ml吐溫-80，加入90ml超純水后于121℃高壓滅菌10分鐘，然后加入用0.22um無(wú)菌濾膜除菌的ADC營(yíng)養(yǎng)液10ml（ADC的配制如下：稱取0.85克氯化鈉，5克小牛血清組分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克過(guò)氧化氫酶，加入100ml超純水充分溶解，用0.22um無(wú)菌濾膜除菌后，4℃冰箱保存）。

2、二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala溶液的配制：

用電子天平分別稱取一定量的上述2種化合物放入2支試管中，分別用無(wú)菌水溶解，濃度均為50微摩爾/毫升，分別用0.22um的無(wú)菌濾膜除菌后裝入2支無(wú)菌離心管中，作為促生長(zhǎng)試驗(yàn)用的母液放入4℃冰箱保存。

3、促生長(zhǎng)活性試驗(yàn)用的培養(yǎng)基配制：在配制好的無(wú)菌7H9-S培養(yǎng)基中分別加入上述2種化合物母液，每個(gè)化合物分別配置4個(gè)濃度梯度：即10微摩爾/毫升，5微摩爾/毫升，1微摩爾/毫升，0.1微摩爾/毫升，對(duì)照組加入相等體積的無(wú)菌水。

4、對(duì)結(jié)核分枝桿菌的促生長(zhǎng)試驗(yàn)：首先從-80℃冰箱取出用甘油保存的結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra,菌液濃度為1.0×10⁸CUF/ml，先4℃放置30分鐘后，取100ul菌液分別接種于裝有5ml的7H9-S對(duì)照培養(yǎng)基及試驗(yàn)組培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用酶標(biāo)儀于OD600下檢測(cè)各試驗(yàn)組的H37Ra菌密度，并對(duì)各試驗(yàn)組于7H10（購(gòu)自美國(guó)BD公司）平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。研究結(jié)果表明，上述2種化合物在0.1微摩爾/毫升—10微摩爾/毫升濃度范圍內(nèi)，促生長(zhǎng)活性非常明顯，能使結(jié)核分枝桿菌菌濃度增加5-10倍，在液體培養(yǎng)基中菌群密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，在7H10固體培養(yǎng)基（7H10購(gòu)自美國(guó)BD公司，貨號(hào)262710）上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落比空白對(duì)照組提前1周，菌斑明顯大于空白對(duì)照組。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala作為結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)因子，在開(kāi)發(fā)新型結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)基中具有很好的應(yīng)用前景，可用于結(jié)核病的快速診斷、分型鑒定及藥敏檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明用到的式（Ⅰ）-式（Ⅱ）的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為7H10固體平板培養(yǎng)基上促生長(zhǎng)試驗(yàn)空白對(duì)照組示意圖。

圖3為7H10固體平板培養(yǎng)基上促生長(zhǎng)試驗(yàn)試驗(yàn)組示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

對(duì)照培養(yǎng)基7H9-S液體培養(yǎng)基的配制：

電子天平上準(zhǔn)確稱取0.47克7H9，0.2ml甘油，0.05ml吐溫-80，加入90ml超純水后于121℃高壓滅菌10分鐘，冷卻至室溫，然后加入10ml的ADC營(yíng)養(yǎng)液，即為配制好的7H9-S液體培養(yǎng)基。其中ADC營(yíng)養(yǎng)液的配制如下：稱取0.85克氯化鈉，5克小牛血清組分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克過(guò)氧化氫酶，加入100ml超純水充分溶解后，用0.22um無(wú)菌濾膜除菌，得到配制好的ADC營(yíng)養(yǎng)液。

實(shí)施例2：

活性試驗(yàn)組培養(yǎng)基的配制：

用電子天平分別準(zhǔn)確稱取一定量的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala兩種化合物放入2支試管（試驗(yàn)所用樣品均購(gòu)自于生工生物工程上海有限公司，2種樣品的純度均為96.5%），分別用無(wú)菌水溶解，濃度均為50微摩爾/毫升，分別用0.22um的無(wú)菌濾膜除菌后裝入2支無(wú)菌離心管中備用。然后將配制好的上述兩種化合物溶液，用配制好的7H9-S液體培養(yǎng)基分別稀釋至10微摩爾/毫升，5微摩爾/毫升，1微摩爾/毫升，0.1微摩爾/毫升共4個(gè)濃度梯度。

實(shí)施例3：

促生長(zhǎng)活性測(cè)定：

從-80℃低溫冰箱中取出用甘油保存的結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra, 先4℃放置30分鐘后,然后用無(wú)菌水稀釋至菌液濃度為1.0×10⁸CUF/ml，各取100ul分別接種于裝有5ml的7H9-S對(duì)照培養(yǎng)基及各試驗(yàn)組培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用酶標(biāo)儀于OD600nm下讀取吸光度值，從而檢測(cè)各試驗(yàn)組的H37Ra菌株的生長(zhǎng)密度, 并對(duì)各試驗(yàn)組于7H10（購(gòu)自美國(guó)BD公司，貨號(hào)262710）平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（其中結(jié)核菌減毒株H37Ra由美國(guó)約翰-霍普金斯大學(xué)分子微生物學(xué)與免疫學(xué)研究所張穎教授提供給本實(shí)驗(yàn)室）。結(jié)果表明，上述2種化合物在0.1微摩爾/毫升—10微摩爾/毫升濃度范圍內(nèi)，促生長(zhǎng)活性非常顯著，能使結(jié)核分枝桿菌菌濃度增加5-10倍，其中二肽meso-DAP-D-Ala組的促生長(zhǎng)活性較強(qiáng)，兩種肽類化合物對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra的促生長(zhǎng)作用見(jiàn)表1。

表1

同時(shí)，用7H10固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行促生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明加入二肽和四肽后的試驗(yàn)組出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落時(shí)間為18天，空白對(duì)照組出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落時(shí)間為23天，試驗(yàn)組固體培養(yǎng)基出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落比空白對(duì)照組出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落要提前5天，且試驗(yàn)組菌斑明顯大于空白對(duì)照組。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18天后的結(jié)果見(jiàn)圖2（空白對(duì)照組）、圖3(加入二肽、四肽后的試驗(yàn)組）。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。