專利名稱：用于檢測(cè)鍵斷裂的生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)多種化學(xué)和生物試劑的生物傳感器，尤其涉及用于利用分開(kāi)的檢測(cè)器和振蕩器檢測(cè)多種化學(xué)和生物試劑的生物傳感器。
背景技術(shù)：
在目前的新西蘭醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，當(dāng)病人生病時(shí)，要獲取拭子并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行分析。例如為了確定病人的流感菌株，要用純化的抗體將適當(dāng)流體的等分試樣培養(yǎng)成流感病毒表面上的特征分子或標(biāo)識(shí)物。借助于放大試劑和二次抗體(其用酶或放射性同位素做標(biāo)記)可確定病毒的濃度。這種分析雖然非常靈敏，最少需要幾個(gè)小時(shí)，但是常常需要長(zhǎng)得多的時(shí)間。因此，在可獲得病人的精確診斷之前，可能需要幾個(gè)小時(shí)甚至是1天的時(shí)間。如果需要將樣品從偏遠(yuǎn)地區(qū)運(yùn)送到城市實(shí)驗(yàn)室，則可能要延遲更長(zhǎng)的時(shí)間。
醫(yī)學(xué)診斷試驗(yàn)利用了兩個(gè)生物分子之間的識(shí)別和結(jié)合。但是，使用免疫反應(yīng)如抗體-抗原結(jié)合的檢測(cè)方法可能具有更大的應(yīng)用，只要可產(chǎn)生特異性結(jié)合伴侶來(lái)識(shí)別目標(biāo)分子(如蛋白質(zhì))。
醫(yī)學(xué)技術(shù)通常是將分子之一連接(“固定”)到一個(gè)表面上，然后使其暴露于包含被分析物的液體中，如果存在的話，該被分析物通過(guò)其結(jié)合伴侶選擇性地結(jié)合到該表面上。
用于檢測(cè)發(fā)生結(jié)合以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目的方法有幾種。被分析物可被用來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性地代替預(yù)結(jié)合但已標(biāo)記的顆粒，例如熒光標(biāo)記的那些，并且通過(guò)熒光變化來(lái)傳送檢測(cè)信號(hào)。常用的分析是基于酶的ELISA方法，該方法盡管靈敏，但是通常比在幾分鐘內(nèi)發(fā)生的基本結(jié)合方法要慢。在這兩種方法中，需要特異改性的標(biāo)記分子用于檢測(cè)。
一種能夠檢測(cè)表面結(jié)合變化而不需要標(biāo)記的化學(xué)品的方法利用了表面等離子體共振的光學(xué)現(xiàn)象。這種方法使用隱失波檢測(cè)例如載玻片上的液體界面，并且具有在快速反應(yīng)時(shí)間的情況下檢測(cè)生物表面結(jié)合變化的靈敏度。
所有的親合結(jié)合方法均受到非特異性吸附的損害，通過(guò)該吸附過(guò)程，不是所要尋找的那些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)本身連接到了表面的除準(zhǔn)備的“捕獲”分子之外的位點(diǎn)上。這是關(guān)于檢測(cè)閾的限制因素。
一種回避非特異性結(jié)合的方法涉及到結(jié)合至石英晶體微天平的生物大分子。使生物大分子與該生物大分子要結(jié)合的目標(biāo)物質(zhì)接觸。然后石英晶體微天平以逐漸增加的振幅振蕩，直到目標(biāo)物質(zhì)與生物大分子之間的鍵斷裂。在振蕩過(guò)程中，非特異性結(jié)合的物質(zhì)將在目標(biāo)物質(zhì)之前被除去。檢測(cè)鍵斷裂，并且因此證實(shí)存在目標(biāo)物質(zhì)。如果目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)取決于石英共振器的高Q，則預(yù)計(jì)靈敏度將由于在液體中的操作而降低，這是由于已知要產(chǎn)生的高粘彈性阻尼而造成的。液體相容系統(tǒng)是重要的，因?yàn)樗巧锎蠓肿拥淖匀画h(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有分開(kāi)的振蕩器和斷裂檢測(cè)器的生物傳感器，或者是至少為公眾提供一種有用的選擇。
廣義來(lái)說(shuō)，一方面本發(fā)明包括一種生物傳感器，該生物傳感器包括在其上結(jié)合有生物大分子的表面、鍵斷裂檢測(cè)器和振蕩器，其中該表面和生物大分子被浸在液體中，該鍵斷裂檢測(cè)器與該表面相連并且設(shè)置為檢測(cè)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵的斷裂，該振蕩器與該液體相連且與該表面隔開(kāi)并且設(shè)置為在該液體中產(chǎn)生波，以使生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該檢測(cè)器是表面等離子體共振檢測(cè)器，當(dāng)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂時(shí)，該檢測(cè)器檢測(cè)具有最小反射比的反射光的角度變化。在另一實(shí)施方案中，該檢測(cè)器檢測(cè)當(dāng)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生的聲發(fā)射。在另一實(shí)施方案中，可以使用任何其它合適的檢測(cè)器。
振蕩器可以是任何適合于在液體中提供振蕩運(yùn)動(dòng)(“波”)的裝置。該振蕩器可以是聲振蕩器、壓電裝置、機(jī)械共振器或微懸臂梁。該液體也可通過(guò)電泳運(yùn)動(dòng)或者通過(guò)磁流體動(dòng)力學(xué)移動(dòng)。優(yōu)選地，波在頻率上為超聲波。
振蕩器可設(shè)置為提供預(yù)定頻率的波，或可設(shè)置為提供一定頻段的波。波的振幅可以是恒定的或者可以是變化的，例如波的振幅可以按照恒定的速度增加。
優(yōu)選地，提供自組裝單層以將生物大分子結(jié)合到表面上。
優(yōu)選地，該表面涂覆有金或銀。可供選擇地，任何合適的金屬可被用作表面或用作表面上的涂層。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多于一個(gè)表面提供有生物大分子，這些生物大分子結(jié)合到在每個(gè)表面上提供的不同目標(biāo)物質(zhì)上。
廣義來(lái)說(shuō)，另一方面，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟提供生物傳感器，該生物傳感器包括至少一個(gè)在其上結(jié)合有生物大分子的表面、與該表面相連并設(shè)置為檢測(cè)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵的斷裂的鍵斷裂檢測(cè)器、以及與該表面隔開(kāi)并設(shè)置為產(chǎn)生波以使生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂的振蕩器；使生物傳感器與可能含有目標(biāo)物質(zhì)的試驗(yàn)流體接觸；使用該振蕩器提供指向該表面的波并且使用該檢測(cè)器檢測(cè)是否有任何鍵斷裂并比較鍵斷裂時(shí)振蕩器的參數(shù)與儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，并且其中在生物傳感器的操作過(guò)程中，生物傳感器的該表面和振蕩器被浸在液體中。


下面將僅以舉例而并不意圖限制的方式，并參考以下附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，在附圖中圖1A表示本發(fā)明生物傳感器的傳感器表面；圖1B表示在接觸試驗(yàn)流體之后的本發(fā)明生物傳感器的傳感器表面；
圖1C表示在振蕩過(guò)程中，當(dāng)非特異性結(jié)合分子與生物大分子分離時(shí)，本發(fā)明生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案；圖1D表示在為使傳感器表面上的生物大分子與結(jié)合到生物大分子上的分子之間的鍵斷裂而進(jìn)行振蕩的過(guò)程中，本發(fā)明生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案；圖2表示生物大分子結(jié)合到生物傳感器上；圖3是本發(fā)明生物傳感器的方框圖；圖4是本發(fā)明生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；圖5表示生物素-PEO3-胺的分子結(jié)構(gòu)；圖6表示當(dāng)自組裝單層在基底上形成并被緩沖時(shí)，SPR檢測(cè)器的折射率的變化；和圖7表示當(dāng)目標(biāo)物種(target species)結(jié)合到自組裝單層上并且隨后目標(biāo)物種與自組裝單層之間的鍵斷裂時(shí)，SPR檢測(cè)器的折射率的變化。
具體實(shí)施例方式
圖1A表示本發(fā)明生物傳感器優(yōu)選形式的傳感器表面的橫截面。該傳感器表面包括基底4、傳感器表面金屬層1、自組裝單層2和生物大分子層3。
應(yīng)該理解，目標(biāo)物質(zhì)和生物大分子可顛倒過(guò)來(lái)。例如，生物大分子可為抗體，而目標(biāo)物質(zhì)為抗原，反之亦然。選擇生物大分子層3作為將與目標(biāo)物質(zhì)形成鍵的物質(zhì)。例如，如果目標(biāo)物質(zhì)為抗原，則生物大分子層3可以是抗體層。其它的例子包括使用毒素(例如河豚毒素、海藻毒素或短菌毒素)作為生物大分子層3來(lái)對(duì)鈉離子通道膜片段進(jìn)行測(cè)試，使用抑制劑(例如岡田酸、蛋白質(zhì)或金屬)作為生物大分子層3來(lái)對(duì)酶進(jìn)行測(cè)試，使用凝集素作為生物大分子層3來(lái)對(duì)細(xì)胞表面上的特定碳水化合物進(jìn)行測(cè)試，或者使用病毒作為生物大分子層3來(lái)對(duì)細(xì)胞表面上的受體物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試?？晒┻x擇地，生物大分子層3可包括核酸適體的層，以對(duì)特定配體進(jìn)行測(cè)試。另外可供選擇的實(shí)施方案涉及到使用低聚核苷酸作為生物大分子層3，以對(duì)互補(bǔ)RNA或DNA分子進(jìn)行測(cè)試。在更具體的實(shí)施方案中，生物大分子層3可以是抗體AA5H或B017，它們被用于分別檢測(cè)是否存在流感A和B病毒。
自組裝單層2形成傳感器表面1和生物大分子層3之間的層。該自組裝單層同時(shí)結(jié)合到傳感器表面金屬層1和生物大分子層3。自組裝單層的組成可取決于將結(jié)合到自組裝單層上的生物大分子層3。
傳感器表面金屬層1可以是在其上可形成自組裝單層的任何金屬層。通常，該金屬層由金形成。
基底4可由任何合適的材料形成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用表面等離子體共振來(lái)檢測(cè)鍵斷裂。在此實(shí)施方案中，基底可由玻璃或塑料形成。在此實(shí)施方案中，基底必須是透明的。
在圖1A中，樣品5所示在生物傳感器之上。樣品5包含目標(biāo)物質(zhì)分子6以及包括分子7的其它分子。分子7也將結(jié)合到生物大分子3上，但是與分子6相反，其不與生物大分子形成強(qiáng)鍵。
圖1B表示在接觸試驗(yàn)流體之后的生物傳感器的傳感器表面。該試驗(yàn)流體可包含或不包含目標(biāo)物質(zhì)，但是在所示的實(shí)例中包含目標(biāo)物質(zhì)。結(jié)合到傳感器表面的生物大分子針對(duì)其對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合選擇性來(lái)進(jìn)行選擇。當(dāng)試驗(yàn)流體接觸傳感器表面時(shí)，試驗(yàn)流體中存在的任何目標(biāo)物質(zhì)分子將與傳感器表面的生物大分子3結(jié)合。試驗(yàn)流體中存在的其它物質(zhì)或物種也可與生物大分子結(jié)合，但是(如果選擇最佳的生物大分子的話)其與生物大分子形成的鍵比目標(biāo)物質(zhì)的鍵要弱。
從圖1B可看出，當(dāng)在傳感器上提供樣品時(shí)，傳感器表面被浸在液體9中。液體9可以是水或任何其它適合用于傳感器的液體。液體9可流過(guò)傳感器表面。在其它實(shí)施方案中，該液體可不流過(guò)傳感器表面。振蕩器8也至少部分浸在液體中。振蕩器8可為聲振蕩器、壓電裝置、機(jī)械共振器或微懸臂梁。振蕩器8可通過(guò)電泳或通過(guò)磁流體動(dòng)力學(xué)使液體振蕩或使液體運(yùn)動(dòng)。
在試驗(yàn)流體與傳感器表面接觸之后，如圖1C所示，由振蕩器8產(chǎn)生波。來(lái)自振蕩器的波的幅度和頻率可以改變。如圖1C所示，當(dāng)所述波施加到傳感器表面時(shí)，沒(méi)有結(jié)合到傳感器表面的物質(zhì)從傳感器表面抖落。最后，如圖1D所示，生物大分子與結(jié)合到生物大分子上的來(lái)自試驗(yàn)流體的物質(zhì)之間的鍵將斷裂。圖1D也示出了當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)與生物傳感器分子之間的鍵斷裂時(shí)，通過(guò)表面等離子體共振將檢測(cè)到的共振角的變化。
“目標(biāo)”顆粒與表面之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)提供了鍵斷裂能。這些顆粒是通過(guò)液體運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)它們而進(jìn)行振蕩的，而并不是使該表面振蕩。在優(yōu)選實(shí)施方案中，鍵斷裂是通過(guò)表面等離子體共振(SPR)角隨著超聲波振幅增加時(shí)的階躍來(lái)檢測(cè)的。表面等離子體共振是一項(xiàng)通過(guò)與來(lái)自外部源的光的反射相關(guān)的隱失波來(lái)探測(cè)液體界面的技術(shù)，并在狹窄限定的共振角產(chǎn)生最小強(qiáng)度。
鍵斷裂時(shí)的振幅和頻率將取決于形成的鍵類型和結(jié)合到傳感器表面的物質(zhì)。鍵斷裂將產(chǎn)生表面性質(zhì)的變化，該變化可被檢測(cè)并被轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的。發(fā)生鍵斷裂時(shí)的波的振幅和/或頻率隨后可與已知的對(duì)于試驗(yàn)流體的鍵斷裂的振幅和/或頻率相比較，由此可確定試驗(yàn)流體中是否存在目標(biāo)物質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述波為超聲波。
振蕩器可以為任何合適的裝置。例如，振蕩器可為機(jī)械共振器、聲振蕩器、壓電裝置或微懸臂梁。當(dāng)生物傳感器被浸在液體中時(shí)，振蕩器產(chǎn)生使液體振動(dòng)的波，該液體進(jìn)而使生物大分子和結(jié)合到生物大分子上的物質(zhì)振動(dòng)。通過(guò)振動(dòng)在傳感器表面周圍的液體介質(zhì)，與在振動(dòng)傳感器表面時(shí)發(fā)生的阻尼相關(guān)的問(wèn)題得以克服。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述波指向傳感器表面。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)表面等離子體共振來(lái)檢測(cè)鍵斷裂。表面等離子體共振技術(shù)要求光從與結(jié)合到生物大分子的面相對(duì)的面指向傳感器表面。對(duì)于給定波長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，反射光的強(qiáng)度在特定角時(shí)為最小。當(dāng)傳感器表面性質(zhì)變化(例如由鍵斷裂引起的變化)時(shí)，最小反射比的角度也變化。這種變化被檢測(cè)器檢測(cè)到，表示傳感器表面上物質(zhì)的變化。在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)檢測(cè)由鍵斷裂引起的聲發(fā)射來(lái)檢測(cè)鍵斷裂。
當(dāng)使用表面等離子體共振來(lái)檢測(cè)鍵斷裂時(shí)，基底4優(yōu)選為玻璃或塑料。這些材料是有用的，因?yàn)榕c聲發(fā)射檢測(cè)不同，它們不需要電接觸，并且適合于多次試驗(yàn)和小樣品的微流體處理。這可產(chǎn)生一次性芯片。
在使用中，當(dāng)在表面上形成生物大分子并且目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合到生物大分子上時(shí)，表面等離子體共振檢測(cè)器將顯示對(duì)應(yīng)于特異性和非特異性連接的共振角的偏移。當(dāng)產(chǎn)生波并且結(jié)合到生物大分子上的物質(zhì)振動(dòng)時(shí)，表面等離子體共振檢測(cè)器將顯示共振角的偏移，由于非特異性結(jié)合的分子的脫離，一個(gè)偏移預(yù)計(jì)是在寬的激發(fā)范圍的，而由于目標(biāo)物質(zhì)與生物大分子之間的鍵的斷裂，另一個(gè)偏移則要窄得多。
圖2表示一個(gè)用于通過(guò)使用自組裝單層將抗體作為生物大分子層結(jié)合到傳感器表面的步驟。該自組裝單層是11-巰基-1-十一醇(MUOH)和16-巰基-1-十六酸(MHA)的混合單層。這兩種化學(xué)物質(zhì)都通過(guò)它們的硫原子結(jié)合到傳感器表面的金層上，以分別留下抗體可結(jié)合到其上的自由醇和酸基團(tuán)。然后使用N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)活化的羥基基團(tuán)作為催化劑，以將生物大分子結(jié)合到自組裝單層上。
在圖2中，傳感器表面和自組裝單層本體用層20表示。11-巰基-1-十一醇的醇基團(tuán)和16-巰基-1-十六酸的酸基團(tuán)分別用21和22表示。N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)用23表示。該基團(tuán)暫時(shí)結(jié)合到21和/或22，以形成活化的羰基中心。當(dāng)生物大分子如抗體或蛋白質(zhì)24存在時(shí)，它反應(yīng)產(chǎn)生肽鍵，從而將生物大分子結(jié)合到自組裝單層上，并由此結(jié)合到傳感器表面上?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)使用其它合適的活化劑代替N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)。
如圖1所示，傳感器表面的頂層是金，以能夠使自組裝單層結(jié)合到傳感器表面上。在可供選擇的實(shí)施方案中，傳感器表面的頂層是能夠結(jié)合自組裝單層的另一種金屬。例如，傳感器表面的頂層可為銀。傳感器表面可包括另外的一層或多層，這些層可形成檢測(cè)器的一部分。例如，如果使用表面等離子體共振檢測(cè)器，則傳感器表面可以是沉積在玻璃或折射率高于該液體折射率的一些其它透明材料上的金屬薄層。
將自組裝單層結(jié)合到傳感器表面上的技術(shù)有幾種。
羧酸端基使得能夠利用生物大分子進(jìn)行自組裝單層的衍生作用。這個(gè)過(guò)程利用了光活化的親合微圖案化技術(shù)，該技術(shù)使用通過(guò)光掩模的UV光的去保護(hù)。這個(gè)過(guò)程可用來(lái)制備在局部代謝鏈中結(jié)合的多酶支架，其中酶A將其產(chǎn)物傳遞給鄰接的酶B，如此等等。
另一種用于形成自組裝單層的技術(shù)是蘸筆納米平版印刷方法。此技術(shù)可用來(lái)構(gòu)造小至100-350nm的特征。此技術(shù)涉及到用“墨水”如11-巰基-1-十一醇或16-巰基-1-十六酸涂覆原子力顯微鏡尖端。在將11-巰基-1-十一醇或16-巰基-1-十六酸的點(diǎn)或線浸在蛋白質(zhì)溶液中之后，單層或蛋白質(zhì)粘著到傳感器表面的被涂覆區(qū)域上。
自組裝單層和生物大分子可以是自組裝類脂膜。這些膜使用磷脂囊，該磷脂囊表現(xiàn)出融入和組裝到二氧化硅和幾種其它基底材料上的連續(xù)單個(gè)雙分子膜中的自然傾向性。自組裝類脂膜的優(yōu)點(diǎn)是在載體和生物大分子之間僅有由于范德華力、偶極-偶極相互作用或氫鍵引起的弱相互作用。結(jié)合平衡的可逆性質(zhì)由于其對(duì)pH、離子強(qiáng)度、溫度等的變化的敏感性而顯得重要。結(jié)合平衡的可逆性質(zhì)使得能夠自修復(fù)潛在的缺陷。自組裝類脂膜是有用的，因?yàn)樗鼈兡M生物膜，甚至在濕表面上表現(xiàn)出側(cè)向流動(dòng)性。
如圖2所示的在傳感器表面和生物大分子之間形成自組裝單層并且將生物大分子結(jié)合到自組裝單層上的主要優(yōu)點(diǎn)在于偶合步驟可以在中性緩沖液中進(jìn)行，并且所得不帶電荷的氨基甲酸酯鍵是非常穩(wěn)定的，因此使結(jié)合的蛋白質(zhì)的泄漏最小化。適當(dāng)選擇固定方法是重要的，以便使生物大分子在傳感器表面上保持活性、穩(wěn)定性和特異性。
作為自組裝單層的載體，金表面的可供選擇的替代方案可以是硅或玻璃。對(duì)于這些表面來(lái)說(shuō)，可使用硅烷-偶合劑如HO(CH2)17SiCl3或HO(CH2)17Si(OCH3)3。
圖3示出了本發(fā)明生物傳感器的框圖。該生物傳感器包括傳感器表面40、電源41、電源控制器42、鍵斷裂傳感器43、振蕩器45以及儲(chǔ)存裝置和比較器44。
在使用時(shí)，使試驗(yàn)流體與傳感器表面40接觸。該傳感器表面包括被選擇來(lái)結(jié)合到目標(biāo)物質(zhì)的生物大分子層。如果目標(biāo)物質(zhì)存在于試驗(yàn)流體中，則它將結(jié)合到生物大分子上。試驗(yàn)流體中存在的其它物質(zhì)也可結(jié)合到生物大分子上。但是，選擇能夠結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)并且盡可能少地結(jié)合其它物質(zhì)的生物大分子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，至少傳感器表面和振蕩器被浸在液體中。在可供選擇的實(shí)施方案中，傳感器表面和振蕩器不浸在液體中。
在使傳感器表面與試驗(yàn)流體接觸之后(如圖1C所示)，來(lái)自振蕩器45的具有變化頻率和/或振幅的波被指向該表面。電源41向振蕩器45供電。電源41可由電源控制器42控制?？晒┻x擇地，電源控制器42可設(shè)置在電源41中。電源控制器42控制由電源41向振蕩器45提供的功率。當(dāng)向振蕩器45供應(yīng)電壓時(shí)和當(dāng)不再向振蕩器45供應(yīng)電壓時(shí)，電源控制器42可改變波的頻率和/或振幅變化的速度。
當(dāng)波被指向該表面時(shí)，鍵斷裂傳感器43檢測(cè)生物大分子與結(jié)合到生物大分子上的物質(zhì)之間的鍵何時(shí)斷裂。隨著波的頻率和/或振幅的增加，所述波施加在結(jié)合到生物大分子上的物質(zhì)上的力也增加，并促成鍵斷裂。當(dāng)鍵斷裂傳感器上的生物大分子與結(jié)合到生物大分子上的物質(zhì)之間的鍵斷裂時(shí)，則產(chǎn)生表面等離子體共振的階躍。在另外的實(shí)施方案中，鍵斷裂傳感器43是壓電基底，以使得鍵斷裂產(chǎn)生被轉(zhuǎn)換成可檢測(cè)電壓的聲信號(hào)。
結(jié)合到傳感器表面的生物大分子上的每種物質(zhì)將在不同的頻率和/或振幅下斷裂，并且如果不止一種的不同物質(zhì)結(jié)合到傳感器表面的生物大分子上，則鍵斷裂傳感器43可檢測(cè)到不止一次的斷裂結(jié)果。
鍵斷裂傳感器43將鍵斷裂的指示傳遞至儲(chǔ)存裝置和比較器44。該指示可為電壓水平指示或任何其它合適的指示。該儲(chǔ)存裝置和比較器也從電源41接收來(lái)自振蕩器45的波的頻率和/或振幅的指示，在該頻率和/或振幅下發(fā)生鍵斷裂。然后該儲(chǔ)存裝置和比較器比較斷裂指示器和發(fā)生斷裂時(shí)波的頻率和/或振幅與儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)。如果斷裂指示器和電壓與關(guān)于目標(biāo)物質(zhì)的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)，則該儲(chǔ)存裝置和比較器指示存在目標(biāo)物質(zhì)。這種指示可通過(guò)監(jiān)視器或通過(guò)音頻指示。
實(shí)施例圖5表示使用SPR裝置檢測(cè)鍵斷裂的生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案的實(shí)施例。該生物傳感器包括振蕩源50、延遲線51、流體通道52、表面53、反射層54、入射光束55和反射光束56。還包括光檢測(cè)器(未示出)，其檢測(cè)反射光束56的角度變化。在此實(shí)施例中，振蕩器50是可連接至波形發(fā)生器的10MHz轉(zhuǎn)換器。
本實(shí)施例同時(shí)示出了表面固定和鍵斷裂掃描。這些是通過(guò)將SPR檢測(cè)和聲波形感應(yīng)這二者結(jié)合到薄層流動(dòng)池中來(lái)原位監(jiān)視的。
在本實(shí)施例中為金表面的表面53提供了在其上可形成自組裝單層的表面。在本實(shí)施例中，將5mg生物素-PEO3-胺溶于250ml的0.1M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液(pH 7.4)中。將胺和PBS溶液以20ml/min的流速?zèng)_過(guò)裸露的金表面53。圖5示出了生物素-PEO3-胺的分子結(jié)構(gòu)。如圖6所示，用SPR檢測(cè)器監(jiān)視生物素-PEO3-胺在金表面53上的固定。從圖6可看出，直到剛過(guò)3000秒之后的時(shí)間為止，SPR檢測(cè)器檢測(cè)到的折射率一直都表現(xiàn)出非常小的變化，并且在本圖中在施加生物素-PEO3-胺溶液的位置用“a”標(biāo)記。在該施加時(shí)間的過(guò)程中(其一直到圖6中標(biāo)記為“b”的點(diǎn))，SPR檢測(cè)器檢測(cè)到的折射率發(fā)生變化。SPR檢測(cè)器檢測(cè)到的折射率的初始變化是快速的，并且這種變化朝著點(diǎn)“b”變小，表明盡可能多的生物素-PEO3-胺已結(jié)合到金上。
在圖6所示的點(diǎn)b處，加入0.1M PBS溶液，以沖洗掉松散結(jié)合的生物素-PEO3-胺。這在圖6中被示出，在點(diǎn)b之后，折射率隨著松散的胺從生物素化的自組裝單層(SAM)上被洗去而發(fā)生變化。伯胺基團(tuán)非常強(qiáng)地結(jié)合到金表面上，以產(chǎn)生生物素化的SAM。圖6上標(biāo)記為“c”的區(qū)域表示在緩沖溶液已通過(guò)生物傳感器之后的新基線折射率。
將10μg抗生蛋白鏈菌素溶于100ml 0.1M PBS溶液(pH 7.4)中的溶液以20ml/min的速度沖過(guò)生物傳感器。在沖洗過(guò)程中，抗生蛋白鏈菌素溶液結(jié)合到生物素化的SAM上。該沖洗過(guò)程在圖7上標(biāo)記為“a”的位置處開(kāi)始。如圖7所示，用SPR檢測(cè)器監(jiān)視生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用。
圖7表示在標(biāo)記為“a”和“b”的位置之間抗生蛋白鏈菌素結(jié)合到生物素上。在點(diǎn)b之后，用0.1M PBS的溶液沖洗生物傳感器。存在一些由于釋放生物素化的SAM上的非特異性吸附的抗生蛋白鏈菌素而引起的波動(dòng)，這是由于轉(zhuǎn)換回到正常的PBS電泳緩沖液而造成的。這在圖7中的點(diǎn)b和c之間示出。通過(guò)點(diǎn)c建立了新的基線折射率，傳感器現(xiàn)在包含目標(biāo)物種已結(jié)合到其上的自組裝單層。
然后由振蕩源產(chǎn)生振蕩，振蕩源在本實(shí)施例中是圖5中以50表示的10MHz轉(zhuǎn)換器，其具有1Vpp下的波形以產(chǎn)生超聲能量。從圖7中的點(diǎn)c可以看出，由于抗生蛋白鏈菌素從生物素化的SAM分離而導(dǎo)致折射率的階躍。
該實(shí)施例表明，本發(fā)明生物傳感器可使目標(biāo)物質(zhì)與自組裝單層之間的鍵斷裂。該實(shí)施例還表明可檢測(cè)該鍵斷裂。
雖然所述的生物傳感器僅包括一個(gè)傳感器表面，但生物傳感器可包含許多個(gè)表面區(qū)域，每個(gè)表面區(qū)域具有用于與不同目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的生物大分子。這些表面區(qū)域可提供在單個(gè)基礎(chǔ)表面上。以這種方式可提供一種生物傳感器，該傳感器可以對(duì)各種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，而不需要針對(duì)每種物質(zhì)要求不同的生物傳感器。
上面的內(nèi)容描述了包括其優(yōu)選形式的本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的改變和改進(jìn)是包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.生物傳感器，包括在其上結(jié)合有生物大分子的表面，其中該表面和生物大分子被浸在液體中，鍵斷裂檢測(cè)器，該鍵斷裂檢測(cè)器與該表面相連并且設(shè)置為檢測(cè)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵的斷裂，和振蕩器，該振蕩器與該液體相連且與該表面隔開(kāi)并且設(shè)置為在該液體中產(chǎn)生振蕩，以使生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂。
2.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中鍵斷裂檢測(cè)器是表面等離子體共振檢測(cè)器，當(dāng)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂時(shí)，該檢測(cè)器檢測(cè)具有最小反射比的反射光的角度變化。
3.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中鍵斷裂檢測(cè)器檢測(cè)當(dāng)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生的聲發(fā)射。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中振蕩器產(chǎn)生頻率為超聲的振蕩。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中振蕩器設(shè)置為提供在預(yù)定頻率下的振蕩。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中振蕩器設(shè)置為提供在一定頻段下的振蕩。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中由振蕩器產(chǎn)生的振蕩的振幅是恒定的。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中由振蕩器產(chǎn)生的振蕩的振幅發(fā)生變化。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的生物傳感器，還包括適于將生物大分子結(jié)合到該表面上的自組裝單層。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的生物傳感器，其中該表面涂覆有金或銀。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的生物傳感器，包括多于一個(gè)的表面，每個(gè)表面提供有結(jié)合到不同目標(biāo)物質(zhì)上的生物大分子。
12.一種用于檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的方法，包括以下步驟提供生物傳感器，該生物傳感器包括至少一個(gè)在其上結(jié)合有生物大分子的表面、與該表面相連并設(shè)置為檢測(cè)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵的斷裂的鍵斷裂檢測(cè)器、以及與該表面隔開(kāi)并設(shè)置為產(chǎn)生波以使生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)之間的鍵斷裂的振蕩器，使生物傳感器與可能含有目標(biāo)物質(zhì)的試驗(yàn)流體接觸，使用該振蕩器產(chǎn)生指向該表面的振蕩并且使用該檢測(cè)器檢測(cè)是否有任何鍵斷裂，并且比較鍵斷裂時(shí)振蕩器的參數(shù)與儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，并且其中在生物傳感器的操作過(guò)程中，生物傳感器的該表面和振蕩器被浸在液體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物傳感器，該生物傳感器包括在其上結(jié)合有生物大分子的表面、鍵斷裂檢測(cè)器和振蕩器(8)，其中該表面和生物大分子被浸在液體中，該鍵斷裂檢測(cè)器與該表面相連并且設(shè)置為檢測(cè)生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)(6)之間的鍵的斷裂，該振蕩器與該液體相連且與該表面隔開(kāi)并且設(shè)置為在該液體中產(chǎn)生振蕩，以使生物大分子與目標(biāo)物質(zhì)(6)之間的鍵斷裂。
文檔編號(hào)C12Q3/00GK1947014SQ200580012921
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者Y·袁, M·安德魯斯, W·M·阿諾德, B·馬洛 申請(qǐng)人:工業(yè)研究有限公司