專利名稱：一種驗(yàn)證二硫鍵對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性影響的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自11家族耐熱雜合木聚糖酶AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析，突變木聚糖酶AExIIAg5t工程菌的構(gòu)建以及突變木聚糖酶的高效表達(dá)、純化和活性測(cè)定的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一類重要的工業(yè)用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈,隨機(jī)地切開(kāi)木聚糖內(nèi)部的木糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業(yè)、食品加工及釀造等行業(yè)具有潛在的工業(yè)應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤其是在工業(yè)造紙上的應(yīng)用，減少因漂白產(chǎn)生的環(huán)境污染，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。然而在許多工業(yè)中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進(jìn)行操作，因此對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究也引起了國(guó)內(nèi)外研究的高度重視。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于11家族的木聚糖酶分子量較小，且結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，更適合作為理論研究的分子模型。許多研究結(jié)果表明11家族木聚糖酶的N末端區(qū)域?qū)ζ浞€(wěn)定性起著很重要的作用。Lee等人對(duì)木聚糖酶XynA的N端進(jìn)行刪除突變，突變酶的熱穩(wěn)定性喪失但活性不變，從而確定了 N端是其熱穩(wěn)定區(qū)，盧雪麗等人引入二硫鍵提高黑曲霉XynIII熱穩(wěn)定性的研究。但N端二硫鍵對(duì)11家族耐熱雜合木聚糖酶AExllA的熱穩(wěn)定性分析未見(jiàn)有文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)告。本發(fā)明能為11家族木聚糖酶AExllA的熱穩(wěn)定機(jī)制的闡明、熱穩(wěn)定性蛋白工程的改造等奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型地利用計(jì)算機(jī)和生物信息學(xué)知識(shí)，對(duì)11家族木聚糖酶AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析，運(yùn)用基因工程的方法構(gòu)建突變木聚糖酶工程菌以及突變木聚糖酶的高效表達(dá)、酶活性、最適溫度的測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自11家族木聚糖酶AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析后，得出在端引入了一個(gè)二硫鍵(Cys5-Cys32)，利用定點(diǎn)突變法將5位的半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸(C5T)突變前后的基因分別為AExIIA和AExIIAg5t。AExIIAc5t基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。11家族木聚糖酶pPIC9K_AExllA由江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備和保藏。所述的由完整mRNA序列推導(dǎo)的AExIIAg5t氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的突變木聚糖酶的活性測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma,USA)溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱IOmin,在A管中加入O. ImL適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖 (以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生 I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)。
所述的突變酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定
在不同溫度下，按上述方法測(cè)定酶活性，以最高酶活性為100%計(jì)算相對(duì)酶活性。 T-表示最適溫度。將酶液置于不同溫度下保溫不同時(shí)間，按上述方法測(cè)定殘余酶活性，以未處理的酶活性為100%。t1/2A表示在A°C下酶的半衰期，即殘余酶活性為50%時(shí)的保溫時(shí)間。
所述的突變木聚糖酶基因的設(shè)計(jì)、克隆及表達(dá)
(I)同源建模模擬AExllA的空間結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，尋找到與 AExllA 一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性較高、分別來(lái)源于繩狀青霉菌Penicillium funiculosum(lTEl)、 E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌Hypocrea jecorina (IENX)的11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為同源建模的模板。利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action =f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http: //salilab. org/modeller/)程序?qū)?AExllA 進(jìn)行同源建模。通過(guò)對(duì)AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在AExllA的 N端引入了一個(gè)二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點(diǎn)突變法將其5位的半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸 (C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對(duì)AExllA熱穩(wěn)定性的影響，突變前后的基因分別為AExllA 和 AEx I IAc5t。
(2)突變基因AExIIAg5t及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)pPIC9K_AExllA(本實(shí)驗(yàn)是保存)設(shè)計(jì)引物
Fl 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT~3/，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)和突變點(diǎn) Thr5。
Rl 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點(diǎn)。
以本實(shí)驗(yàn)室保存的pPIC9K_AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。 940C 2min ;30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接；轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序測(cè)序正確的pUCm-T-AExllAraT與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-AExllAG5T(圖I)， 并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。
(3)GS115/AExllAC5T的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sal I對(duì) pPIC9K-AExlIAc5t進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；發(fā)酵液經(jīng)離心后經(jīng)過(guò)超濾膜濃縮、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析純化和SDS-PAGE分析；純化的酶按照活性及最適宜溫度的測(cè)定方法的測(cè)定。
本發(fā)明的有益成果本研究利用定點(diǎn)突變法去除AExllAN端二硫鍵后，其最適溫度和熱穩(wěn)定性明顯降低，由此證實(shí)該二硫鍵是影響AExllA熱穩(wěn)定性的主要原因之一。同時(shí)為11家族木聚糖酶的耐熱機(jī)制提供了準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


圖I :重組質(zhì)粒pPIC9K_AExllAG5T的構(gòu)建示意圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I同源建模模擬AExllA的空間結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，尋找到與AExllA —級(jí)結(jié)構(gòu)同源性較高、分別來(lái)源于繩狀青霉菌 Penicillium funiculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌 Hypocreajecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為同源建模的模板。利用SALIGN(http://salilab.org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9.9 (http://salilab. org/modeller/)程序?qū)ExllA進(jìn)行同源建模。通過(guò)對(duì)AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及 其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì),發(fā)現(xiàn)在AExllA的N端引入了一個(gè)二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點(diǎn)突變法將其5位的半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸(C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對(duì)AExllA熱穩(wěn)定性的影響，突變前后的基因分別為AExllA和AExllAG5T。實(shí)施例2突變基因AExIIAg5t及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)pPIC9K_AExllA(本實(shí)驗(yàn)是保存)設(shè)計(jì)引物Fl 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT~3/，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)和突變點(diǎn)Thr5Rl 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點(diǎn)以本實(shí)驗(yàn)室保存的pPIC9K_AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。940C 2min ;30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用 I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接；轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序正確的pUCm-T-AExllAraT與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-AExllAG5T(圖I)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例3GS115/AExllAraT的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sal I對(duì)pPIC9K_AExllAraT進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;該工程菌用1.0%甲醇誘導(dǎo)72h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中突變木聚糖酶活性與AExllA基本一致。發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為突變AExIIAc5t粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和Si^phadex G-75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示突變木聚糖酶分子量與AExllA基本一致；該突變木聚糖酶最適作用溫度60°C低于AExllA 的最適溫度 85°C，其 t1/27° 和 t1/28° 分別為 3. O、I. Omin，低于 AExllA 的 197 和 25min。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)來(lái)源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族的雜合木聚糖酶AExllA進(jìn)行耐熱分析。通過(guò)對(duì)AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析,定向突變以研究熱穩(wěn)定提高的原因，突變后的核苷酸(AExIIAg5t)序列為SEQ ID NO :1。
2.由權(quán)利要求I所述的突變的木聚糖酶基因(AExllAra)編碼的突變木聚糖酶(AExIIAg5t),其完整的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的為SEQ ID NO :2。
3.AExllA結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXynllA結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析 同源建模AExllA的空間結(jié)構(gòu)登錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein data bank (http://rcsb. org)，經(jīng)BLAST比對(duì)，找到與AExllA —級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度同源的，分別來(lái)自繩狀青霉菌Penicilliumfuniculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌 Hypocrea jecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為同源建模的模板；其相似性分別為63. 7%、78. 8%和60. 9% ο 利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http://salilab. org/modeller/)程序?qū)?AEx IlA 進(jìn)行同源建模； 經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)由于N端替換,在AExl IA分子結(jié)構(gòu)中引入了一個(gè)二硫鍵(Cys5-Cys32),其連接兩個(gè)反向平行的折疊股(Al和Α2)，可能會(huì)通過(guò)降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵，而對(duì)其熱穩(wěn)定性提高有一定的作用。
4.突變木聚糖酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法 (1)突變基因AExIIAg5t及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)pPIC9K-AExllA(本實(shí)驗(yàn)是保存)設(shè)計(jì)引物，將其中的Cys5突變?yōu)門hr5 Fl 5/ -GA ATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT-3'，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)和突變點(diǎn) Thr5 Rl :5, -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點(diǎn) 以pPIC9K-AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。94°C 2min ；30個(gè)循環(huán)，940C 30s, 550C 30s, 72°C 40s ；72°C IOmin0將PCR的目的條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序；測(cè)序正確的pUCm-T-AExllAG5T與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-AExllAe5T，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定； (2)GS115/AExI IAc5t的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定 用Sal I對(duì)pPIC9K-AExllAraT進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo)72h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中突變木聚糖酶活性與原酶AExllA基本一致。發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為突變AExIIAc5t粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和S印hadex G-75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示突變木聚糖酶分子量與原酶AExlIA基本一致；該突變木聚糖酶最適作用溫度60°C，低于原酶AExlIA的最適溫度85°C;其t1/2 和t1/28°分別為3. O、I. Omin低于原酶AExllA的·197 和 25min。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種對(duì)來(lái)源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族的雜合木聚糖酶AEx11A進(jìn)行耐熱分析，通過(guò)對(duì)AEx11A結(jié)構(gòu)的同源建模及其與AoXyn11A結(jié)構(gòu)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在AEx11A的N端引入了一個(gè)二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點(diǎn)突變法將其5位的半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸(C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對(duì)AEx11A熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變酶(AEx11AC5T)的Topt由突變前的75℃降為60℃、t1/270和t1/280分別由突變前的197和25min縮短為3.0和1.0min，說(shuō)明N端二硫鍵對(duì)11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性有一定的影響。能為11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定機(jī)制的闡明、熱穩(wěn)定性蛋白工程的改造等奠定理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102978224SQ20121056263
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者鄔敏辰, 余濤, 殷欣, 李劍芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)