專利名稱：截短的adamts分子的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的截短的ADAMTS多肽，特別是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，以及編碼這種新的多肽的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)這種新的截短的ADAMTS多肽的方法，以及使用這種新的多肽開發(fā)ADAMTS抑制劑，特別是軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的方法。
相關(guān)的
背景技術(shù)：
ADAM(“解整連蛋白(disintegrin)和金屬蛋白酶”)蛋白代表具有高度序列同源性和結(jié)構(gòu)域組織的膜相關(guān)多結(jié)構(gòu)域鋅依賴性金屬蛋白酶家族。除了解整連蛋白和蛋白酶結(jié)構(gòu)域外，ADAM蛋白通常含有前結(jié)構(gòu)域(predomain)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域。ADAM蛋白是細(xì)胞表面蛋白中獨(dú)特的，這在于其含有粘著蛋白和蛋白酶雙特性(Kaushal和Shah，J.Clin.Invest.1051335(2000))。
最近，已鑒定了缺乏跨膜和胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的ADAM家族的新成員。更重要的是，這些新成員含有未在其他ADAM中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)(TSRs)。這些ADAMTS(“具有血小板反應(yīng)蛋白基序的解整連蛋白和金屬蛋白酶”)蛋白也含有前結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解整連蛋白結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和間隔區(qū)，并且可能也含有PLAC結(jié)構(gòu)域，其是含有6個(gè)半胱氨酸的30-40個(gè)氨基酸的肽。如同其它ADAM蛋白，所有迄今鑒定的ADAMTS蛋白都含有催化性共有序列HXXGXXHD，其協(xié)調(diào)蛋白酶活性必需的Zn2+離子(Tang，Int.J.Biochem.Cell Biol. 445223(2001))。
ADAMTS家族的成員，其現(xiàn)在數(shù)目超過20個(gè)，所有都在解整連蛋白結(jié)構(gòu)域后含有一個(gè)TSR；已表明此內(nèi)部TSR結(jié)合肝素(Kuno等，J,Biol.Chem.272556(1997))。然而，ADAMTS相互之間可以區(qū)分，這部分地通過它們在間隔區(qū)下游所含有的可變數(shù)目的C-末端TSR實(shí)現(xiàn)。例如，ADAMTS-4不含有C-末端TSR，ADAMTS-5含有1個(gè)C-末端TSR，ADAMTS-1(以及人同源物METH1)和ADAMTS-16含有2個(gè)C-末端TSR，ADAMTS-10和-18含有5個(gè)C-末端TSR，以及ADAMTS-9和-20含有14個(gè)C-末端TSR。
ADAMTS已牽涉在多種病理障礙中。例如，ADAMTS-2的突變導(dǎo)致人類Ehlers-Danlos綜合征和牛的皮膚脆裂癥(Colige等，Am.J.Hum.Genet.65308(1999))，而ADAMTS-13(也稱作vonWillebrand因子切割蛋白)的突變導(dǎo)致血栓形成性血小板減少性紫癜(Kokame等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9911902(2002))。
最近，幾個(gè)ADAMTS也已牽涉在引起關(guān)節(jié)軟骨的炎性障礙的病理生理性事件中，如骨關(guān)節(jié)炎(OA)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。最初將ADAMTS-4和ADAMTS-5(后者也稱作ADAMTS-11)鑒定為負(fù)責(zé)軟骨聚集蛋白聚糖切割的蛋白酶(它們現(xiàn)在分別被命名為軟骨聚集蛋白聚糖酶-1和軟骨聚集蛋白聚糖酶-2)，其有助于關(guān)節(jié)軟骨在負(fù)荷下抵抗壓縮變形的機(jī)械特性(Tortorella等，Science2841664(1999)；Abbaszade等，J.Biol.Chem.27423443(1999))。隨后，也表明ADAMTS-1具有這種損害關(guān)節(jié)的“軟骨聚集蛋白聚糖酶”活性(Rodriguez-Manzaneque等，Biochem.Biophys.Res.Commun.293501(2002))。也有證據(jù)提示這些軟骨聚集蛋白聚糖酶具有大腦富含的透明質(zhì)酸糖胺多糖結(jié)合/短蛋白聚糖切割活性，這可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲性中起作用(Matthews等，J.Biol.Chem.27522695(2000))。軟骨聚集蛋白聚糖酶更普遍地被稱為透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶(hyalectanase)，因?yàn)樗鼈兦懈钔该髻|(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖(hyalectan)，其包括軟骨聚集蛋白聚糖、短蛋白聚糖和多能蛋白聚糖。
ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶在軟骨聚集蛋白聚糖的G1球形結(jié)構(gòu)域的球間結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸Glu373-Ala374之間切割，其暴露所得C-末端軟骨聚集蛋白聚糖片段上的N-末端的新表位(neoepitope)(374ARGSV)(Tortorella等，Matrix Biol.21499(2002)；Westling等，J.Biol.Chem.27716059(2002)；Tortorella等，J.Biol.Chem.27518566(2000))。已在患有炎性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)損傷和OA患者的滑液中發(fā)現(xiàn)了該374ARGSV軟骨聚集蛋白聚糖片段(Malfait等，J.Biol.Chem.27722201(2002)；Lohmander等，ArthritisRheum.361214(1993)；Sandy等，J.Clin.Invest.891512(1992))。另外，已在患有關(guān)節(jié)損傷、OA和RA患者的關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)了所得的含有C-末端NITEGE373新表位的N-末端軟骨聚集蛋白聚糖片段(Malfait等，見上；Sandy和Verscharen，Biochem.J.358615(2001)；Lark等，J.Clin.Invest.10093(1997))。已表明用合成的ADAMTS抑制劑抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性能在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中阻止軟骨聚集蛋白聚糖降解，如通過含有374ARGSV新表位的軟骨聚集蛋白聚糖片段的釋放所測量的(Malfait等，見上)。
由于它們涉及各種炎性障礙，如OA和RA，因此需要鑒定ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶的抑制劑，特別是小分子抑制劑。為此，需要大量純化的、均質(zhì)的軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白以進(jìn)行必需的篩選測定和結(jié)晶研究。然而，已證明由于這些分子的異質(zhì)性、低表達(dá)和差的穩(wěn)定性，分離和純化大量這些蛋白很困難。例如，由于在多肽各種位置處的C-末端截短，所以軟骨聚集蛋白聚糖酶-1(ADAMTS-4)的重組表達(dá)產(chǎn)生分子量低于成熟蛋白的幾個(gè)同種型(Flannery等，J.Biol.Chem.27742775(2002)；Gao等，J.Biol.Chem.27711034(2002))。另外，天然軟骨聚集蛋白聚糖酶-1和-2(ADAMTS-5)均以表示C-末端截短的各種低分子量形式存在(Tortorella等，J.Biol.Chem.27525791(2000)；Abbaszade，見上)。
美國專利申請公開No.2004/0044194 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及ADAMTS 18核酸分子和其編碼的多肽。
美國專利申請公開No.2004/0054149 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及截短的ADAMTS分子，且優(yōu)選地為截短的ADAMTS-4(軟骨聚集蛋白聚糖酶-1)和ADAMTS-5(軟骨聚集蛋白聚糖酶-2)核酸分子及其編碼的多肽。類似地，美國專利申請公開No.2004/0142863 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及截短的ADAMTS-4核酸分子及其編碼的多肽。
迄今所描述的截短的ADAMTS分子通常是在C-末端截短的。仍需要鑒定其它的ADAMTS相關(guān)分子，且特別是用于增加ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶的產(chǎn)量、穩(wěn)定性和同質(zhì)性的截短的ADAMTS分子。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供截短的有生物活性的ADAMTS多肽，特別是具有透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其顯示比它們的全長對應(yīng)物更高的穩(wěn)定性和同質(zhì)性以及更高的表達(dá)產(chǎn)量。在一個(gè)方面，截短的ADAMTS缺乏富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的重要部分。優(yōu)選地，截短的ADAMTS保留催化結(jié)構(gòu)域、解整連蛋白結(jié)構(gòu)域以及中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)的重要部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS多肽缺乏保守的Phe后的C-末端的重要部分，并且可進(jìn)一步缺乏，或者可選擇地缺乏前結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也提供編碼這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的方法，以及鑒定能調(diào)節(jié)有生物活性的ADAMTS多肽的化合物的方法，特別是那些抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失多個(gè)氨基酸殘基獲得的分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中全長ADAMTS蛋白包括富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，且多個(gè)缺失的氨基酸殘基包括富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的重要部分，且其中全長ADAMTS蛋白不是全長ADAMTS-4蛋白。
附圖簡述


圖1示意性圖示ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
圖2示意性圖示修飾的ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
圖3顯示(a)缺乏前結(jié)構(gòu)域的修飾的ADAMTS-7(SEQID NO2)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-7(SEQ ID NO3)；以及(c)缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-7(SEQ ID NO4)的氨基酸序列。
圖4顯示(a)缺乏前結(jié)構(gòu)域的修飾的ADAMTS-9(SEQID NO6)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-9(SEQ ID NO7)；以及(c)缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-9(SEQ ID NO8)的氨基酸序列。
圖5顯示(a)缺乏前結(jié)構(gòu)域的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO10)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO11)；以及(c)缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
圖6顯示(a)缺乏前結(jié)構(gòu)域的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO14)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO15)；以及(c)缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO16)的氨基酸序列。
圖7顯示(a)缺乏前結(jié)構(gòu)域的修飾的ADAMTS-18(SEQID NO18)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-18(SEQ ID NO19)；以及(c)缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-18(SEQ ID NO20)的氨基酸序列。
圖8顯示牛軟骨聚集蛋白聚糖與(a)截短的ADAMTS-7；(b)截短的ADAMTS-9；(c)截短的ADAMTS-10；(d)截短的ADAMTS-16；以及(e)截短的ADAMTS-18溫育后，含有新表位的軟骨聚集蛋白聚糖G1結(jié)構(gòu)域的蛋白印跡。
包括所有附圖都是用于說明，且不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明。
發(fā)明詳述
本發(fā)明基于ADAMTS蛋白的截短形式比它們的全長對應(yīng)物具有更高的穩(wěn)定性和更高的表達(dá)水平以及更高的同質(zhì)性，而仍保留生物活性的發(fā)現(xiàn)。由此，本發(fā)明提供新的有生物活性的ADAMTS蛋白的截短形式，特別是具有透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其具有比該蛋白的全長形式更高的穩(wěn)定性和更高的表達(dá)水平。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS分子在C-末端截短并保留透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性，且優(yōu)選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS分子包括圖1和2所示的保守的苯丙氨酸(Phe)后C-末端的重要截短。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS分子缺乏前結(jié)構(gòu)域的重要部分并保留透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性，且優(yōu)選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺失富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的重要部分，從而截短的ADAMTS保留透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性，且更優(yōu)選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，具有透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性，且更優(yōu)選地具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是缺乏至少前結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS。這種截短的ADAMTS分子尤其包括缺乏至少前結(jié)構(gòu)域的ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-7、ADAMTS-9、ADAMTS-10、ADAMTS-16和ADAMTS-18。這些具有透明質(zhì)酸糖胺多糖和凝集素結(jié)合的模塊蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS分子可進(jìn)一步包括C-末端截短，例如，在C-末端保守的Phe處的截短。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-7。在一個(gè)實(shí)施方案中，該截短缺失ADAMTS-7的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域。全長ADAMTS-7如SEQ ID NO1所示(GenBank登記號No.NP_055087)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-7分子缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸233-1686、基本上由氨基酸233-1686組成或由氨基酸233-1686組成，如SEQ IDNO2所示(圖3a)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-7缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-599、基本上由氨基酸1-599組成或由氨基酸1-599組成，如SEQ ID NO3所示(圖3b)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-7分子缺乏蛋白結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸233-599、基本上由氨基酸233-599組成或由氨基酸233-599組成，如SEQ IDNO4所示(圖3c)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-9。全長ADAMTS-9如SEQ ID NO5所示(GenBank登記號No.AAF89106)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該截短缺失ADAMTS-9的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸288-1072、基本上由氨基酸288-1072組成或由氨基酸288-1072組成，如SEQ IDNO6所示(圖4a)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-649、基本上由氨基酸1-649組成或由氨基酸1-649組成，如SEQ ID NO7所示(圖4b)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏保守的Phe后的C-末端和前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸288-649、基本上由氨基酸288-649組成或由氨基酸288-649組成，如SEQ ID NO8所示(圖4c)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-10。在一個(gè)實(shí)施方案中，該截短缺失ADAMTS-10的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域。全長ADAMTS-10如SEQ ID NO9所示(GenBank登記號No.NP_112219)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸234-1103、基本上由氨基酸234-1103組成或由氨基酸234-1103組成，如SEQ IDNO10所示(圖5a)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-608、基本上由氨基酸1-608組成或由氨基酸1-608組成，如SEQ ID NO11所示(圖5b)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏保守的Phe后的C-末端和前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸234-608、基本上由氨基酸234-608組成或由氨基酸234-608組成，如SEQ ID NO12所示(圖5c)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-16。在一個(gè)實(shí)施方案中，該截短缺失ADAMTS-16的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域。全長ADAMTS-16如SEQ ID NO13所示(GenBank登記號No.NP_620687)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸279-1072、基本上由氨基酸279-1072組成或由氨基酸279-1072組成，如SEQ IDNO14所示(圖6a)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-647、基本上由氨基酸1-647組成或由氨基酸1-647組成，如SEQ ID NO15所示(圖6b)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸279-647、基本上由氨基酸279-647組成或由氨基酸279-647組成，如SEQ IDNO16所示(圖6c)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-18。在一個(gè)實(shí)施方案中，該截短缺失ADAMTS-18的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域。全長ADAMTS-18如SEQ ID NO17所示(GenBank登記號No.NP_955387)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸285-1221、基本上由氨基酸285-1221組成或由氨基酸285-1221組成，如SEQ IDNO18所示(圖7a)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-650、基本上由氨基酸1-650組成或由氨基酸1-650組成，如SEQ ID NO19所示(圖7b)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏保守的Phe后的C-末端和前結(jié)構(gòu)域，并且包括氨基酸285-650、基本上由氨基酸285-650組成或由氨基酸285-650組成，如SEQ IDNO20所示(圖7c)。
除了上述蛋白，這里所提供的截短的有生物活性的ADAMTS蛋白也包括具有與SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、14-16和18-20所示序列相似的氨基酸序列，但其中已天然地提供(即，等位基因變體)或通過有意地工程改造形成插入、缺失或取代的蛋白。例如，可能在功能相似氨基酸(例如，酸性的、堿性的、分支的，等等)之間進(jìn)行大量保守性的取代，而不顯著影響上述截短的蛋白的結(jié)構(gòu)或活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失至少富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的重要部分獲得本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。例如，缺失可包括，沒有限制地，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。也可缺失其它區(qū)或輔助結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。這些其它區(qū)或輔助結(jié)構(gòu)域包括，例如，解整連蛋白樣結(jié)構(gòu)域、中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域、任何C-末端血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)、任何位于輔助結(jié)構(gòu)域之間或之后的區(qū)、信號肽以及前結(jié)構(gòu)域。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失位于中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)后空間上保守的苯丙氨酸殘基的C-末端的氨基酸殘基的重要部分，獲得本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。如這里所使用的，保守殘基是至少大多數(shù)ADAMTS家族成員所共有的。例如，保守殘基可由所有ADAMTS家族成員中的至少60％、70％、80％、90％、95％或100％成員共有?？墒褂帽绢I(lǐng)域中的各種已知方法鑒別保守殘基。在一個(gè)實(shí)例中，首先產(chǎn)生不同ADAMTS家族成員的最佳序列比對。適用于此目的的算法包括，但不限于，CLUSTALW、MSA、PRALINE、DIALIGN、PRRP、SAGA和MACAW。見Mount，BIOINFORMATICS(Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，2001)，p.141?？设b別至少由大多數(shù)ADAMTS家族成員共有的保守殘基。也可使用其它方法來鑒別保守殘基。
所利用的缺失可包括位于中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)后第一個(gè)保守的苯丙氨酸殘基C-末端的任何殘基或序列片段。例如，缺失的氨基酸殘基可選自富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域、C-末端血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域或位于其之間或其之后的任何區(qū)。缺失的殘基可包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的殘基。結(jié)構(gòu)域的缺失可以是全部的或部分的。
在一個(gè)實(shí)例中，缺失包括位于第一個(gè)保守的苯丙氨酸殘基C-末端總氨基酸殘基的至少30％。例如，缺失可包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端所有氨基酸殘基的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。缺失的殘基可包括一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的片段序列。每個(gè)缺失的序列片段可包括，例如，2-5個(gè)氨基酸、5-10個(gè)氨基酸、10-20個(gè)氨基酸、20-30個(gè)氨基酸、30-50個(gè)氨基酸、50-100個(gè)氨基酸、100-150個(gè)氨基酸、150-200個(gè)氨基酸、200-250個(gè)氨基酸、250-300個(gè)氨基酸、300-350個(gè)氨基酸、350-400個(gè)氨基酸、400-450個(gè)氨基酸、450-500個(gè)氨基酸或大于500個(gè)氨基酸。另外，缺失的殘基可包括非連續(xù)的殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長ADAMTS蛋白，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可從其中衍生，是天然存在的全長ADAMTS蛋白。天然存在的全長蛋白包括通過可變RNA剪接所產(chǎn)生的ADAMTS同種型。全長ADAMTS蛋白可以是包括信號肽或前結(jié)構(gòu)域的前蛋白。全長ADAMTS蛋白也可以是缺乏信號肽和前結(jié)構(gòu)域的成熟蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長ADAMTS蛋白，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可從其中衍生，是天然存在的全長ADAMTS蛋白的變體。變體的氨基酸序列與天然存在的蛋白的氨基酸序列基本相同。在一個(gè)實(shí)例中，變體的氨基酸序列具有與天然存在的蛋白至少80％、85％、90％、95％、99％或更高的全局序列同一性或相似性?？墒褂帽绢I(lǐng)域中的各種已知方法確定序列同一性或相似性。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)比對算法測定序列同一性或相似性，如在Altschul，等，J.MOL.BIOL.，215403-410(1990)中所描述的基本局部比對工具(BLAST)、Needleman，等，J.MOL.BIOL.，48444-453(1970)的算法、Meyers，等，COMPUT.APPL.BIOSCI.，411-17(1988)的算法，以及點(diǎn)矩陣分析。適當(dāng)?shù)男蛄斜葘Τ绦虬?，但不限于，由國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)(Bethesda，MD)所提供的BLAST程序和由DNASTAR，Inc.(Madison，WI)所提供的MegAlign。在一個(gè)實(shí)例中，通過使用Genetics Computer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)測定序列同一性或相似性。使用由程序所指定的默認(rèn)值(例如，在序列之一中打開缺口的罰分是11，延伸缺口的罰分是8)?？墒褂肂LOSUM62取代矩陣定義相似氨基酸。
在一個(gè)實(shí)例中，天然存在的ADAMTS蛋白和其變體可在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中基本相同，但在其它區(qū)中不同。在另一個(gè)實(shí)例中，變體保留天然存在的蛋白的全部結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)例中，通過在天然存在的序列中進(jìn)行至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入制備變體。取代可以是保守的、非保守的或者是兩者。本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可以是包括信號肽或前結(jié)構(gòu)域的前蛋白。本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶也可以是缺乏任何信號肽或前結(jié)構(gòu)域的成熟蛋白。
本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶也可包括位于中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)后的第一個(gè)連續(xù)苯丙氨酸殘基N-末端的缺失。例如，可缺失金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、解整連蛋白樣結(jié)構(gòu)域或中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)中的某些殘基，而不取消或顯著改變原始蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。缺失的殘基可能涉及或可能不涉及軟骨聚集蛋白聚糖結(jié)合或蛋白水解活性。
本發(fā)明也預(yù)期上述軟骨聚集蛋白聚糖酶的變體。這些變體具有可使用下述測定很容易測定的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。蛋白序列的變體可能是天然存在的，如通過等位基因變異或多態(tài)性，或者通過有意的工程改造?？蓪⒋罅勘Ｊ氐陌被崛〈氲降鞍仔蛄兄?，而不顯著改變蛋白的結(jié)構(gòu)或生物活性?？苫跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或者兩親性特性的相似性進(jìn)行保守性氨基酸取代。例如，可在具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，如賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)；具有無電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)和酪氨酸(Tyr或Y)；以及具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，如丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)、色氨酸(Trp或W)和半胱氨酸(Cys或C)之間進(jìn)行保守的氨基酸取代。在表1中舉例說明其它示例性的氨基酸取代。
表1.示例性的氨基酸取代
可使用非天然存在的氨基酸殘基進(jìn)行保守性取代。一般地通過化學(xué)方法的肽合成而不是通過在生物系統(tǒng)中的合成摻入這些氨基酸殘基。
另外，軟骨聚集蛋白聚糖酶變體可包括氨基酸取代以提高分子的穩(wěn)定性。例如，在軟骨聚集蛋白聚糖酶分子催化結(jié)構(gòu)域的411位上的E到Q的突變可提高軟骨聚集蛋白聚糖酶的穩(wěn)定性和半衰期。也可使用軟骨聚集蛋白聚糖酶的其它區(qū)中的氨基酸突變來提高分子的穩(wěn)定性。
也可將其它期望的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)引入到軟骨聚集蛋白聚糖酶分子中。例如，可鑒定對軟骨聚集蛋白聚糖酶分子的生物活性重要的氨基酸殘基。隨后可選擇能夠增加或降低軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的取代。
此外，軟骨聚集蛋白聚糖酶變體可包括糖基化位點(diǎn)的修飾。這些修飾可包括O-連接或N-連接的糖基化位點(diǎn)。例如，可取代或缺失在天冬酰胺連接的糖基化識別位點(diǎn)上的氨基酸殘基，從而導(dǎo)致部分糖基化或糖基化的完全取消。天冬酰胺連接的糖基化識別位點(diǎn)一般包括被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶識別的三肽序列。這些三肽序列可以是天冬酰胺-X-蘇氨酸或天冬酰胺-X-絲氨酸，其中X通常是任何氨基酸。在糖基化識別位點(diǎn)的第一或第三個(gè)氨基酸位置中的一個(gè)或兩者上的多種氨基酸取代或缺失(或在第二位置上的氨基酸缺失)可導(dǎo)致修飾的三肽序列上的非糖基化。另外，軟骨聚集蛋白聚糖酶相關(guān)蛋白的細(xì)菌表達(dá)也導(dǎo)致產(chǎn)生非糖基化的蛋白，即使糖基化位點(diǎn)未被修飾。
也可通過將其它修飾摻入到原始多肽中來制備軟骨聚集蛋白聚糖酶變體。這些修飾可通過天然存在的方法引入，如翻譯后修飾，或者通過人工的或合成的方法引入。合適的修飾可發(fā)生在多肽中的任何位置，包括主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端?？稍谧凅w的幾個(gè)位點(diǎn)上存在相同或不同程度的相同類型的修飾。變體也可含有許多不同類型的修飾。適于本發(fā)明的示例性的修飾包括，但不限于，乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)附著、血紅素部分的共價(jià)附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、磷脂酰肌醇的共價(jià)附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價(jià)交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的向蛋白中添加氨基酸如精氨酰化、遍在蛋白化或者它們的任何組合。多肽變體可以是分支的，例如，由于遍在蛋白化，或者其可以是環(huán)狀的，具有或不具有分支。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可根據(jù)本發(fā)明通過修飾可缺失的氨基酸殘基，從全長ADAMTS蛋白中獲得本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。示例性的修飾包括，但不限于，取代和插入。在一個(gè)實(shí)例中，修飾基本上改造輔助結(jié)構(gòu)域或其片段，從而考慮從全長ADAMTS蛋白中缺失該輔助結(jié)構(gòu)域或片段。在另一個(gè)實(shí)例中，改造的結(jié)構(gòu)域或片段與原結(jié)構(gòu)域或片段的序列同一性或相似性低于50％、40％、30％、20％、10％或5％。在另一個(gè)實(shí)例中，修飾包括中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)后第一個(gè)保守的苯丙氨酸殘基后的至少一個(gè)序列的插入。位于插入序列N末端的結(jié)構(gòu)域保留軟骨聚集蛋白聚糖酶活性并因此構(gòu)成可分離的軟骨聚集蛋白聚糖酶單位。
在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶是分離的或純化的形式。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑基本上無其它蛋白。例如，軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑包括按重量計(jì)算低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的其它蛋白。在另一個(gè)實(shí)例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑含有將不干擾軟骨聚集蛋白聚糖酶的預(yù)期用途的可忽略量的污染物。
本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有蛋白水解活性，且優(yōu)選地切割軟骨聚集蛋白聚糖的IGD中的Glu373-Ala374鍵。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶保留可從其中衍生軟骨聚集蛋白聚糖酶的全長ADAMTS蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的重要部分。例如，軟骨聚集蛋白聚糖酶可保留全長ADAMTS蛋白的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有比全長ADAMTS蛋白更高的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長ADAMTS蛋白沒有可檢測到的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性，且全長蛋白的多個(gè)氨基酸殘基的缺失賦予修飾蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
本發(fā)明也提供編碼有生物活性的ADAMTS蛋白的新的截短形式，特別是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-7。優(yōu)選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域和5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS-7分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏編碼前結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，并且包括核酸699-5058、基本上由核酸699-5058組成或由核酸699-5058組成，如SEQ ID NO21所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后C-末端的區(qū)域，并且包括核酸1-1797、基本上由核酸1-1797組成或由核酸1-1797組成，如SEQ ID NO22所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端兩者，并且包括核酸699-1797、基本上由核酸699-1797組成或由核酸699-1797組成，如SEQ ID NO23所示。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-9。優(yōu)選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域以及2個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS-9分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括核苷酸864-3216、基本上由核苷酸864-3216組成或由核苷酸864-3216組成，如SEQ ID NO24所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后C-末端的區(qū)域，并且包括核酸1-1947、基本上由核酸1-1947組成或由核酸1-1947組成，如SEQ ID NO25所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端兩者，并且包括核酸864-1947、基本上由核酸864-1947組成或由核酸864-1947組成，如SEQ ID NO26所示。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-10。優(yōu)選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS-10分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括核酸702-3309、基本上由核酸702-3309組成或由核酸702-3309組成，如SEQ ID NO27所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區(qū)域，并且包括核苷酸1-1824、基本上由核苷酸1-1824組成或由核苷酸1-1824組成，如SEQ ID NO28所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏編碼前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端兩者的區(qū)域，并且包括多核苷酸702-1824、基本上由多核苷酸702-1824組成或由多核苷酸702-1824組成，如SEQ ID NO29所示。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-16。優(yōu)選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS-16分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括核酸837-3216、基本上由核酸837-3216組成或由核酸837-3216組成，如SEQ ID NO30所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區(qū)域，并且包括核苷酸1-1941、基本上由核苷酸1-1941組成或由核苷酸1-1941組成，如SEQ ID NO31所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏編碼前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端的區(qū)域，并且包括多核苷酸837-1941、基本上由多核苷酸837-1941組成或由多核苷酸837-1941組成，如SEQ ID NO32所示。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-18。優(yōu)選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)C-末端TSR結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS-18分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏前結(jié)構(gòu)域，并且包括核酸855-3663、基本上由核酸855-3663組成或由核酸855-3663組成，如SEQ ID NO33所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區(qū)域，并且包括核苷酸1-1950、基本上由核苷酸1-1950組成或由核苷酸1-1950組成，如SEQ ID NO34所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏編碼前結(jié)構(gòu)域和保守的Phe后的C-末端兩者的區(qū)域，并且包括多核苷酸855-1950、基本上由多核苷酸855-1950組成或由多核苷酸855-1950組成，如SEQ ID NO35所示。
本發(fā)明的多核苷酸也包括具有在密碼子序列上與上述那些不同的核苷酸序列的那些，但是其編碼由SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、14-16和18-20所示氨基酸序列組成的蛋白(例如，由于公知的遺傳密碼的簡并性)。
除了編碼上述截短的有生物活性的ADAMTS蛋白的多核苷酸，本發(fā)明的多核苷酸也包括在嚴(yán)格(優(yōu)選高度嚴(yán)格)條件下與SEQ ID NOs21-35所示的核苷酸序列雜交的那些。這種多核苷酸包括具有與SEQ ID NOs21-35所示多核苷酸相似的核苷酸序列的那些，但是其中已天然提供(即，等位基因變體)或通過有意地工程改造形成插入、缺失或取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的等位基因變體與SEQID NOs21-35所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性(更優(yōu)選地，至少95％同一性；最優(yōu)選地，至少99％同一性)。
在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NOs21-35所示核苷酸序列雜交的本發(fā)明的多核苷酸也包括具有與所公開的多核苷酸同源的序列的那些。這些同源物是從與所公開的多核苷酸(以及翻譯的多肽)的那些不同的物種中分離的多核苷酸(以及翻譯的多肽)，或者是在相同物種內(nèi)，但是與所公開的多核苷酸(以及翻譯的多肽)具有顯著的序列相似性。優(yōu)選地，多核苷酸同源物與所公開的多核苷酸具有至少60％序列同一性(更優(yōu)選地，至少75％同一性；最優(yōu)選地，至少90％同一性)，并且是從哺乳動(dòng)物物種(更優(yōu)選地是靈長類，最優(yōu)選的是人)中分離的。
高度嚴(yán)格的雜交條件是本領(lǐng)域公知的。在下面的表2中顯示各種嚴(yán)格條件的實(shí)例高度嚴(yán)格條件是至少與，例如，條件A-F一樣嚴(yán)格的那些；嚴(yán)格條件是至少與，例如，條件G-L一樣嚴(yán)格的那些；且降低的嚴(yán)格條件是至少與，例如，條件M-R一樣嚴(yán)格的那些。
表2
在表2中1雜交體長度是對于雜交多核苷酸的雜交區(qū)域所預(yù)期的。當(dāng)多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸雜交時(shí)，假設(shè)雜交體長度是雜交多核苷酸的長度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時(shí)，可通過將多核苷酸的序列進(jìn)行比對并且鑒別最佳序列互補(bǔ)性的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，來測定雜交體長度。
2在雜交和洗滌緩沖液中可用SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)代替SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)代替；在雜交完成后洗滌15分鐘。TB*-TR*預(yù)計(jì)長度小于50個(gè)堿基對的雜交體的雜交溫度應(yīng)當(dāng)比雜交體的解鏈溫度(Tm)低5-10℃，其中根據(jù)下列等式確定Tm。對于長度小于18個(gè)堿基對的雜交體，Tm(℃)＝2(A+T堿基的數(shù)目)+4(G+C堿基的數(shù)目)。對于長度為18至49個(gè)堿基對的雜交體，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜交體中堿基的數(shù)目，且Na+是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對于1xSSC，Na+＝0.165M)。
在Sambrook等，Molecular Cloning4 LaboratoryManual，Chs.9 & 11，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等，編輯，Current Protocols inMolecular Biology，Sects.2.10 & 6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)中提供多核苷酸雜交嚴(yán)格條件的另外實(shí)例，在此引入作為參考。
可使用各種方法制備編碼本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的多核苷酸。例如，可通過1個(gè)或多個(gè)缺失從全長ADAMTS的cDNA序列中獲得本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的編碼序列。對于公開的全長ADAMTS cDNA序列，見，例如，Tortorella，等，SCIENCE，2841664-1666(1999)；Hurskainen，等，見上；Clark，等，GENOMICS，67343-350(2000)；和Cal，等，GENE，28349-62(2002)?？墒褂枚喾N方法制備全長ADAMTS cDNA序列的缺失。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用PCR介導(dǎo)的反應(yīng)制備位于兩個(gè)所選片段之間的序列的缺失?？墒紫萈CR擴(kuò)增所選片段，并然后符合讀框地連接，從而缺失位于其間的序列?？蓪⑦B接產(chǎn)物亞克隆到在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過PCR僅擴(kuò)增ADAMTS編碼序列的期望部分來產(chǎn)生截短的ADAMTS。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺失基于ADAMTS編碼序列中兩個(gè)天然存在的或基因工程改造的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法，如定點(diǎn)誘變，將期望的限制位點(diǎn)引入到ADAMTS編碼序列中。在兩個(gè)限制位點(diǎn)的切割以及隨后的符合讀框的連接將缺失位于兩個(gè)限制位點(diǎn)之間的序列。也可使用其它缺失方法，如寡核苷酸指導(dǎo)的“環(huán)出”誘變、PCR重疊延伸、時(shí)間控制的外切核酸酶III消化、大引物(megaprimer)法、反向PCR或者自動(dòng)DNA合成。
可將缺失引入到ADAMTS編碼序列中的任何區(qū)域。修飾的ADAMTS蛋白可通過2個(gè)或更多個(gè)缺失與全長ADAMTS蛋白不同。缺失可發(fā)生在ADAMTS蛋白的相同結(jié)構(gòu)域或不同結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生缺失文庫。缺失文庫可包括N-末端、C-末端或內(nèi)部缺失的ADAMTS蛋白的編碼序列。用于這種目的的示例性的方法描述于Pues，等，NUCLEIC ACIDS RES.，251303-1305(1997)。也可使用商品化的試劑盒，如EZ::TNPlasmid-Based Deletion Machine和pWEB::TNCTMDeletion CosmidTransposition Kit(Epicentre，Madison，WI)以產(chǎn)生ADAMTS缺失文庫。可通過DNA或蛋白測序證實(shí)缺失?？蛇x擇產(chǎn)生有生物活性的軟骨聚集蛋白聚糖酶的缺失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過將突變隨機(jī)引入到片段的編碼序列中來缺失ADAMTS片段。用于該目的的適當(dāng)方法包括，但不限于，飽和誘變。在引入終止密碼子時(shí)，缺失包括位于終止密碼子后的所有殘基。
如上所述，缺失包括用其它殘基或片段替換缺失的氨基酸殘基或片段的情況?？墒褂帽绢I(lǐng)域中的各種已知方法很容易地在編碼序列水平上完成這種替換。也可使用其它適當(dāng)?shù)姆椒?。因此，?dāng)隨機(jī)引入的突變基本上轉(zhuǎn)化所編碼的多肽片段時(shí)，可產(chǎn)生片段的缺失。
缺失的制備不限于使用全長ADAMTS cDNA序列。也可使用已表達(dá)序列標(biāo)志或者其它部分的或不完整的cDNA或mRNA序列制備缺失。另外，可使用基因組序列產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的ADAMTS。此外，可通過修飾剪接受體或供體位點(diǎn)或者ADAMTS編碼序列中的其它功能性內(nèi)含子序列來完成缺失。
也可使用包括遺傳密碼的簡并性或其它變異的序列。由于遺傳密碼的簡并性，有許多編碼相同多肽的多核苷酸變體。這些多核苷酸變體中的一些具有與原始多核苷酸最小的序列同一性。盡管如此，但是本發(fā)明預(yù)期使用由于密碼子選擇的差異而不同的多核苷酸。
可將編碼其它多肽的核酸序列符合讀框地與軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列的5’或3’端融合。這些附加的多肽可以是，例如，肽標(biāo)簽、酶、配體/受體結(jié)合蛋白、抗體或它們的任何組合。
可修飾本發(fā)明的多核苷酸以提高體內(nèi)穩(wěn)定性。可能的修飾包括，但不限于，在5’或3’端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2-o-甲基而不是磷酸二酯鍵；以及包括非傳統(tǒng)堿基，如肌苷、Q核苷(queosine)和wybutosine，以及腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙?；⒓谆?、硫代或其它修飾形式。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA、RNA或其它可表達(dá)的核酸分子。多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是包括與編碼本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的序列可操作地連接的5’或3’非翻譯的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從不經(jīng)歷任何C-末端蛋白水解切割的表達(dá)載體中表達(dá)本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
表達(dá)載體通常包括一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記以及一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，盡管本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在某些系統(tǒng)中可在獨(dú)立的載體上提供選擇性標(biāo)記，以及可通過整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)提供外源DNA的復(fù)制。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)依賴于這些因素，如宿主細(xì)胞或者期望的表達(dá)水平的選擇。啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇性標(biāo)記以及其它元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)的事情。文獻(xiàn)中描述了許多這樣的元件并可通過商品供應(yīng)商獲得。
表達(dá)載體可來自各種來源，如質(zhì)粒、病毒或它們的任意組合。適當(dāng)?shù)牟《据d體包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病素、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、甲病毒、星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳頭多瘤空泡病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、痘病毒或者披膜病毒載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是具有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的大腸桿菌(E.coli)載體。為了符合所需目的，如提高重組蛋白的表達(dá)或溶解度或者幫助其純化，可將編碼附加肽的序列與軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列融合。在一個(gè)實(shí)例中，融合肽可從重組蛋白中切割下來。適于此目的的表達(dá)載體包括，但不限于，pGEX(PharmaciaPiscataway，NJ)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
可使用各種方法使重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)最大化。一個(gè)策略是使用蛋白水解切割重組蛋白的能力損害的宿主細(xì)菌。另一個(gè)策略是改變編碼序列從而使得每個(gè)氨基酸的單個(gè)密碼子優(yōu)先被大腸桿菌利用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。示例性的酵母表達(dá)載體包括，但不限于，pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)以及picZ(Invitrogen Corp，San Diego，CA)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體。常用的昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體包括桿狀病毒表達(dá)載體，如pAc和pVL系列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。合適的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括，但不限于，pCDM8、pMT2PC、pJL3、pJL4、pMT2 CXM以及pEMC2β1。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用時(shí)，經(jīng)常由病毒調(diào)節(jié)元件提供表達(dá)控制序列。例如，通常在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中使用來自多形瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒或猿猴病毒40的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體也可包括組織特異性調(diào)節(jié)元件。合適的組織特異性啟動(dòng)子包括，但不限于，肝特異性啟動(dòng)子、淋巴特異性啟動(dòng)子、T細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子、胰特異性啟動(dòng)子以及乳腺特異性啟動(dòng)子。另外，本發(fā)明預(yù)期使用發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，如甲胎蛋白啟動(dòng)子。已在許多組織和在各種發(fā)育階段檢測到了ADAMTS的表達(dá)。例如，RNA印跡分析表明ADAMTS-9在成人心臟、胎盤和骨骼肌中高度表達(dá)，但在脾、胸腺、前列腺、睪丸、小腸和外周血白細(xì)胞中低至不可檢測到的水平。見Somerville，等，J.BIOL.CHEM.，2789503-9513(2003)。RT-PCR分析也在卵巢、胰、肺和腎中檢測到ADAMTS-9的表達(dá)。在發(fā)育期間，ADAMTS-9的表達(dá)在7天和17天齡的小鼠胚胎中高，而在11天和15天齡的小鼠胚胎中更低。同樣地，已在多種組織，如腦、心、肺、肝、胰、腎、骨骼肌和胎盤中檢測到ADAMTS-7。見Hurskainen，等，見上。組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的使用允許ADAMTS蛋白的更特異的功能分析。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括反義方向的ADAMTS編碼序列?？蛇x擇與反義方向的編碼序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列以指導(dǎo)反義RNA分子在各種細(xì)胞類型中的連續(xù)表達(dá)。合適的調(diào)節(jié)序列包括病毒啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。也可選擇調(diào)節(jié)序列以指導(dǎo)反義RNA的組成型或組織特異性表達(dá)。
此外，本發(fā)明預(yù)期使用可調(diào)節(jié)的表達(dá)系統(tǒng)在許多類型的細(xì)胞中表達(dá)軟骨聚集蛋白聚糖酶。適合于此目的的系統(tǒng)包括，但不限于，Tet-開/關(guān)系統(tǒng)、蛻皮激素系統(tǒng)、孕酮系統(tǒng)和雷帕霉素系統(tǒng)。Tet-開/關(guān)系統(tǒng)基于來自大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性操縱子的兩個(gè)調(diào)節(jié)元件。該系統(tǒng)包括兩個(gè)組分調(diào)節(jié)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒。調(diào)節(jié)質(zhì)粒編碼含有與單純皰疹病毒的VP16活化結(jié)構(gòu)域融合的突變的Tet阻遏物(rtetR)的雜合蛋白。報(bào)告質(zhì)粒含有控制報(bào)告基因表達(dá)的tet-反應(yīng)元件(TRE)。rtetR-VP16融合蛋白結(jié)合TRE，因此在存在四環(huán)素時(shí)激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄?？蓪et-開/關(guān)系統(tǒng)摻入到各種病毒載體中，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或AAV載體。
蛻皮激素系統(tǒng)基于果蠅(Drosophila)中的蛻皮誘導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用muristerone A，一種果蠅類固醇激素蛻皮激素的類似物，以通過異二聚體核受體激活基因表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)的表達(dá)水平可為基本水平的至少200倍，而不顯著影響轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生理學(xué)。
孕酮系統(tǒng)基于孕酮受體的作用。孕酮受體是核/類固醇受體超家族的成員。在結(jié)合于其激素配體(如孕酮)后，該受體便結(jié)合孕酮反應(yīng)元件，從而激活基因轉(zhuǎn)錄?？赏ㄟ^結(jié)合于米非司酮(RU486)，即一種孕酮拮抗劑，來阻斷孕酮受體的作用?？赏ㄟ^將孕酮受體的RU486-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與酵母GAL4 DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HSV VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，來制備嵌合的轉(zhuǎn)錄因子。嵌合因子在不存在RU486時(shí)無活性。然而，添加RU486誘導(dǎo)構(gòu)象變化，其反過來激活嵌合因子并允許從含有GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
雷帕霉素系統(tǒng)，也稱作CID系統(tǒng)(“二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)物”)，使用由雷帕霉素引起的二聚化活性。雷帕霉素誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞蛋白FKBP12和FRAP的異二聚體化。雷帕霉素系統(tǒng)使用兩個(gè)嵌合蛋白。第一個(gè)嵌合蛋白包括與結(jié)合DNA反應(yīng)元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的FKBP12。第二個(gè)嵌合蛋白包括與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合的FRAP。雷帕霉素的加入引起兩個(gè)嵌合蛋白的二聚化，從而激活由DNA反應(yīng)元件控制的基因轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)截短的有生物活性的ADAMTS蛋白的方法，優(yōu)選地為具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些。例如，可在生產(chǎn)截短的ADAMTS蛋白(例如，SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、4-16和18-20)的條件下，培養(yǎng)用在表達(dá)控制序列控制下的本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQ ID NOs21-35)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞系。將蛋白從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收并純化，從而使得該蛋白基本上無其它蛋白。表達(dá)和純化重組蛋白的一般方法是本領(lǐng)域公知的。
許多細(xì)胞系可作為適于截短的ADAMTS蛋白多肽重組表達(dá)的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括，例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293T細(xì)胞、A431細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、L細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、U937細(xì)胞、HaK細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞，以及來自原代組織和原代外植塊的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株。
也可在昆蟲細(xì)胞中重組產(chǎn)生截短的ADAMTS蛋白，如Sf9細(xì)胞和果蠅S2細(xì)胞。用于Sf9和S2表達(dá)的材料和方法可通過商業(yè)途徑以試劑盒的形式獲得(例如，分別為MaxBac試劑盒和DES試劑盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
可選擇地，可能在更低等的真核生物如酵母或在原核生物中重組生產(chǎn)截短的ADAMTS蛋白。潛在合適的酵母株包括Sshizosaccharomyces cerevisiae、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維氏酵母(Kluyveromyces)株和假絲酵母(Candida)株。潛在合適的細(xì)菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。如果在酵母或細(xì)菌中生產(chǎn)截短的ADAMTS蛋白，那么為了獲得功能性，可能必須通過，例如，適當(dāng)位點(diǎn)的磷酸化或糖基化來修飾它們?？墒褂霉幕瘜W(xué)的或酶促法完成這種共價(jià)附著。
可將附加多肽融合到本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的N-或C-末端?？衫酶鞣N方法制備融合蛋白。融合的多肽便于蛋白純化、檢測、固定、折疊、尋靶作用，或其它期望的目的。融合的多肽也可用于提高重組蛋白的表達(dá)、溶解度或穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合的多肽不顯著影響軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水解活性。
適于制備融合蛋白的示例性多肽包括，但不限于，肽標(biāo)簽、酶、抗體、受體、配體/受體結(jié)合蛋白，或者它們的任何組合。如這里所使用的，抗體可以是，例如，多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人類的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、移植的或者體外所產(chǎn)生的抗體?？贵w也可以是Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb或保留抗原結(jié)合功能的任何其它抗體片段。
適合于本發(fā)明的肽標(biāo)簽包括，但不限于，聚組氨酸或聚組氨酸-甘氨酸標(biāo)簽、FLAG附加表位、KT3表位肽、flu HA標(biāo)簽多肽、c-myc標(biāo)簽、單純皰疹糖蛋白D、β-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)簽、微管蛋白表位肽、T7基因10蛋白肽標(biāo)簽和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。可很容易獲得抗這些肽標(biāo)簽的抗體。代表性的抗體包括抗flu HA標(biāo)簽多肽的抗體12CA5以及抗c-myc標(biāo)簽的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，融合的多肽與天然存在的ADAMTS序列基本上沒有序列同一性或相似性。例如，融合的多肽與天然存在的全長ADAMTS蛋白的序列同一性或相似性低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％?？赏ㄟ^使用，例如，GCGBESTFIT(Smith-Waterman算法)確定序列同一性或相似性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將Strep-標(biāo)簽(IBA)共價(jià)附著到本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的C-末端。Strep-標(biāo)簽具有氨基酸序列“WSHPQFEK”(SEQ ID NO36的氨基酸殘基4-11)，其由例如核苷酸TGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA(SEQ ID NO37)編碼?？稍跇?biāo)簽和軟骨聚集蛋白聚糖酶之間加入肽接頭(例如，“GSA”)以提高標(biāo)簽的可接近性，以產(chǎn)生由核苷酸GGAAGCGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA(SEQ IDNO39)編碼的GSAWSHPQFEK(SEQ ID NO38)。
SEQ ID NO40-44顯示示例性融合蛋白的氨基酸序列，其包括分別在C-末端與Strep-標(biāo)簽共價(jià)連接的修飾的ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18。
可在融合的多肽和軟骨聚集蛋白聚糖酶之間的連接處引入蛋白水解切割位點(diǎn)。在重組蛋白純化后，切割位點(diǎn)使軟骨聚集蛋白聚糖酶從融合的多肽上分離。適合此目的的切割酶包括，但不限于，因子Xa、凝血酶和腸激酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在相同蛋白中包括本發(fā)明軟骨聚集蛋白聚糖酶的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。這種融合蛋白可具有提高的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
截短的ADAMTS蛋白也可用小的表位標(biāo)記，隨后使用表位的特異性抗體鑒別或純化。優(yōu)選的表位是FLAGTM表位，其可商購自Eastman Kodak(New Haven，CT)。另外，可將截短的ADAMTS蛋白表達(dá)為6xHis-標(biāo)記的蛋白，以使用金屬螯合物親和層析進(jìn)行純化。用于His-標(biāo)記的蛋白表達(dá)和純化的材料和方法可通過商業(yè)途徑以試劑盒形式獲得(例如，QIAexpress系統(tǒng)，Qiagen，Valencia，CA)。
也可通過已知的常規(guī)化學(xué)合成生產(chǎn)截短的ADAMTS蛋白?；瘜W(xué)合成多肽的方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。這種化學(xué)合成的多肽可具有與天然的、純化的多肽相同的生物學(xué)特性，并因此可用作天然多肽的有生物活性的或免疫學(xué)替代品。
ADAMTS蛋白(具體地為軟骨聚集蛋白聚糖酶)的抗體分子可商購自，例如，Cedarlane Laboratories，Ontario，加拿大；Triple Point Biologics，F(xiàn)orest Grove，OR；以及Acris GmbH，Hiddenhausen，德國。這種抗體應(yīng)當(dāng)識別本發(fā)明的截短的ADAMTS蛋白，前提是它們針對蛋白的成熟N-末端(未截短的部分)制備?？蛇x擇地，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法生產(chǎn)特異性識別本發(fā)明截短的ADAMTS蛋白的抗體。
例如，可通過用截短的ADAMTS蛋白免疫適當(dāng)?shù)氖茉囌邅砩a(chǎn)多克隆血清和抗體?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如用使用固定的標(biāo)記蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)隨時(shí)間推移監(jiān)控所免疫的受試者中的抗體效價(jià)。如果期望的話，可將抗體分子從受試者或培養(yǎng)基中分離并通過已知技術(shù)，如A蛋白或G蛋白層析法進(jìn)一步純化以獲得IgG級分。
可根據(jù)已知方法通過產(chǎn)生雜交瘤，來生產(chǎn)識別截短的ADAMTS蛋白的單克隆抗體。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法，如ELISA，篩選以這種方式形成的雜交瘤，以鑒別一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生特異性識別該蛋白的抗體的雜交瘤。整個(gè)截短的ADAMTS蛋白可用作免疫原，或者，可選擇地，可使用蛋白的抗原性肽片段。另外，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試劑盒和方法生產(chǎn)本發(fā)明截短的ADAMTS蛋白的重組單特異性抗體。
一旦蛋白經(jīng)過純化，則可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如SDS-PAGE或免疫印跡進(jìn)行分析和證實(shí)。SDS-PAGE可用考馬斯藍(lán)、銀或其它適當(dāng)?shù)脑噭┤旧燥@現(xiàn)純化的蛋白。純化的蛋白可通過蛋白測序或質(zhì)譜法進(jìn)一步分析。在一個(gè)實(shí)例中，從SDS-PAGE上人工切下目的蛋白條帶，然后進(jìn)行還原、烷基化以及用胰蛋白酶或內(nèi)肽酶Lys-C(Promega，Madison，WI)消化。可使用自動(dòng)凝膠內(nèi)消化自動(dòng)機(jī)在原位進(jìn)行消化。消化后，可濃縮肽提取物并通過微量電噴射反相HPLC進(jìn)行分離?？稍贔innigan LCQ離子阱質(zhì)譜儀(ThermoQuest，San Jose，CA)上進(jìn)行肽分析。可使用整合到Finnigan Bioworks數(shù)據(jù)分析包(ThermoQuest，San Jose，CA)內(nèi)的SEQUEST計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行MS/MS數(shù)據(jù)的自動(dòng)分析。
也可用免疫印跡如蛋白印跡對純化的軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白進(jìn)行分析或證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將SDS-PAGE中的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后通過抗體進(jìn)行檢測。在一個(gè)實(shí)例中，使用抗修飾的ADAMTS的兔抗體，隨后用山羊抗兔IgG-HRP和化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，Milwaukee，WI)檢測純化的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用無細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)軟骨聚集蛋白聚糖酶。合適的無細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)包括，但不限于，麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物或HeLa核提取物。
本發(fā)明的截短的ADAMTS優(yōu)選地具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性?？衫迷S多測定檢測本發(fā)明的截短的ADAMTS的生物學(xué)活性。示例性的測定包括，但不限于，熒光肽測定、新表位蛋白印跡、軟骨聚集蛋白聚糖ELISA和活性測定。前兩個(gè)測定適于檢測在軟骨聚集蛋白聚糖的IGD中Glu373-Ala374鍵處的切割能力。
在熒光肽測定中，將軟骨聚集蛋白聚糖酶與含有軟骨聚集蛋白聚糖酶切割位點(diǎn)上的氨基酸序列的合成肽一起溫育。將合成肽的N-末端或C-末端用熒光團(tuán)標(biāo)記而另一個(gè)末端包括猝滅劑。肽的切割將熒光團(tuán)和猝滅劑分離，從而引起熒光。相對熒光可用于測定所表達(dá)的軟骨聚集蛋白聚糖酶的相對活性。
在新表位蛋白印跡中，將軟骨聚集蛋白聚糖酶與完整的軟骨聚集蛋白聚糖一起溫育。然后在通過SDS-PAGE分離前，將切割產(chǎn)物進(jìn)行幾個(gè)生物化學(xué)處理。生物化學(xué)處理包括，例如，透析、軟骨素酶(chondroitinase)處理、冷凍干燥以及重構(gòu)。將SDS-PAGE中的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到膜(如硝酸纖維素紙)上，并用新表位特異性抗體染色。新表位抗體特異性識別通過軟骨聚集蛋白聚糖的蛋白水解切割所暴露的新的N-或C-末端氨基酸序列。抗體不結(jié)合原始的或未切割的分子上的這種表位。合適的新表位特異性抗體包括，但不限于，MAb BC-13、MAb BC-3和I19C抗體。見，例如，Caterson，等，見上；和Hashimoto，等，F(xiàn)EBS LETTERS，494192-195(2001)?？墒褂脡A性磷酸酶綴合的第二抗體和氮藍(lán)四唑色原和溴氯吲哚磷酸底物(NBT/BCIP)顯現(xiàn)切割的軟骨聚集蛋白聚糖片段。條帶的相對密度表示相對的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
可使用軟骨聚集蛋白聚糖ELISA檢測軟骨聚集蛋白聚糖分子中的任何切割。在該測定中，將修飾的蛋白與先前已附著到塑料孔上的完整的軟骨聚集蛋白聚糖溫育。將孔洗滌，且然后與檢測軟骨聚集蛋白聚糖的抗體溫育。用第二抗體使孔顯色。如果最初量的軟骨聚集蛋白聚糖保留在孔中，那么抗體染色將會是濃的。如果軟骨聚集蛋白聚糖被軟骨聚集蛋白聚糖酶消化，那么附著的軟骨聚集蛋白聚糖分子將離開孔，從而減少隨后抗體的染色。該測定可檢測修飾的蛋白能否切割軟骨聚集蛋白聚糖。也可使用該測定來測定修飾的蛋白的相對切割活性。
也可使用活性測定來評估軟骨聚集蛋白聚糖酶的切割活性。在該測定中，首先用透明質(zhì)酸(ICN)，隨后用軟骨素酶處理的牛軟骨聚集蛋白聚糖包被微量滴定板。軟骨素酶可購自SeikagakuChemicals。向軟骨聚集蛋白聚糖包被的板添加含有所表達(dá)的重組軟骨聚集蛋白聚糖酶的培養(yǎng)基。洗去在IGD內(nèi)的Glu373-Ala374處被切割的軟骨聚集蛋白聚糖?？捎?B3抗體(ICN)，隨后用抗-IgM-HRP第二抗體(Southern Biotechnology)檢測剩余的未切割的軟骨聚集蛋白聚糖。可使用，例如，3，3″，5，5″-四甲聯(lián)苯胺(TMB，BioFxLaboratories)獲得最終的顯色。
在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有改良的穩(wěn)定性和增加的表達(dá)。這允許大量分離軟骨聚集蛋白聚糖酶，從而便于軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的開發(fā)。
可使用任何適當(dāng)?shù)暮Y選測定開發(fā)抑制劑。一般地，篩選方法包括在存在或不存在目的化合物時(shí)將軟骨聚集蛋白聚糖酶與軟骨聚集蛋白聚糖酶底物接觸。然后測量軟骨聚集蛋白聚糖酶的切割活性以確定目的化合物的抑制作用。見，例如，Hashimoto，等，見上。在一個(gè)實(shí)施方案中，用高通量方法或化合物文庫篩選抑制劑。在它們表達(dá)和純化后，可在篩選測定中使用截短的有生物活性的ADAMTS蛋白以鑒別能調(diào)節(jié)ADAMTS活性的藥學(xué)試劑或主要化合物(leadcompound)。例如，可將含有純化的截短的ADAMTS蛋白的樣品與多個(gè)測試化合物(例如，小的有機(jī)分子、生物試劑)中的一個(gè)接觸，并將ADAMTS蛋白的活性(例如，hyelectanase活性、軟骨聚集蛋白聚糖酶活性、α2-巨球蛋白切割活性)與未接觸的蛋白或與不同測試化合物接觸的蛋白的活性比較，以測定測試化合物中的任何一種是否提供1)基本上降低的ADAMTS活性水平，從而表明是ADAMTS活性的抑制劑；或2)基本上提高的ADAMTS活性水平，從而表明是ADAMTS活性的活化劑。
優(yōu)選地，純化的截短的ADAMTS蛋白具有hyelectanase活性，且更優(yōu)選地，軟骨聚集蛋白聚糖切割活性，并且用于上述篩選測定以鑒別hyelectanase和/或軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的抑制劑。使用類似的篩選測定已鑒別了幾個(gè)選擇性的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑(見，例如，Cherney等，Bioorg.Med.Chem.Lett.12101(2002)；Yao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.131297(2003)；Yao等，J.Med．Chem.443347(2001))。軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的測定是本領(lǐng)域公知的，且包括軟骨聚集蛋白聚糖-聚丙烯酰胺顆粒測定(Vankemmelbeke等，Eur.J.Biochem.2702394(2003))和通過SDS-PAGE檢測軟骨聚集蛋白聚糖核心蛋白片段(Hashimoto等，F(xiàn)EBSLett.494192(2001))。
優(yōu)選地，上述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性測定是免疫測定。這種免疫測定利用特異性識別由截短的ADAMTS蛋白的酶促活性所產(chǎn)生的軟骨聚集蛋白聚糖新表位(優(yōu)選在軟骨聚集蛋白聚糖的Glu373-Ala374位置)的抗體。這種抗體，例如BC-3(其識別N-末端新表位374ARGSV)和BC-13(其識別C-末端新表位ITEGE373)，是本領(lǐng)域公知的(Hughes等，Biochem.J.305799(1995))或可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法生產(chǎn)，并且可用于通過蛋白印跡和ELISA檢測軟骨聚集蛋白聚糖切割產(chǎn)物(見，例如，Miller等，Anal.Biochem.314260(2003)；Hughes等，J.Biol.Chem.27220269(1997))。
可根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法制備通過上述篩選測定鑒定的化合物(特別是抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些)，并且在體內(nèi)以藥物組合物的形式施用，以用于治療關(guān)節(jié)炎和其它炎性障礙。藥物組合物可以以本領(lǐng)域公知的任何途徑施用，包括，但不限于，關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)鼻、直腸、局部、舌下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、腹膜內(nèi)以及經(jīng)皮途徑。除了活性成分外，藥物組合物可含有藥學(xué)上可接受的載體，包括，例如，本領(lǐng)域公知的賦形劑、包衣以及輔助劑(auxiliaries)。
也可使用三維結(jié)構(gòu)分析或計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)鑒定或設(shè)計(jì)抑制劑。后一方法可能需要基于軟骨聚集蛋白聚糖酶或軟骨聚集蛋白聚糖的三維結(jié)構(gòu)測定抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，然后開發(fā)與軟骨聚集蛋白聚糖酶或軟骨聚集蛋白聚糖上的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的分子。隨后測定候選分子的抑制活性。也可使用適于開發(fā)蛋白酶抑制劑的其它常規(guī)方法以鑒定軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。
軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑可以是，例如，蛋白、肽、抗體、小分子或化合物。抑制劑可產(chǎn)生軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水解活性的降低、減少或消除?？赏ㄟ^上述測定測量軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的降低、減少或消除。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的抑制劑可將軟骨聚集蛋白聚糖酶活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在另一個(gè)實(shí)例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑特異性降低或消除軟骨聚集蛋白聚糖酶，但不是其它蛋白酶，如MMPs的酶促活性。在另一個(gè)實(shí)例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑降低或消除特異性ADAMTS蛋白，但不是其它ADAMTS蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
各種疾病或狀況的特征是軟骨聚集蛋白聚糖的降解?？稍谶@些疾病或狀況的治療中使用通過本發(fā)明所鑒定的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。預(yù)期可通過使用軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑治療的疾病包括，但不限于，骨關(guān)節(jié)炎、癌癥、炎性關(guān)節(jié)病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、牙周病、角膜潰瘍、蛋白尿、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂引起的冠狀血栓形成、主動(dòng)脈瘤疾病(aneurysmal aortic disease)、炎性腸病、Crohn氏病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、阿爾茨海默病、腦和造血惡性腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、帕金森氏病、偏頭痛、抑郁癥、周圍神經(jīng)病、Huntington氏病、多發(fā)性硬化、眼血管發(fā)生、黃斑變性、主動(dòng)脈瘤心肌梗死、自身免疫性疾病、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷后的退行性軟骨喪失、頭部創(chuàng)傷、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、脊髓損傷、急性和慢性神經(jīng)變性病、骨量減少、顳頜關(guān)節(jié)病、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病、器官移植毒性和排斥、惡病質(zhì)、變態(tài)反應(yīng)、組織潰瘍、再狹窄，以及以胞外基質(zhì)的異常降解、改變的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性或改變的軟骨聚集蛋白聚糖酶水平為特征的其它疾病。
如這里所使用的，治療包括治療性處理或者預(yù)防性的或預(yù)防性措施。需要治療的那些可包括已患有具體醫(yī)學(xué)障礙的個(gè)體以及可能最終獲得障礙的那些(即，需要預(yù)防性措施的那些)。治療可調(diào)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖酶活性或軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水平以預(yù)防或改善疾病的臨床癥狀。抑制劑可通過，例如，阻止軟骨聚集蛋白聚糖酶和軟骨聚集蛋白聚糖之間的相互作用，或者降低或消除蛋白水解活性來發(fā)揮功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以藥物組合物向患者或動(dòng)物施用本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。藥物組合物包括足以治療患者或動(dòng)物的有效量的抑制劑。藥物組合物也可包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體可包括與藥物施用相容的溶劑、增溶劑、填充物、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)(bases)、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌或抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)上有效的物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。也可將補(bǔ)充試劑摻入到組合物中。
可配制藥物組合物以與其打算的施用途徑相容。施用途徑的舉例包括腸胃外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、吸入、經(jīng)皮、直腸、跨粘膜、局部以及全身施用。在一個(gè)實(shí)例中，通過使用植入物施用。
用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括下列成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及滲漲度調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡萄糖?？捎盟峄驂A調(diào)整pH，如鹽酸或氫氧化鈉?？蓪⒛c胃外制劑封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或者多劑小瓶。
可向患者或動(dòng)物施用藥物組合物，從而使得軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑以足夠的量降低或消除靶定的軟骨聚集蛋白聚糖的活性。軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的適當(dāng)治療劑量范圍可以是，例如，5mg-100mg、15mg-85mg、30mg-70mg或者40mg-60mg。也可使用低于5mg或高于100mg的劑量?？梢砸詥蝿┗蚨鄤┦┯靡种苿?。劑量可在如每日一次、每周一次或每月一次的時(shí)間間隔施用?？苫?，例如，抑制劑與其軟骨聚集蛋白聚糖酶靶的親和力、抑制劑的半衰期以及患者狀況的嚴(yán)重程度調(diào)整軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑施用的劑量時(shí)間表。在一個(gè)實(shí)施方案中，以快速灌注給藥(bolus dose)施用抑制劑，以使它們的循環(huán)水平最大化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在快速灌注給藥后使用連續(xù)輸注。
可通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測定軟骨聚集蛋白聚糖酶化合物的毒性和治療功效。例如，可測定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，且可表示為比率LD50/ED50。在一個(gè)實(shí)例中，選擇顯示高治療指數(shù)的抑制劑。
可在配制用于人的劑量范圍中使用從細(xì)胞培養(yǎng)物測定和動(dòng)物研究中所獲得的數(shù)據(jù)。這些化合物的劑量可能在顯示具有小的毒性或無毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可在該范圍內(nèi)變化，這依賴于所使用的劑量形式和所利用的施用途徑。對于根據(jù)本發(fā)明所使用的任何抑制劑，可從細(xì)胞培養(yǎng)物測定中初步估計(jì)治療有效劑量。可在動(dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到顯示如通過細(xì)胞培養(yǎng)物測定所測定的IC50(即，達(dá)到癥狀的最大半數(shù)抑制的測試抑制劑的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。例如，可通過高效液相層析測量血漿中的水平。可通過適當(dāng)?shù)纳餃y定監(jiān)控任何特定劑量的效果。適當(dāng)生物測定的實(shí)例包括DNA復(fù)制測定、基于轉(zhuǎn)錄的測定、GDF蛋白/受體結(jié)合測定、肌酸激酶測定、基于前脂肪細(xì)胞分化的測定、基于脂肪細(xì)胞中葡萄糖攝取的測定以及免疫學(xué)測定。
可由主治醫(yī)師根據(jù)修飾軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白作用的各種因素、病理學(xué)部位、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡、性別和飲食、任何炎癥的嚴(yán)重程度、施用時(shí)間以及其它臨床因素確定組合物施用的劑量方案。通常，將以最小有效的劑量開始全身性或可注射的施用，且將在預(yù)選的時(shí)程提高劑量直到觀察到陽性效果。隨后，當(dāng)考慮可能出現(xiàn)的任何副作用時(shí)，劑量的遞增增加將限于產(chǎn)生效果相應(yīng)提高的水平。向最終的組合物添加其它已知因子也可影響劑量。
可通過疾病進(jìn)展的周期性評估監(jiān)控進(jìn)展?？赏ㄟ^例如，X-射線、MRI或其它成像形式、滑液分析或者臨床檢查來監(jiān)控進(jìn)展。
在疾病是由軟骨聚集蛋白聚糖或其它胞外基質(zhì)蛋白的累積所致的情況中，可將本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶引入患該病的人或動(dòng)物以糾正這種缺陷。這樣引入的軟骨聚集蛋白聚糖酶應(yīng)當(dāng)有對爭論的胞外基質(zhì)蛋白的蛋白水解活性。向人或動(dòng)物施用治療性蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的。適當(dāng)?shù)姆椒òㄉ鲜瞿切?。另外，可使用基于基因治療的方法?br> 可在檢測的測定和方法中使用本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑以測定樣品中存在或不存在軟骨聚集蛋白聚糖酶，或者測定軟骨聚集蛋白聚糖酶的量。檢測的測定或方法可以是體內(nèi)或體外的。通過將這些蛋白的存在或水平與疾病相聯(lián)系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可診斷相關(guān)的疾病或確定其嚴(yán)重程度。可通過目前所公開的抑制劑所診斷的疾病如上所述。
如果打算將抑制劑用于診斷目的，那么可能期望修飾它們；例如，用配體基團(tuán)(如生物素或具有特異性結(jié)合配偶體的其它分子)或者檢測標(biāo)記基團(tuán)(如熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射性原子、密電子試劑或酶)。具有特異性結(jié)合配偶體的分子包括，例如，生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和A蛋白以及本領(lǐng)域已知的大量受體-配體偶。一般地通過它們的活性檢測酶。例如，可通過其將四甲聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶，所述色素可用分光光度計(jì)定量。
應(yīng)當(dāng)理解的是，上述實(shí)施方案和下列實(shí)施例是通過舉例說明，而不是限制的方式給予的。本發(fā)明范圍內(nèi)的各種改變和修飾根據(jù)本說明書對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1.截短的ADAMTS的構(gòu)建
在圖1中描述了代表性的全長ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的全部結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。與其它全長ADAMTS家族成員一樣，ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18具有信號肽(SP)、前肽(Pro)、催化結(jié)構(gòu)域(Cat結(jié)構(gòu)域)、解整連蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Disint)、血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)(Tsp)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)構(gòu)域(富含Cys)、間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域(間隔區(qū))以及可變數(shù)目的羧基末端血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)(T)。ADAMTS-7進(jìn)一步含有位于第三和第四羧基末端血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)之間的一個(gè)附加間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域。在圖1中顯示中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)后空間上保守的苯丙氨酸殘基，對于ADAMTS-7是Phe599、對于ADAMTS-9是Phe649、對于ADAMTS-10是Phe608、對于ADAMTS-16是Phe647和對于ADAMTS-18是Phe650。
在圖2中舉例說明5種截短的ADAMTS-7(A7FS)、ADAMTS-9(A9FS)、ADAMTS-10(A10FS)、ADAMTS-16(A16FS)和ADAMTS-18(A18FS)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。每種截短都包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基的缺失。將Step-標(biāo)簽添加到每個(gè)截短的ADAMTS的C-末端以幫助蛋白純化。在SEQ IDNOs41-45中分別描述A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的氨基酸序列。
可使用PCR制備A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的DNA編碼序列。可從人ADAMTS-7(GenBank登記號No.AF140675)、ADAMTS-9(GenBank登記號No.AF261918)、ADAMTS-10(GenBank登記號No.NP_112219)、ADAMTS-16(GenBank登記號No.NP_620687)和ADAMTS-18(GenBank登記號No.NP_955387)的公開序列中設(shè)計(jì)PCR引物。在一個(gè)實(shí)例中，可使用Advantage-GC PCR試劑盒(Clontech)從適當(dāng)?shù)娜薱DNA文庫(例如，心臟、骨骼肌、腎或胰cDNA文庫)中擴(kuò)增A7FS或A9FS的編碼序列。反應(yīng)條件可以是由生產(chǎn)商推薦的那些。在某些情況中，反應(yīng)條件包括下列例外所用的GC Melt的量是每50μl反應(yīng)物10μl；所用的Not I線性化文庫的量是0.2ng/μl反應(yīng)物；以及所用的每個(gè)寡核苷酸(oligo)的量是2pmol/μl反應(yīng)物。循環(huán)條件如下95℃1分鐘，1個(gè)循環(huán)；隨后是由95℃15秒鐘/68℃2分鐘組成的30個(gè)循環(huán)。
用于PCR擴(kuò)增的5′引物可在ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18編碼序列的起始密碼子(ATG)的上游摻入EcoR I位點(diǎn)(GAATTC)和修飾的Kozak序列(CCACC)。用于PRC擴(kuò)增的3′引物可摻入編碼接頭“GSA”的附加序列、Step標(biāo)簽、終止密碼子(例如，TAA)和NotI位點(diǎn)(GCGGCCGC)。可在保守的苯丙氨酸殘基密碼子的下游添加附加序列。分離具有適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物，且然后用EcoRI和NotI消化。將消化后的產(chǎn)物連接到包括相同限制位點(diǎn)的表達(dá)載體內(nèi)?？蓪寺〉腜CR片段進(jìn)行測序以證實(shí)它們的特性。
在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)載體是CHO細(xì)胞表達(dá)載體，如pTmed載體，其序列如SEQ ID NO8所示。
實(shí)施例2.截短的ADAMTS的表達(dá)和純化
使用生產(chǎn)商所推薦的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染方案(In Vitrogen的Lipofectin)，將含有A7FS、A9FS、A10FS、A16FS或A18FS序列的pTmed載體轉(zhuǎn)染到CHO/DUKX細(xì)胞中。將克隆在0.02μM氨甲蝶呤中進(jìn)行選擇。當(dāng)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，挑取克隆并擴(kuò)增形成細(xì)胞系。
通過使用與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗鏈霉抗生物素蛋白抗體(Southern Biotech)的蛋白印跡，隨后通過ECL化學(xué)發(fā)光(Amersham Biosciences)和放射自顯影術(shù)監(jiān)控CHO條件培養(yǎng)基中的重組蛋白，來選擇表達(dá)最高水平的重組蛋白的細(xì)胞系。
通過超濾和在Strep-Tactin柱(IBA)上親和純化的組合來純化重組蛋白。通過利用10,000 MWCO濾器的超濾法將CHO條件培養(yǎng)基濃縮大約35倍。然后將條件培養(yǎng)基滯留物(retentate)應(yīng)用到Strep-Tactin親和柱中。根據(jù)生產(chǎn)商推薦的方案，通過應(yīng)用多個(gè)等分試樣的洗滌緩沖液從柱中除去非特異性結(jié)合的蛋白。通過添加脫硫生物素從柱上洗脫重組蛋白。
實(shí)施例3.A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的檢測
通過將牛軟骨聚集蛋白聚糖與純化的重組蛋白溫育，隨后通過消化物的SDS-PAGE分級分離和蛋白印跡分析測定軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。用C1單克隆抗體(C1 MAb)探測蛋白印跡，所述抗體特異性識別由軟骨聚集蛋白聚糖的蛋白水解所產(chǎn)生的新表位(即，軟骨聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374鍵切割后約70kDa的具有G1的產(chǎn)物的羧基末端序列...NITEGE373(SEQ ID NO9))。通過與NBT/BCIP底物(Promega)溫育顯現(xiàn)C1 MAb。
圖8A-8E分別顯示用重組A7FS蛋白、A9FS蛋白、A10FS蛋白、A16FS和A18FS蛋白消化牛軟骨聚集蛋白聚糖。將消化后的蛋白在SDS-PAGE上分級分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜用于蛋白印跡分析。陰性對照是無重組蛋白的牛軟骨聚集蛋白聚糖。陽性對照是重組軟骨聚集蛋白聚糖酶1蛋白(ADAMTS-4)。
實(shí)施例4.C1 MAb的產(chǎn)生
將合成肽CGGPLPRNITEGE(SEQID NO46)與載體蛋白KLH偶聯(lián)，且使用該綴合物作為免疫原用于通過標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體。簡要地，用溶于完全弗氏佐劑的20μg免疫原皮下免疫BALB/c小鼠。使用溶于不完全弗氏佐劑的肽重復(fù)注射2次(每2周一次)。在所免疫的小鼠上進(jìn)行試驗(yàn)放血，并通過ELISA評價(jià)血清對免疫肽和ADAMTS-4消化的牛關(guān)節(jié)軟骨軟骨聚集蛋白聚糖的反應(yīng)性(Flannery等，見上)。在雜交瘤融合前三天，給予顯示最高抗體效價(jià)的小鼠最后一次無佐劑的免疫。從該小鼠分離脾細(xì)胞并與FO骨髓瘤細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)融合并在HAT選擇培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培養(yǎng)。通過ELISA篩選抗KLH和KLH-CGGPLPRNITEGE抗原的雜交瘤培養(yǎng)物上清液，以及通過蛋白印跡篩選抗ADAMTS-4消化的軟骨聚集蛋白聚糖的雜交瘤培養(yǎng)物上清液。通過有限稀釋選擇用于亞克隆的陽性雜交瘤克隆。將稱為C1 MAb的單雜交瘤細(xì)胞系在培養(yǎng)物中擴(kuò)增。使用小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(Roche，Indianapolis，IN)確定抗體同種型是IgG1(κ輕鏈)，并通過A蛋白親和層析從1升培養(yǎng)基中純化IgG。
實(shí)施例5.載體表達(dá)
也可以在本發(fā)明中使用p91023(b)的衍生物哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pMT2 CXM。pMT2 CXM載體不同于p91023(b)，因?yàn)榍罢吆刑娲沫h(huán)素抗性基因的氨芐青霉素抗性基因并且進(jìn)一步含有用于cDNA克隆插入的Xho I位點(diǎn)。pMT2 CXM的功能元件包括腺病毒VA基因、SV40復(fù)制起點(diǎn)(包括72 bp的增強(qiáng)子)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(包括5′剪接位點(diǎn)和在腺病毒晚期mRNAs上存在的腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列的大多數(shù))、3′剪接受體位點(diǎn)、DHFR插入片段、SV40早期聚腺苷酸化位點(diǎn)(SV40)以及在大腸桿菌中增殖必需的pBR322序列。
通過已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD(美國)保藏，登記號為ATCC 67122的pMT2-VWF的EcoRI消化，獲得質(zhì)粒pMT2 CXM。EcoR I消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入片段，從而產(chǎn)生可被連接并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性的線性形式pMT2?？赏ㄟ^常規(guī)方法制備質(zhì)粒pMT2 DNA。然后使用環(huán)出/環(huán)入誘變構(gòu)建pMT2 CXM。這除去SV40復(fù)制起點(diǎn)附近與Hind III位點(diǎn)相關(guān)的第1075-1145位堿基以及pMT2的增強(qiáng)子序列。另外，其插入含有限制性內(nèi)切核酸酶XhoI識別位點(diǎn)的序列。pMT2CXM的衍生物，稱作pMT23，含有限制性內(nèi)切核酸酶PstI、EcoRI、SalI和XhoI的識別位點(diǎn)?？赏ㄟ^常規(guī)方法制備質(zhì)粒pMT2 CXM和pMT23 DNA。
源自pMT21的pEMC2β1可能本發(fā)明的實(shí)踐中也是合適的。pMT21來源于從pMT2-VWF衍生的pMT2。如上所述，EcoRI消化切除了pMT-VWF中存在的cDNA插入片段，從而產(chǎn)生可被連接并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌HR101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性的線性形式pMT2?？赏ㄟ^常規(guī)方法制備質(zhì)粒pMT2 DNA。
通過下列2次修飾從pMT2衍生pMT21。首先，從用于cDNA克隆的G/C加尾中缺失包括一段19個(gè)G殘基的76bp的DHFR cDNA的5′非翻譯區(qū)。在此過程中，立即在DHFR的上游插入PstI、EcoRI和Xho I位點(diǎn)。
其次，通過用EcoR V和Xba I的消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段的處理，及連接于Cla I接頭(CATCGATG)，來引入唯一的Cla I位點(diǎn)。這從腺病毒相關(guān)的RNA(VAI)區(qū)中缺失了250bp片段，但不干擾VAI RNA基因的表達(dá)或功能。用EcoR I和Xho I消化pMT21，并用于衍生載體pEMC2B1。
通過用EcoR I和Pst I的消化，從pMT2-ECAT1中獲得EMCV前導(dǎo)區(qū)部分，從而得到2752bp片段。將該片段用Taq I消化，從而產(chǎn)生508bp EcoR I-Taq I片段，其通過在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上的電泳進(jìn)行純化。合成具有5′Taq I突出端和3′Xho I突出端的68bp連接物及其互補(bǔ)鏈。
連接物序列與核苷酸763-827的EMC病毒前導(dǎo)序列匹配。其也將EMC病毒前導(dǎo)區(qū)內(nèi)位置10上的ATG變?yōu)锳TT并且隨后是Xho I位點(diǎn)。pMT21 EcoR I-Xho I片段、EMC病毒EcoR I-Taq I片段以及68bp寡核苷酸連接物Taq I-Xho I連接物的三種方式連接，導(dǎo)致產(chǎn)生載體pEMC2β1。
該載體含有SV40復(fù)制起點(diǎn)和增強(qiáng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、大多數(shù)腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列的cDNA拷貝、小雜交體間插序列、SV40聚腺苷酸化信號和腺病毒VA I基因、DHFR和β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)記和EMC序列，其處于適當(dāng)?shù)年P(guān)系以指導(dǎo)期望的cDNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)。
載體的構(gòu)建可能涉及軟骨聚集蛋白聚糖酶相關(guān)DNA序列的修飾。例如，可通過除去編碼區(qū)5′和3′端上的非編碼核苷酸，來修飾編碼軟骨聚集蛋白聚糖酶的cDNA。可用或可不用已知有利于表達(dá)的其它序列替換缺失的非編碼核苷酸。將這些載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中用于表達(dá)本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
在一個(gè)實(shí)例中，除去或用細(xì)菌序列替換軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列側(cè)翼的哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)序列以產(chǎn)生用于軟骨聚集蛋白聚糖酶分子的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)的細(xì)菌載體。可進(jìn)一步操縱編碼序列(例如，連接于其它已知接頭或者通過缺失其非編碼序列或通過其它已知技術(shù)改變其核苷酸進(jìn)行修飾)。然后可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的方法將軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列插入到已知細(xì)菌載體中?？蓪⒓?xì)菌載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主細(xì)胞中以表達(dá)本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。對于在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的胞外表達(dá)的策略，見，例如，歐洲專利申請177,343。
可進(jìn)行類似操作用于構(gòu)建在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的昆蟲載體(見，例如，在公開的歐洲專利申請155,476中所描述的方法)。也可使用酵母調(diào)節(jié)序列構(gòu)建酵母載體，以用于本發(fā)明的蛋白在酵母細(xì)胞的胞內(nèi)或胞外的表達(dá)(見，例如，在公開的PCT申請WO 86/00639和歐洲專利申請123,289中所描述的方法)。
在哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲宿主細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)高水平軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的方法可包括構(gòu)建含有多拷貝異源軟骨聚集蛋白聚糖酶基因的細(xì)胞?？蓪愒椿蜻B接于可擴(kuò)增的標(biāo)記，例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，用其可選擇在遞增濃度的氨甲蝶呤(MTX)中繁殖的含有增加的基因拷貝的細(xì)胞?？墒褂迷摲椒ㄓ糜谠S多不同的細(xì)胞類型。
例如，通過包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔或原生質(zhì)體融合的各種方法，可將含有與能使其表達(dá)的其它質(zhì)粒序列可操作地連接的軟骨聚集蛋白聚糖酶的DNA序列的質(zhì)粒和DHFR表達(dá)質(zhì)粒(如，pAdA26SV(A)3)共同引入到DHFR-缺陷的CHO細(xì)胞(DUKX-BII)中。選擇在具有經(jīng)透析的胎牛血清的α培養(yǎng)基中生長的表達(dá)DHFR的轉(zhuǎn)化體，并隨后通過在遞增濃度的MTX(例如，在0.02、0.2、1.0和5μM MTX的連續(xù)步驟)中的生長選擇用于擴(kuò)增的表達(dá)DHFR的轉(zhuǎn)化體?？寺∞D(zhuǎn)化體，并且通過上述測定中的至少一種監(jiān)控有生物活性的軟骨聚集蛋白聚糖酶的表達(dá)。軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的表達(dá)應(yīng)隨MTX抗性的水平增加而增加。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)表征軟骨聚集蛋白聚糖酶多肽，如用35S甲硫氨酸或半胱氨酸的脈沖標(biāo)記和聚丙烯酰胺凝膠電泳。可進(jìn)行類似方法以生產(chǎn)其它軟骨聚集蛋白聚糖酶。
實(shí)施例6.表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染
作為一個(gè)實(shí)例，將本發(fā)明的軟骨聚集蛋白聚糖酶核苷酸序列克隆到表達(dá)載體pED6中。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(LF2000，Invitrogen)用軟骨聚集蛋白聚糖酶序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS和CHO DUKX B11細(xì)胞(Urlaub和Chasin，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA，774218-4220(1980))(在單獨(dú)的PED6質(zhì)粒上PACE的+/-共轉(zhuǎn)染)。對每個(gè)目的分子進(jìn)行一式兩份轉(zhuǎn)染(a)一個(gè)轉(zhuǎn)染組用于收獲條件培養(yǎng)基進(jìn)行活性測定，以及(b)另一個(gè)轉(zhuǎn)染組用于35-S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標(biāo)記。
在第1天，將將要被收獲用于活性測定的(a)組孔上的培養(yǎng)基改變成加1％熱滅活的胎牛血清+/-100μg/ml肝素的DME(COS)或α(CHO)培養(yǎng)基。48小時(shí)后，收獲條件培養(yǎng)基用于活性測定。
在第3天，將(b)組的復(fù)制孔改變成加1％熱滅活的胎牛血清、100μg/ml肝素和100μCi/ml 35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(Redivue Pro mix，Amersham)的MEM(無甲硫氨酸/無半胱氨酸)培養(yǎng)基。在37℃溫育6小時(shí)后，收獲條件培養(yǎng)基并在還原條件下在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳。蛋白可通過放射自顯影術(shù)顯現(xiàn)。
本發(fā)明的前面描述提供了例證和說明，但不打算是詳盡的或者將本發(fā)明限于準(zhǔn)確公開的一個(gè)。修飾和變形可能與上述教導(dǎo)一致或者可從本發(fā)明的實(shí)踐中獲得。因此，應(yīng)當(dāng)注意到本發(fā)明的范圍是由權(quán)利要求和它們的同等方案確定的。
序列表<110>wyeth<120>截短的ADAMTS分子<130>01997.030500.
<140>TBA<141>2005-04-18<150>60/562,685<151>2004-04-15<160>44<170>patentIn version 3.3<210>1<211>1686<212>PRT<213>智人(homo sapiens<400>1Met Pro Gly Gly Pro Ser Pro Arg Ser Pro Ala Pro Leu Leu Arg Pro1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala20 25 30Pro Gly Arg Ala Thr Glu Gly Arg Ala Ala Leu Asp Ile Val His Pro35 40 45Val Arg Val Asp Ala Gly Gly Ser Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Trp Pro50 55 60Arg Ala Leu Arg Lys Arg Asp Val Ser Val Arg Arg Asp Ala Pro Ala65 70 75 80Phe Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Arg Phe Asn Leu Thr85 90 95Ala Asn Gln His Leu Leu Ala Pro Gly Phe Val Ser Glu Thr Arg Arg100 105 110Arg Gly Gly Leu Gly Arg Ala His Ile Arg Ala His Thr Pro Ala Cys115 120 125His Leu Leu Gly Glu Val Gln Asp Pro Glu Leu Glu Gly Gly Leu Ala130 135 140Ala Ile Ser Ala Cys Asp Gly Leu Lys Gly Val Phe Gln Leu Ser Asn145 150 155 160
Glu Asp Tyr Phe Ile Glu Pro Leu Asp Ser Ala Pro Ala Arg Pro Gly165 170 175His Ala Gln Pro His Val Val Tyr Lys Arg Gln Ala Pro Glu Arg Leu180 185 190Ala Gln Arg Gly Asp Ser Ser Ala Pro Ser Thr Cys Gly Val Gln Val195 200 205Tyr Pro Glu Leu Glu Ser Arg Arg Glu Arg Trp Glu Gln Arg Gln Gln210 215 220Trp Arg Arg Pro Arg Leu Arg Arg Leu His Gln Arg Ser Val Ser Lys225 230 235 240Glu Lys Trp Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Ala Lys Met Val Glu245 250 255Tyr His Gly Gln Pro Gln Val Glu Ser Tyr Val Leu Thr Ile Met Asn260 265 270Met Val Ala Gly Leu Phe His Asp Pro Ser Ile Gly Asn Pro Ile His275 280 285Ile Thr Ile Val Arg Leu Val Leu Leu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Leu290295 300Lys Ile Thr His His Ala Asp Asn Thr Leu Lys Ser Phe Cys Lys Trp305 310 315 320Gln Lys Ser Ile Asn Met Lys Gly Asp Ala His Pro Leu His His Asp325 330 335Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg Lys Asp Leu Cys Ala Ala Met Asn Arg340 345 350Pro Cys Glu Thr Leu Gly Leu Ser His Val Ala Gly Met Cys Gln Pro355 360 365His Arg Ser Cys Ser Ile Asn Glu Asp Thr Gly Leu Pro Leu Ala Phe370 375 380Thr Val Ala His Glu Leu Gly His Ser Phe Gly Ile Gln His Asp Gly385 390 395 400Ser Gly Asn Asp Cys Glu Pro Val Gly Lys Arg Pro Phe Ile Met Ser
405 410 415Pro Gln Leu Leu Tyr Asp Ala Ala Pro Leu Thr Trp Ser Arg Cys Ser420 425 430Arg Gln Tyr Ile Thr Arg Phe Leu Asp Arg Gly Trp Gly Leu Cys Leu435 440 445Asp Asp Pro Pro Ala Lys Asp Ile Ile Asp Phe Pro Ser Val Pro Pro450 455 460Gly Val Leu Tyr Asp Val Ser His Gln Cys Arg Leu Gln Tyr Gly Ala465 470 475 480Tyr Ser Ala Phe Cys Glu Asp Met Asp Asn Val Cys His Thr Leu Trp485 490 495Cys Ser Val Gly Thr Thr Cys His Ser Lys Leu Asp Ala Ala Val Asp500 505 510Gly Thr Arg Cys Gly Glu Asn Lys Trp Cys Leu Ser Gly Glu Cys Val515 520 525Pro Val Gly Phe Arg Pro Glu Ala Val Asp Gly Gly Trp Ser Gly Trp530 535 540Ser Ala Trp Ser Ile Cys Ser Arg Ser Cys Gly Met Gly Val Gln Ser545 550 555 560Ala Glu Arg Gln Cys Thr Gln Pro Thr Pro Lys Tyr Lys Gly Arg Tyr565 570 575Cys Val Gly Glu Arg Lys Arg Phe Arg Leu Cys Asn Leu Gln Ala Cys580 585 590Pro Ala Gly Arg Pro Ser Phe Arg His Val Gln Cys Ser His Phe Asp595 600 605Ala Met Leu Tyr Lys Gly Gln Leu His Thr Trp Val Pro Val Val Asn610 615 620Asp Val Asn Pro Cys Glu Leu His Cys Arg Pro Ala Asn Glu Tyr Phe625 630 635 640Ala Glu Lys Leu Arg Asp Ala Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Tyr Gln645 650 655
Val Arg Ala Ser Arg Asp Leu Cys Ile Asn Gly rle Cys Lys Asn Val660 665 670Gly Cys Asp Phe Glu Ile Asp Ser Gly Ala Met Glu Asp Arg Cys Gly675 680 685Val Cys His Gly Asn Gly Ser Thr Cys His Thr Val Ser Gly Thr Phe690 695 700Glu Glu Ala Glu Gly Leu Gly Tyr Val Asp Val Gly Leu Ile Pro Ala705 710 715 720Gly Ala Arg Glu Ile Arg Ile Gln Glu Val Ala Glu Ala Ala Asn Phe725 730 735Leu Ala Leu Arg Ser Glu Asp Pro Glu Lys Tyr Phe Leu Asn Gly Gly740 745 750Trp Thr Ile Gln Trp Asn Gly Asp Tyr Gln Val Ala Gly Thr Thr Phe755 760 765Thr Tyr Ala Arg Arg Gly Asn Trp Glu Asn Leu Thr Ser Pro Gly Pro770 775 780Thr Lys Glu Pro Val Trp Ile Gln Leu Leu Phe Gln Glu Ser Asn Pro785 790 795 800Gly Val His Tyr Glu Tyr Thr Ile His Arg Glu Ala Gly Gly His Asp805 810 815Glu Val Pro Pro Pro Val Phe Ser Trp His Tyr Gly Pro Trp Thr Lys820 825 830Cys Thr Val Thr Cys Gly Arg Gly Val Gln Arg Gln Asn Val Tyr Cys835 840 845Leu Glu Arg Gln Ala Gly Pro Val Asp Glu Glu His Cys Asp Pro Leu850 855 860Gly Arg Pro Asp Asp Gln Gln Arg Lys Cys Ser Glu Gln Pro Cys Pro865 870 875 880Ala Arg Trp Trp Ala Gly Glu Trp Gln Leu Cys Ser Ser Ser Cys Gly885 890 895Pro Gly Gly Leu Ser Arg Arg Ala Val Leu Cys Ile Arg Ser Val Gly900 905 910
Leu Asp Glu Gln Ser Ala Leu Glu Pro Pro Ala Cys Glu His Leu Pro915 920 925Arg Pro Pro Thr Glu Thr Pro Cys Asn Arg His Val Pro Cys Pro Ala930 935 940Thr Trp Ala Val Gly Asn Trp Ser Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Glu945 950 955 960Gly Thr Gln Arg Arg Asn Val Leu Cys Thr Asn Asp Thr Gly Val Pro965 970 975Cys Asp Glu Ala Gln Gln Pro Ala Ser Glu Val Thr Cys Ser Leu Pro980 985 990Leu Cys Arg Trp Pro Leu Gly Thr Leu Gly Pro Glu Gly Ser Gly Ser995 10001005Gly Ser Ser Ser His Glu Leu Phe Asn Glu Ala Asp Phe Ile Pro101010151020His His Leu Ala Pro Arg Pro Ser Pro Ala Ser Ser Pro Lys Pro102510301035Gly Thr Met Gly Asn Ala Ile Glu Glu Glu Ala Pro Glu Leu Asp104010451050Leu Pro Gly Pro Val Phe Val Asp Asp Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asn105510601065Phe Ile Asn Phe His Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Pro Ser Glu Glu107010751080Pro Asp Leu Asp Leu Ala Gly Thr Gly Asp Arg Thr Pro Pro Pro108510901095His Ser His Pro Ala Ala Pro Ser Thr Gly Ser Pro Val Pro Ala110011051110Thr Glu Pro Pro Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Leu Gly Pro Trp111511201125Ser Pro Ser Pro Trp Pro Ser Gln Ala Gly Arg Ser Pro Pro Pro113011351140Pro Ser Glu Gln Thr Pro Gly Asn Pro Leu Ile Asn Phe Leu Pro114511501155
Glu Glu Asp Thr Pro Ile Gly Ala Pro Asp Leu Gly Leu Pro Ser116011651170Leu Ser Trp Pro Arg Val Ser Thr Asp Gly Leu Gln Thr Pro Ala117511801185Thr Pro Glu Ser Gln Asn Asp Phe Pro Val Gly Lys Asp Ser Gln119011951200Ser Gln Leu Pro Pro Pro Trp Arg Asp Arg Thr Asn Glu Val Phe120512101215Lys Asp Asp Glu Glu Pro Lys Gly Arg Gly Ala Pro His Leu Pro122012251230Pro Arg Pro Ser Ser Thr Leu Pro Pro Leu Ser Pro Val Gly Ser123512401245Thr His Ser Ser Pro Ser Pro Asp Val Ala Glu Leu Trp Thr Gly125012551260Gly Thr Val Ala Trp Glu Pro Ala Leu Glu Gly Gly Leu Gly Pro126512701275Val Asp Ser Glu Leu Trp Pro Thr Val Gly Val Ala Ser Leu Leu128012851290Pro Pro Pro Ile Ala Pro Leu Pro Glu Met Lys Val Arg Asp Ser129513001305Ser Leu Glu Pro Gly Thr Pro Ser Phe Pro Thr Pro Gly Pro Gly131013151320Ser Trp Asp Leu Gln Thr Val Ala Val Trp Gly Thr Phe Leu Pro132513301335Thr Thr Leu Thr Gly Leu Gly His Met Pro Glu Pro Ala Leu Asn134013451350Pro Gly Pro Lys Gly Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Glu Val Pro135513601365Leu Ser Ser Arg Leu Leu Ser Thr Pro Ala Trp Asp Ser Pro Ala137013751380Asn Ser His Arg Val Pro Glu Thr Gln Pro Leu Ala Pro Ser Leu
l385 13901395Ala Glu Ala Gly Pro Pro Ala Asp Pro Leu Val Val Arg Asn Ala140014051410Gly Trp Gln Ala Gly Asn Trp Ser Glu Cys Ser Thr Thr Cys Gly141514201425Leu Gly Ala Val Trp Arg Pro Val Arg Cys Ser Ser Gly Arg Asp143014351440Glu Asp Cys Ala Pro Ala Gly Arg Pro Gln Pro Ala Arg Arg Cys144514501455His Leu Arg Pro Cys Ala Thr Trp His Ser Gly Asn Trp Ser Lys146014651470Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Val Arg Asp Val Gln147514801485Cys Val Asp Thr Arg Asp Leu Arg Pro Leu Arg Pro Phe His Cys149014951500Gln Pro Gly Pro Ala Lys Pro Pro Ala His Arg Pro Cys Gly Ala150515101515Gln Pro Cys Leu Ser Trp Tyr Thr Ser Ser Trp Arg Glu Cys Ser152015251530Glu Ala Cys Gly Gly Gly Glu Gln Gln Arg Leu Val Thr Cys Pro153515401545Glu Pro Gly Leu Cys Glu Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Arg155015551560Pro Cys Asn Thr His Pro Cys Thr Gln Trp Val Val Gly Pro Trp156515701575Gly Gln Cys Ser Gly Pro Cys Gly Gly Gly Val Gln Arg Arg Leu158015851590Val Lys Cys Val Asn Thr Gln Thr Gly Leu Pro Glu Glu Asp Ser159516001605Asp Gln Cys Gly His Glu Ala Trp Pro Glu Ser Ser Arg Pro Cys161016151620
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<211>661<212>PRT<213>智人<400>44Met Glu Cys Ala Leu Leu Leu Ala Cys Ala Phe Pro Ala Ala Gly Ser1 5 10 15Gly Pro Pro Arg Gly Leu Ala Gly Leu Gly Arg Val Alg Lys Ala Leu20 25 30Gln Leu Cys Cys Leu Cys Cys Ala Ser Val Ala Ala Ala Leu Ala Ser35 40 45Asp Ser Ser Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asn Asp Asp Tyr Val Phe Val50 55 60Thr Pro Val Glu Val Asp Ser Ala Gly Ser Tyr Ile Ser His Asp Ile65 70 75 80Leu His Asn Gly Arg Lys Lys Arg Ser Ala Gln Asn Ala Arg Ser Ser85 90 95Leu His Tyr Arg Phe Ser Ala Phe Gly Gln Glu Leu His Leu Glu Leu100 105 110Lys Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ser His Phe Ile Val Gln Val Leu Gly115 120 125Lys Asp Gly Ala Ser Glu Thr Gln Lys Pro Glu Val Gln Gln Cys Phe130 135 140Tyr Gln Gly Phe Ile Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Val Ala Val Ser145 150 155 160Thr Cys Ala Gly Leu Ser Gly Leu Ile Arg Thr Arg Lys Asn Glu Phe165 170 175Leu Ile Ser Pro Leu Pro Gln Leu Leu Ala Gln Glu His Asn His Ser180 185 190Ser Pro Ala Gly His His Pro His Val Leu Tyr Lys Arg Thr Ala Glu195 200 205Glu Lys Ile Gln Arg Tyr Arg Gly Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Asn Tyr210 215 220Pro Gly Tyr Ser Pro Ser His Ile Pro His Ala Ser Gln Ser Arg Glu
225 230 235 240Thr Glu Tyr His His Arg Arg Leu Gln Lys Gln His Phe Cys Gly Arg245 250 255Arg Lys Lys Tyr Ala Pro Lys Pro Pro Thr Glu Asp Thr Tyr Leu Arg260 265 270Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Ser Gly Arg Pro Arg Arg Ser Ala Gly Lys275 280 285Ser Gln Lys Gly Leu Asn Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Lys Lys290 295 300Met Val Glu Lys His Gly Lys Gly Asn Val Thr Thr Tyr Ile Leu Thr305 310 315 320Val Met Asn Met Val Ser Gly Leu Phe Lys Asp Gly Thr Ile Gly Ser325 330 335Asp Ile Asn Val Val Val Val Ser Leu Ile Leu Leu Glu Gln Glu Pro340 345 350Gly Gly Leu Leu Ile Asn His His Ala Asp Gln Ser Leu Asn Ser Phe355 360 365Cys Gln Trp Gln Ser Ala Leu Ile Gly Lys Asn Gly Lys Arg His Asp370 375 380His Ala Ile Leu Leu Thr Gly Phe Asp Ile Cys Ser Trp Lys Asn Glu385 390 395 400Pro Cys Asp Thr Leu Gly Phe Ala Pro Ile ser Gly Met Cys Ser Lys405 410 415Tyr Arg Ser Cys Thr Ile Asn Glu Asp Thr Gly Leu Gly Leu Ala Phe420 425 430Thr Ile Ala His Glu Ser Gly His Asn Phe Gly Met Ile His Asp Gly435 440 445Glu Gly Asn Pro Cys Arg Lys Ala Glu Gly Asn Ile Met Ser Pro Thr450 455 460Leu Thr Gly Asn Asn Gly Val Phe Ser Trp Ser Ser Cys Ser Arg Gln465 470 475 480
Tyr Leu Lys Lys Phe Leu Ser Thr Pro Gln Ala Gly Cys Leu Val Asp485 490 495Glu Pro Lys Gln Ala Gly Gln Tyr Lys Tyr Pro Asp Lys Leu Pro Gly500 505 510Gln Ile Tyr Asp Ala Asp Thr Gln Cys Lys Trp Gln Phe Gly Ala Lys515 520 525Ala Lys Leu Cys Ser Leu Gly Phe Val Lys Asp Ile Cys Lys Ser Leu530 535 540Trp Cys His Arg Val Gly His Arg Cys Glu Thr Lys Phe Met Pro Ala545 550 555 560Ala Glu Gly Thr Val Cys Gly Leu Ser Met Trp Cys Arg Gln Gly Gln565 570 575Cys Val Lys Phe Gly Glu Leu Gly Pro Arg Pro Ile His Gly Gln Trp580 585 590Ser Ala Trp Ser Lys Trp Ser Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly595 600 605Val Lys Phe Gln Glu Arg His Cys Asn Asn Pro Lys Pro Gln Tyr Gly610 615 620Gly Ile Phe Cys Pro Gly Ser Ser Arg Ile Tyr Gln Leu Cys Asn Ile625 630 635 640Asn Pro Cys Asn Glu Asn Ser Leu Asp Phe Gly Ser Ala Trp Ser His645 650 655Pro Gln Phe Glu Lys660
權(quán)利要求
1.一種可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失多個(gè)氨基酸殘基獲得的分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白包括富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，且所述多個(gè)缺失的氨基酸殘基包括富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的重要部分，且其中所述全長ADAMTS蛋白不是全長ADAMTS-4蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白包括位于富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域N-末端的血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)，以及位于血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)C-末端的保守的苯丙氨酸殘基，且其中所述多個(gè)缺失的氨基酸殘基包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基的重要部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述保守的苯丙氨酸殘基是位于血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)C-末端的第一個(gè)保守的苯丙氨酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述的多個(gè)缺失的氨基酸殘基包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，進(jìn)一步包括前結(jié)構(gòu)域的重要部分的缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白選自ADAMTS-7、ADAMTS-9、ADAMTS-10、ADAMTS-16和ADAMTS-18。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，由選自下列的氨基酸序列組成SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO20。
8.根據(jù)權(quán)利要求9的軟骨聚集蛋白聚糖酶，由所述氨基酸序列的變體組成。
9.一種分離的或重組的蛋白，其包括權(quán)利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶和共價(jià)連于所述軟骨聚集蛋白聚糖酶的多肽。
10.編碼權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項(xiàng)的軟骨聚集蛋白聚糖酶的多核苷酸。
11.一種試劑盒或測定系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項(xiàng)的軟骨聚集蛋白聚糖酶或者編碼所述酶的多核苷酸。
12.一種鑒定能調(diào)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的化合物的方法，其包括下列步驟(a)使含有權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項(xiàng)的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的樣品與多個(gè)測試化合物之一接觸；(b)將接觸的樣品的活性與相應(yīng)的未接觸測試化合物的蛋白樣品的活性進(jìn)行比較，其中活性基本上降低將化合物鑒定為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的調(diào)節(jié)劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述化合物抑制所述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述化合物提高所述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
15.對權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中的任何一項(xiàng)的軟骨聚集蛋白聚糖酶特異的抗體。
16.一種分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其基本上由全長ADAMTS蛋白的催化結(jié)構(gòu)域、解整連蛋白結(jié)構(gòu)域以及中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)組成，其中所述全長ADAMTS蛋白不是ADAMTS-4蛋白。
17.包括權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項(xiàng)的純化的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的組合物。
18.用權(quán)利要求10的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
19.一種生產(chǎn)純化的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的方法，其包括下列步驟(a)在使所述蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞；和(b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收并純化所述蛋白。
20.一種在受試者中治療炎性狀況的方法，其包括施用通過權(quán)利要求12的方法所鑒定的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供截短的有生物活性的ADAMTS多肽，特別是具有hyalectenase活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其顯示比它們的全長對應(yīng)物更高的穩(wěn)定性和同質(zhì)性以及更高的表達(dá)產(chǎn)量。本發(fā)明也提供編碼這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的核酸分子以及生產(chǎn)截短的有生物活性的ADAMTS多肽的方法。另外，本發(fā)明提供鑒定能調(diào)節(jié)有生物活性的ADAMTS多肽的化合物，特別是抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些化合物的方法。
文檔編號C12P21/06GK1981049SQ200580019850
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者E·拉瓦利, L·A·科林斯－拉西, C·J·科爾科蘭, N·C·特溫, M·J·阿戈斯蒂諾 申請人:惠氏公司