專利名稱：：具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶和酶組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及來自白曲霉(Aspergilluskawachi)菌株的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，該酸穩(wěn)定性α淀粉酶具有顆粒淀粉水解(GSH)活性。進一步地，本發(fā)明涉及具有GSH活性的asAA在絲狀真菌宿主細胞中尤其是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)細胞中的異源表達，以及涉及具有GSH活性的asAA在組合物中的用途，該組合物任選地包括葡糖淀粉酶，以增強淀粉水解。
背景技術：
：葡糖淀粉酶，尤其是具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的葡糖淀粉酶是重要的工業(yè)酶，用于由來自谷物(grains)和谷類(cereals)的淀粉底物生產(chǎn)各種產(chǎn)品例如有機酸(例如乳酸)、氨基酸(例如谷氨酸)、糖類增甜劑產(chǎn)品(例如葡萄糖和高果糖玉米糖漿)、醇類(例如乙醇)和其它化合物。在微生物發(fā)酵期間，尤其是在同步糖化發(fā)酵(SSF)期間，當顆粒淀粉底物被用作碳料時降低發(fā)酵中殘留淀粉的量將是有利的。本發(fā)明通過提供具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)響應這種需求，所述酸穩(wěn)定性α淀粉酶可以與葡糖淀粉酶結合使用，以增強淀粉水解和醇產(chǎn)量。此外，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術組合物和方法的益處包括下列中的一個或更多個a)在淀粉水解和終產(chǎn)物生產(chǎn)期間對熱能的使用減少；b)對高酶劑量的需要降低；c)利用葡萄糖從淀粉的連續(xù)釋放來喂養(yǎng)酵母；d)在發(fā)酵罐中維持相對低的葡萄糖水平，其顯著降低微生物污染的高風險和消除由于高濃度游離葡萄糖導致的對酵母的降解物阻遏；e)褐變反應產(chǎn)物的形成減少；f)降低或免除鈣的添加，這在現(xiàn)有技術噴煮工藝(jetcookingprocess)期間是必須的；g)降低在發(fā)酵工藝期間對水的使用；h)在發(fā)酵中使用較高的固體含量，其可以導致較高的終產(chǎn)物形成和降低的能量成本；i)降低某些副產(chǎn)物的產(chǎn)量水平，例如甘油；和j)含可溶物干酒糟(distillersdrygrainsplussolubles)中降低的殘留淀粉含量和增加的蛋白質含量。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明涉及真菌宿主細胞，其包括編碼與SEQIDNO3的序列具有至少90％序列同一性的、具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的異源多核苷酸。在一些實施方式中，該異源多核苷酸將編碼與SEQIDNO3的序列具有至少95％的序列同一性的、具有GSH活性的asAA。在一些實施方式中，與在天然真菌宿主中內源表達所產(chǎn)生的相應asAA相比，在包含編碼asAA的異源多核苷酸的真菌宿主中表達的asAA將具有至少一個不同的性質。在一些實施方式中，不同的性質是asAA的最適pH或活性的pH范圍。在該方面的一個實施方式中，真菌宿主細胞是木霉屬細胞。在進一步的實施方式中，木霉屬宿主細胞是里氏木霉(T.reesei)細胞。在另一個實施方式中，真菌宿主細胞是曲霉屬細胞。在第二方面，本發(fā)明涉及具有GSH活性的asAA，該asAA包括與SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在這個方面的一些實施方式中，具有GSH活性的asAA將是截短型asAA。在一些實施方式中，截短型asAA包括SEQIDNO9的序列或與SEQIDNO9的序列具有至少97％序列同一性的序列。在第三方面，本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物，其包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，其中所述具有GSH活性的asAA與SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些實施方式中，顆粒淀粉水解酶組合物包括截短型asAA酶，所述酶與SEQIDNO9具有至少97％的序列同一性。在一些實施方式中，asAA得自異源多核苷酸在真菌宿主細胞中的表達。在進一步的實施方式中，真菌宿主細胞是木霉屬和曲霉屬宿主細胞。在其它實施方式中，組合物進一步包括葡糖淀粉酶。在一些優(yōu)選的實施方式中，葡糖淀粉酶將從曲霉屬或根霉屬(Rhizopus)的菌株獲得。在其它實施方式中，葡糖淀粉酶將是具有GSH活性的葡糖淀粉酶，并從曲霉屬、木霉屬、根霉屬或腐質霉屬(Humicola)的菌株獲得。在其它實施方式中，asAA和葡糖淀粉酶都將在真菌宿主中被表達，所述真菌宿主含有表達具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶的異源多核苷酸。在一些實施方式中，真菌宿主菌株將是相同的，在其它實施方式中真菌宿主菌株將是不同的菌株。在其它實施方式中，本發(fā)明涉及使用本方面的酶組合物水解顆粒淀粉的方法。在第四方面，本發(fā)明涉及在絲狀真菌宿主細胞中制備具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的方法，該方法包括用DNA構建物轉化絲狀真菌宿主細胞，所述DNA構建物包括在該絲狀真菌宿主細胞中具有轉錄活性的啟動子，該啟動子可操作性地連接于編碼具有GSH活性的、并與SEQIDNO3有至少90％序列同一性的asAA的異源多核苷酸；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化的絲狀真菌宿主細胞，以允許所述asAA表達；以及產(chǎn)生asAA。在一個實施方式中，該方法進一步包括回收所產(chǎn)生的asAA。在第二個實施方式中，真菌宿主細胞是木霉屬細胞尤其是里氏木霉(T.reesei)細胞。在第五方面，本方明涉及提高含葡糖淀粉酶的組合物的顆粒淀粉水解活性的方法，其包括將具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)加入到包括顆粒淀粉底物和葡糖淀粉酶的組合物中，以產(chǎn)生可溶性淀粉水解產(chǎn)物。在一些實施方式中，具有GSH活性的asAA具有與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在其它實施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型asAA。在一些實施方式中，截短型asAA包括與SEQIDNO9有至少97％的序列同一性的序列。在進一步的實施方式中，溶解的淀粉的量大于缺少含有GSH活性的asAA的相應組合物。附圖簡述圖1A-B提供了編碼天然白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶的基因組DNA序列，其被稱為asaA(SEQIDNO1)。八個推定的內含子用下劃線表示。圖2提供了白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(SEQIDNO4)的信號序列(SEQIDNO2)和成熟氨基酸序列(SEQIDNO3)(AsaA)。推定的信號序列(氨基酸1-21)用下劃線和粗體表示。推定的接頭是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(SEQIDNO8)。接頭上游未加下劃線的氨基酸包括催化結構域(catalyticdomain)(SEQIDNO9)，接頭下游的氨基酸包括淀粉結合結構域(starchbindingdomain(SBD))(SEQIDNO10)。SBD包括圖2多肽的最后102個氨基酸。圖3A-D提供了質粒pTrex3g_Akalpha(圖4)的完整的核苷酸序列(SEQIDNO5)，10990bp。圖4提供了pTrex3g_Akalpha的圖譜，其被用于表達編碼AsaA(白曲霉asAA)的核酸，并且其含有位于真菌表達載體兩側上的EcoRI位點(EcoRIsites)，其中a)cbhI啟動子是里氏木霉纖維二糖水解酶啟動子；b)asaA是編碼SEQIDNO4的酸穩(wěn)定性α淀粉酶的白曲霉多核苷酸；c)cbhI終止子是里氏木霉纖維二糖水解酶終止子；d)amdS是構巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶營養(yǎng)標記基因；和e)attB是用于重組的Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)λ噬菌體位點。圖5A和B提供了SDS-PAGE凝膠，顯示了在克隆的里氏木霉代表性發(fā)酵試驗中來自里氏木霉的asaA的表達，如實施例5所描述。在圖5A中，泳道1代表標準SeeBlue+2標志物；泳道2代表在80小時后里氏木霉表達的AsaA；泳道3代表在162小時后里氏木霉表達的AsaA；以及泳道4代表在162小時時的里氏木霉宿主細胞對照，其中所述宿主細胞對照未用asaA轉化。AsaA蛋白質帶被清楚地觀察到，約為90kDa，并且該帶在宿主菌株對照中不存在。在圖5B中，泳道1代表在210小時后里氏木霉表達的完整型AsaA，泳道2代表在200小時后里氏木霉以完整型和截短型形式所表達的AsaA的3條帶，以及泳道3代表分子量標志物。圖6以殘留活性百分率說明了天然白曲霉(nAk-AsaA)和在里氏木霉宿主中表達的白曲霉(rAk-AsaA)(SEQIDNO3)的pH穩(wěn)定性，如實施例6中所述。圖7說明了在pH5.0中，隨著時間的過去，從用葡糖淀粉酶(0.5GAU/gDISTILLASE)和α淀粉酶發(fā)酵玉米面粉醪液得到的乙醇(EtOH)產(chǎn)量百分數(shù)(v/v)，其中AkAA表示Tr-AsaA(在里氏木霉中表達的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；LF75表示SPEZYMELT75α淀粉酶；FRED表示SPEZYMEFRED；ETHYL表示SPEZYMEETHYL；FA表示CLARASE以及DISTILLASE是對照。參考實施例8。圖8說明了在pH5.0下，在與純化的DISTILLASE(GA)、純化的AkAA(在里氏木霉中表達的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)以及與AkAA和GA的組合溫育4小時之后，顆粒淀粉降解成葡萄糖釋放出來。參考實施例11。圖9圖示了對用圖8所描述的酶溫育的顆粒玉米淀粉的SEMs(掃描電子顯微鏡圖)純化的DISTILLASE(GA)、純化的AkAA(在里氏木霉中表達的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)，以及AkAA和GA的組合。圖10說明了對于每一玉米醪液固體(cornmashsolids)(％ds)，采用AkAA的乙醇增加百分率，以相對于醪液固體(％ds)進行測量。圖11描繪了在71小時測量的發(fā)酵液的乙醇體積百分比v/v，所述發(fā)酵液以1.5SUU/gdsAkAA的固定劑量水平包括不同比例的完整型和截短型AkAA。圖12說明了來自里氏木霉菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO11)。圖13說明了來自灰腐質霉高溫變種(Humicolagriseavar.thermoidea)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO12)。圖14說明了來自泡盛曲霉河內變種(Aspergillusawamorivar.kawachi)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO13)。發(fā)明詳述在一些方面，本發(fā)明依靠在遺傳工程和分子生物學領域中使用的常規(guī)技術和方法。下面的資源含有對根據(jù)本發(fā)明有用的一般方法學的描述Sambrooketal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL(2ndEd.，1989)；Kreigler，GENETRANSFERANDEXPRESSION；ALABORATORYMANUAL(1990)以及Ausubeletal.，Eds.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)。這些一般性的參考資料提供了本領域技術人員所知的定義和方法。然而，并不意欲將本發(fā)明限制到所述的任何具體的方法、步驟和試劑，因為這些可以變化。除非本文中另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員通常所理解的含義相同。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)為技術人員提供了本發(fā)明所用的許多術語的通用詞典。盡管類似或等同于本文中所描述的那些的任何方法和材料都可以在本發(fā)明的實踐和測試中使用，但所描述的是優(yōu)選的方法和材料?，F(xiàn)在將僅通過參考的方式，使用下面的定義和例子，詳細地描述本發(fā)明。本文中所引用的所有專利和出版物，包括在這類專利和出版物中公開的所有序列，被清楚地引入作為參考。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另外指出，分別地，核酸以5′到3′方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫。本文所提供的標題不是對本發(fā)明的各個方面或者實施方式的限制，本發(fā)明的各個方面或者實施方式可以通過從整體上參閱說明書而擁有。A.定義如本文中所使用，術語“淀粉(starch)”是指含有植物的復合多糖碳水化合物的任何物質，包括具有式(C6H10O5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任意數(shù)字。具體而言，該術語是指任何植物基物質，包括但不限于谷粒、草、塊莖和根，更特別地是小麥、大麥、玉米、黑麥、水稻、高梁、麩、木薯、黍、馬鈴薯、甘薯和木薯。術語“顆粒淀粉(granularstarch)”是指生(未蒸煮過的)淀粉，例如未經(jīng)歷糊化作用的顆粒淀粉。術語“顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))酶”或“具有顆粒淀粉水解(GSH)活性”是指具有能夠水解顆粒形式的淀粉之能力的酶。術語“α淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.3.2.1.1類)”是指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶還被描述為那些導致含有1，4-α-連接D-葡萄糖單元的多糖中的1，4-α-D-糖苷鍵外切或內切水解的酶。用于描述這些酶的另一個術語是“糖原酶(glycogenase)”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(alpha-1，4-glucan4-glucanohydraseglucanohydrolase)。術語“酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(“asAA”))”是指在pH3.0到7.0的pH范圍內有活性的α淀粉酶，優(yōu)選3.5到6.0的pH范圍。術語“截短型asAA(truncatedasAA)”是指具有GSH活性的asAA多肽，其中至少部分淀粉結合結構域已被去除。在一些實施方式中，截短型asAA是指包含SEQIDNO3的至少65％的氨基酸序列，或包括與SEQIDNO3有至少90％序列同一性的序列的至少65％。術語“淀粉結合結構域(strachbindingdomain(SBD))”是指優(yōu)先結合淀粉(多糖)底物的氨基酸序列。術語“接頭(linker)”是指通常具有3到40個氨基酸的短氨基酸序列，其共價結合包含淀粉結合結構域的氨基酸序列和包含催化結構域的氨基酸序列。術語“催化結構域(catalyticdomain)”是指區(qū)別于SBD并且含有底物水解的活性部位的多肽結構區(qū)域。術語“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”是指淀粉葡萄糖苷酶這一酶類(例如E.C.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D葡聚糖葡糖水解酶)。這些酶是外切作用的酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡糖基殘基。該酶還水解α-1，6鍵和α-1，3鍵，盡管速率比α-1，4鍵慢得多。術語“糖基化(glycosylation)”是指通過加入糖部分而對蛋白質進行轉錄后修飾，其中碳水化合物可以是N-連接的或O-連接的，從而形成糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分是通過糖苷鍵被連接到天冬酰胺殘基的β-酰胺氮上。O-連接碳水化合物是通過絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基以糖苷鍵被連接到蛋白質上。術語“重組體(recombinant)”，當被用于細胞、核酸、蛋白質或載體時，是指該細胞、核酸、蛋白質或載體通過引入異源核酸或蛋白質或對天然核酸或蛋白質的改變而被修飾，或者是指細胞是來自被如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在該細胞的天然(非重組型)形式內未發(fā)現(xiàn)的基因，或者重組細胞表達在其他情況下將異常表達、欠表達或完全不表達的天然基因。術語“蛋白質(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可以互換使用。氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母代碼和三字母代碼在本文中被使用?！靶盘栃蛄?signalsequence)”指連接到蛋白質的N末端部分上的氨基酸的序列，其幫助該蛋白質的成熟形式分泌到細胞外。對信號肽的定義是功能性定義。胞外蛋白的成熟形式缺少信號序列，信號序列在分泌過程中被切割掉。術語“天然酸穩(wěn)定性α淀粉酶(nativeacid-stablealphaamylase(n-asAA))”是指由asAA的內源性表達而產(chǎn)生的asAA。例如，術語“n-asAA”意指白曲霉的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即，SEQID3)的內源表達。術語“重組酸穩(wěn)定性α淀粉酶(recombinantacid-stablealphaamylase(r-asAA))”、“重組表達的asAA(recombinantlyexpressedasAA)”和“重組產(chǎn)生的asAA(recombinantlyproducedasAA)”是指成熟asAA蛋白質序列，其在宿主細胞中由異源多核苷酸的表達而被產(chǎn)生。例如，術語“r-asaA”意指白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即SEQIDNO3)在引入編碼該asaA的多核苷酸的宿主中被表達和產(chǎn)生。r-asAA的成熟蛋白質序列不包括信號序列?！盎?gene)”是指DNA片段，其參與產(chǎn)生多肽，并包括編碼區(qū)前后的區(qū)域以及單獨的編碼區(qū)(外顯子)之間的間插序列(內含子)。術語“核酸(nucleicacid)”包涵DNA、RNA、其單鏈或雙鏈及化學修飾體。術語“核酸(nucleicacid)”和“多核苷酸(polynucleotide)”在本文中可以互換使用。因為遺傳密碼具有簡并性，一個以上的密碼子可以被用于編碼一個具體的氨基酸，并且本發(fā)明涵蓋編碼一條具體的氨基酸序列的多條多核苷酸?！拜d體(vector)”是指被設計用于將核酸引入到一種或更多種細胞類型內的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、表達盒及類似物。本文中所使用的“表達載體(expressionvector)”是指DNA構建物，其包括可操作性連接到合適的調控序列上的DNA序列，所述調控序列能夠引起該DNA在合適宿主中的表達。這樣的調控序列可以包括引起轉錄的啟動子、調控轉錄的任選的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列、增強子和調控轉錄與翻譯終止的序列?！皢幼?promoter)”是調控序列，其涉及結合RNA聚合酶以起始基因的轉錄。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。本發(fā)明使用的優(yōu)選的啟動子是里氏木霉cbhl，其是誘導型啟動子?！笆苻D錄調控(undertranscriptionalcontrol)”是本領域中被充分理解的一個術語，其表明多核苷酸序列，通常是DNA序列的轉錄，取決于其被可操作性連接到有助于轉錄起始或促進轉錄的元件上?！笆芊g調控(undertranslationalcontrol)”是本領域中被充分理解的一個術語，其表示發(fā)生在mRNA業(yè)已形成之后的調控過程。如本文中在描述蛋白質和編碼它們的基因時所使用，關于基因的術語是斜體字，(例如，編碼asaA(白曲霉asAA)的基因可以被表示為asaA)。關于蛋白質的術語通常不是斜體并且第一個字母一般是大寫，(例如，由asaA基因編碼的蛋白質可以被表示為AsaA或asaA)。術語“源自(derived)”包括術語“起源自(originatedfrom)”、“得自(obtained)”或“可以得自(obtainablefrom)”、和“分離自(isolatedfrom)”以及如本文中所使用的，是指由核苷酸序列編碼的多肽從細胞產(chǎn)生，在所述細胞中該核苷酸天然存在，或該核苷酸被插入到所述細胞中。術語“可操作性連接(operablylinked)”是指并列關系(juxtaposition)，其中元件處于使得它們在功能上相關的排列中。例如，如果啟動子調控編碼序列的轉錄時，那么其則被可操作性連接到該序列上。術語“選擇性標記(selectivemarker)”是指能夠在宿主中表達的基因，其使得容易選擇那些含有引入的核酸或載體的宿主。選擇性標記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博萊霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細胞代謝優(yōu)勢的基因，例如營養(yǎng)優(yōu)勢。多核苷酸或多肽與另一條序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指當比對時，在比較的兩條序列中，該百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。該比對和百分比同源性或同一性可以使用本領域中已知的任何合適軟件程序來確定，例如在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubeletal.(eds)1987，Supplement30，7.7.18部分)中描述的那些程序。優(yōu)選的程序包括GCGPileup程序、FASTA(Pearsonetal.(1988)Proc.Natl，Acad.SciUSA852444-2448)、和BLAST(BLASTManual，Altschuletal.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，MD，和Altschuletal.，(1997)NAR253389-3402)。另一個優(yōu)選的程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，PA)，優(yōu)選使用默認參數(shù)。發(fā)現(xiàn)有用的另一個序列軟件程序是TFASTADataSearchingProgram，其在SequenceSoftwarePackageVersion6.0(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)中可得到。本領域的技術人員將認識到本發(fā)明包含的序列還由在嚴格雜交條件下與示例性的asaA序列(例如SEQIDNO1)進行雜交的能力所定義。當單鏈形式的核酸在適當?shù)臏囟群腿芤弘x子強度條件下能與另一條核酸退火，則該核酸可以與另一條核酸序列雜交。雜交和洗滌條件在本領域中是熟知的(參見，例如Sambrook(1989)，見上文，特別是第9章和第11章)。在一些實施方式中，嚴格條件相當于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS?！八拗骶?hoststrain)”或“宿主細胞(hostcell)”是指對于含有編碼本發(fā)明的顆粒淀粉水解酶的多核苷酸的表達載體或DNA構建物合適的宿主。特別地，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細胞。宿主細胞可以是野生型絲狀真菌細胞或經(jīng)遺傳學修飾的宿主細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“宿主細胞”是指從絲狀真菌菌株以及尤其是木霉屬某種(Trichodermasp.)或曲霉屬某種(Aspergillussp.)的細胞產(chǎn)生的細胞和原生質體。術語“絲狀真菌(filamentousfungi)”是指所有絲狀形式的真菌亞門(subdivisionEumycotina)(參見Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYork以及AINSWORTHANDBISBYDICTIONARYOFTHEFUNGI，9thEd(2001)，KirketalEds.，CAB，InternationalPublishing)。這些真菌的特征在于營養(yǎng)菌絲體具有由幾丁質、纖維素和其它復合多糖組成的細胞壁。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學上、生理學上和遺傳學上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲延伸實現(xiàn)，并且碳分解代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌母細胞可以是但不限于下列種的細胞木霉屬(例如里氏木霉(以前分類為長枝木霉(T.longibrachiatum)以及目前也被稱為紅褐肉座菌(Hypocreajecorina))、綠色木霉(Trichodermaviride)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉屬某種(Penicilliumsp.)、腐質霉屬某種(Humicolasp.)(例如特異腐質霉(Humicolainsolens)和灰腐質霉(Humicolagrisea))；金孢霉屬某種(Chrysosporiumsp.)(例如，拉克淖金孢菌(C.lucknowense))、粘帚霉屬某種(Gliocladiumsp.)、曲霉屬某種(Aspergillussp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、白曲霉(A.kawachi)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、鐮刀霉屬某種(Fusariumsp.)、脈孢霉屬某種(Neurosporasp.)、肉座霉屬某種(Hypocreasp.)和翹孢霉屬某種(Emericellasp.)(還參見lnnisetal.，(1985)Sci.22821-26)。如本文中所使用，術語“木霉屬(Trichoderma)”或“木霉屬某種(Trichodermasp.)”是指以前或當前被分類為木霉屬的任何真菌屬。術語“培養(yǎng)(culturing)”是指在合適的條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長一群微生物細胞。在一個實施方式中，培養(yǎng)是指含顆粒淀粉的淀粉底物變成終產(chǎn)物的發(fā)酵型生物轉化(典型地，在容器或反應器中)。發(fā)酵(fermentation)是通過微生物對有機物質進行酶分解和無氧分解，產(chǎn)生較簡單的有機化合物。盡管發(fā)酵在無氧情況下發(fā)生，并不意圖使該術語完全限制于嚴格的無氧條件，因為發(fā)酵也可以在氧存在的情況下發(fā)生。短語“同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation(SSF))”是指在產(chǎn)生終產(chǎn)物中的一種工藝，其中微生物例如乙醇生產(chǎn)微生物和至少一種酶例如asAA在同一個處理步驟中存在。在本發(fā)明的一個實施方式中，SSF是指在同一個反應器容器中，同時發(fā)生顆粒淀粉底物水解成包括葡萄糖在內的糖類和糖類發(fā)酵成醇。術語“接觸(contacting)”是指使各個酶(一種或多種)足夠近地接近各自的底物，以使得該酶(一種或多種)能夠將該底物轉化成所述終產(chǎn)物。本領域的技術人員將認識到將酶與各自底物的溶液混合可以實現(xiàn)接觸。術語“酶轉化(enzymaticconversion)”通常是指通過酶作用改變底物。本文中所使用的該術語，還指顆粒淀粉通過酶的作用而改變。正如本文中所使用，術語“糖化(saccharification)”是指淀粉被酶促轉化成葡萄糖。術語“糊化(gelatinization)”意思是通過蒸煮來增溶淀粉分子，以便形成粘性懸浮液。術語“糊化溫度(gelatinizationtemperature)”是指淀粉開始糊化的溫度。糊化的確切溫度取決于特定的淀粉，并且取決于多種因素可以變化，例如植物種類以及環(huán)境和生長條件。術語“在糊化溫度以下(belowgelatinizationtemperature)”是指溫度小于開始糊化的溫度。術語“液化(liquefaction)”是指在淀粉轉化中的階段，在該階段中，糊化的淀粉被水解，以產(chǎn)生低分子量的可溶性糊精。術語“聚合度(degreeofpolymerization(DP))”是指在給定的糖化物(saccharide)中的脫水吡喃型葡萄糖單元(anhydroglucopyranoseunit)的數(shù)目(n)。DP1的例子是單糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是雙糖，例如麥芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。術語“終產(chǎn)物(end-product)”或“期望的終-產(chǎn)物(desiredend-product)”是指任何碳源來源的分子產(chǎn)物，其從顆粒淀粉底物被酶促轉化而來。如本文中所使用，術語“干固體含量(drysolidscontent(ds))”是指基于干重的、以百分比(％)計的淤漿(slurry)中的總固體。術語“淤漿(slurry)”是指含有不溶固體的含水混合物。術語“可溶性淀粉水解產(chǎn)物(solublestarchhydrolysate)”是指淀粉水解所得到的可溶性產(chǎn)物，其可以包括單糖、雙糖或寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和高級糖(highersugar))。術語“殘留淀粉(residualstarch)”是指在含淀粉底物發(fā)酵之后，在組合物中剩余下來的殘余的淀粉(可溶性的或不溶性的)。術語“干酒糟(distillersdriedgrain(DDG))”和“含可溶物干酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles(DDSG))”是指谷物發(fā)酵的有用的副產(chǎn)品。術語“醪液(mash)”是指可發(fā)酵碳源(碳水化合物)在水中的的混合物，其被用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如醇。在一些實施方式中，術語“發(fā)酵醪(beer)”、“醪液(mash)”和“發(fā)酵液(fermentationbroth)”可以被互換使用。如本文中所使用，“產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)”是指具有將糖或寡糖轉化成乙醇之能力的微生物。產(chǎn)乙醇微生物依靠它們表達單獨或一起將糖轉化成乙醇的一種或多種酶的能力而產(chǎn)生乙醇。如本文中所使用，術語“乙醇生產(chǎn)者(ethanolproducer)”或“乙醇生產(chǎn)微生物(ethanolproducingmicroorganism)”是指能夠從己糖或戊糖產(chǎn)生乙醇的任何生物體或細胞。通常，乙醇-生產(chǎn)細胞含有醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)和丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase)。乙醇生產(chǎn)微生物的例子包括真菌微生物，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)的菌株，尤其是釀酒酵母(S.cerevisiae)。當與多核苷酸或蛋白質有關時，術語“異源的(heterologous)”是指在宿主細胞里并非天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質。在一些實施方式中，該蛋白質是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質。意圖在于該術語涵蓋由天然發(fā)生的基因(naturrallyoccurringgenes)、突變基因(mutatedgenes)和/或合成基因(syntheticgenes)編碼的蛋白質。當與多核苷酸或蛋白質有關時，術語“內源的(endogenous)”是指多核苷酸或蛋白質在宿主細胞中天然發(fā)生。如同本文中所使用，術語“回收的(recovered)”、“分離的(isolated)”和“分開的(sepatated)”是指化合物、蛋白質、細胞、核酸或氨基酸從與其天然相關的至少一個組分中移出。如本文中所使用，與細胞有關的術語“轉化的(transformed)”、“穩(wěn)定轉化的(stablytransformed)”和“轉基因的(transgenic)”是指細胞具有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合進細胞的基因組中或者作為游離型質粒經(jīng)過多代依然被保留。如本文中所使用，術語“表達(expression)”是指基于基因的核酸序列而產(chǎn)生多肽的過程。該過程既包括轉錄又包括翻譯。在將核酸序列插入細胞的上下文中，術語“導入的(introduced)”是指“轉染(transfection)”、或“轉化(transformation)”或“轉導(transduction)”，并且包括涉及將核酸序列引入真核或原核細胞中，其中所述核酸序列可以被整合入該細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，被轉變成自主復制子，或被瞬時表達(例如轉染的mRNA)。如本文中所使用，術語“比活力(specificactivity)”表示酶單位，由酶制劑在特定條件下每單位時間使底物轉化成產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)所定義。比活力被表示為單位(U)/毫克蛋白。如本文所使用，術語“酶單位(enzymeunit)”是指酶的用量，是在試驗條件下每給定量時間產(chǎn)生給定量產(chǎn)物的酶量。在一些實施方式中，酶單位(enzymeunit)是指在特定的試驗條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物的酶量。例如，在一個實施方式中，術語“葡糖淀粉酶活性單位(glucoamylaseactivityunit”(GAU)被定義為在60℃和pH4.2的試驗條件下，每小時從可溶性淀粉底物(4％ds)產(chǎn)生1g葡萄糖所需的酶量。在另一個實施方式中，顆粒淀粉水解酶單位(granularstarchhydrolyzingenzymeunit(GSHEU))被定義為是指在試驗條件下，例如25℃、pH5.0下，每分鐘從顆粒淀粉中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一個優(yōu)選的實施方式中，GSHEU被定義為是指在50℃下、在pH4.5下每分鐘從顆粒淀粉底物中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。術語“產(chǎn)量(yield)”是指使用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的終-產(chǎn)物或期望的終-產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)量大于使用本領域已知方法所產(chǎn)生的產(chǎn)量。在一些實施方式中，該術語是指終產(chǎn)物的體積；以及在其它實施方式中，該術語是指終產(chǎn)物的濃度?！癆TCC”是指位于Manassas，VA20108的美國模式培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC；<www.atcc.com>)。“NRRL”是指美國農業(yè)研究菌種保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)，NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(并且以前被稱為USDANorthernRegionalResearchLaboratory)，Peoria，ILL?！耙粋€(a)”、“一(an)”或“該(the)”包括復數(shù)形式指代，除非上下文中另外明確指出。如本文中所使用，術語“包括(comprising)”和其同源詞以其包含性的意義使用；也就是說，等同于術語“包含(including)”及其相應的同源詞。B.優(yōu)選的實施方式具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)——在一個實施方式中，具有GSH活性的asAA得自曲霉屬菌株，例如米曲霉、白曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。在優(yōu)選的實施方式中，具有GSH活性的asAA得自白曲霉菌株。在特別優(yōu)選的實施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3列出的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在進一步的實施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少95％序列同一性的氨基酸序列。asAA還可以包括與SEQIDNO3有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在進一步的實施方式中，具有GSH活性的asAA包括SEQIDNO3的氨基酸序列。在一些實施方式中，SEQIDNO3或與其具有至少85％同一性的序列被認為是完整型asAA。在一些實施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化結構域。在其它實施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO10的SBD具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的SBD。在進一步的實施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQIDNO8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQIDNO10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在優(yōu)選的實施方式中，催化結構域和SBD得自白曲霉菌株的α淀粉酶。在其它實施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型酶。在一些實施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將包括SEQIDNO3的氨基酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％，而在其它實施方式中截短型asAA將包括與SEQIDNO3具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％。酶可以在多肽的羧基端被截斷。在一些實施方式中，截短型asAA將包括SEQIDNO3或與其具有至少90％序列同一性的序列的至少430個、至少440個、至少450個、至少460個和至少470個氨基酸。在一些實施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將包括SEQIDNO9的催化域的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％，或者包括與SEQIDNO9的催化域具有至少97％、98％和99％序列同一性的序列的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％。在一些實施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將包括SEQIDNO9的催化域或者包括與其具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列以及與SEQIDNO8具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的接頭。優(yōu)選地，截短型酶將包括與SEQIDNO9具有至少97％的序列同一性的催化域和與SEQIDNO8具有至少95％的序列同一性的接頭。在一些實施方式中，截短型酶將包括與SEQIDNO9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的催化域，并且至少約5、10、20、25、30和35個氨基酸位于該催化域的下游。在其它實施方式中，截短型酶將包括如上所定義的催化域和接頭并且進一步包括與SEQIDNO10的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的一部分SBD。這一部分SBD將包括位于所述接頭下游的至少約5個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個和100個氨基酸。在其它實施方式中，包括SEQIDNO3的氨基酸序列或者與SEQIDNO3有至少95％序列同一性的氨基酸序列的asAA，由與SEQIDNO1有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的多核苷酸編碼。在特別優(yōu)選的實施方式中，編碼SEQIDNO3的asAA(AsaA)的核酸序列是SEQIDNO1的核酸序列。重組表達的酶和宿主細胞——在本發(fā)明的一些實施方式中，微生物被遺傳工程化，以表達具有GSH活性的異源asAA，并且微生物還可以被工程化，以表達異源葡糖淀粉酶。優(yōu)選的宿主細胞是絲狀真菌細胞。在優(yōu)選的實施方式中，絲狀真菌宿主是曲霉屬某種(Aspergillussp)、木霉屬某種(Trichodermasp)、鐮刀霉屬某種(Fusariumsp)和青霉屬某種(Penicilliumsp)的菌株。特別優(yōu)選的真菌宿主細胞包括構巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮鐮孢霉(F.solani)。曲霉屬菌株在Wardetal.(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuuretal.，(2002)CurrGene4189-98中被公開。在最優(yōu)選的實施方式中，宿主是木霉屬的菌株，并且特別是里氏木霉(T.reesei)的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限制性例子包括ATCCNo.13631、ATCCNo.26921、ATCCNo.56764、ATCCNo.56765、ATCCNo.56767和NRRL15709。在一些優(yōu)選實施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neissetal.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology2046-53中被公開。在一些優(yōu)選的實施方式中，木霉屬宿主細胞或曲霉屬宿主細胞被遺傳工程化，以表達具有GSH活性的asAA，該asAA特征在于與SEQIDNO3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在進一步的實施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQIDNO8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQIDNO10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在優(yōu)選的實施方式中，asAA得自白曲霉菌株的α淀粉酶。在其它實施方式中，本發(fā)明包括編碼SEQIDNO3的多肽、SEQIDNO9的多肽或如本文中所定義的截短型酶的多核苷酸。在一些實施方式中，編碼asAA的多核苷酸將具有核苷酸序列SEQIDNO1的核酸序列或與SEQIDNO1具有至少70％的序列同一性的核酸序列。在一些實施方式中，在被工程化以包括編碼具有GSH活性的asAA的異源多核苷酸的宿主細胞中所產(chǎn)生的asAA將具有不同的性質，例如相比起由在天然宿主中具有GSH活性的asAA的內源表達所產(chǎn)生的asAA具有改善的性質。這些性質可以包括，例如提高的酶活、在較低pH水平下提高的酶穩(wěn)定性或提高的比活。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明異源產(chǎn)生的具有GSH活性的asAA將表現(xiàn)出如下pH范圍內的最高pH活性3.0至6.0的pH范圍；3.0至5.0的pH范圍；3.5至5.0的pH范圍；以及，同樣地，在3.5至4.5的pH范圍內。在其它實施方式中，異源產(chǎn)生的asAA，在pH3.0、3.5、4.0、4.5和/或5.0的pH水平下，相比于在基本上相同的條件下從天然宿主內源產(chǎn)生的相應asAA，將具有更高的穩(wěn)定性或殘余活性。在一些實施方式中，在具體的pH水平下，相比于在同一pH水平下內源表達的asAA，異源產(chǎn)生的asAA的酶穩(wěn)定性水平將高出至少0.5倍、至少1.0倍、至少2.0倍或至少2.5倍。在一些實施方式中，異源表達的具有GSH活性的asAA的這些提高的性質或不同的性質在木霉屬宿主細胞中特別明顯。在一些實施方式中，異源表達的asAA將作為具有GSH活性的完整型asAA而被產(chǎn)生，該完整型asAA含有催化結構域、接頭和SBD，例如圖2所示性說明的成熟多肽(SEQIDNO3)。在其它實施方式中，異源表達的asAA將作為具有GSH活性的截短型asAA而被產(chǎn)生，例如，其中SBD被部分地或全部地從催化結構域切割掉。在其它實施方式中，被遺傳工程化以表達具有GSH活性的asAA的宿主菌，還可以被遺傳工程化以便表達異源GA。在本發(fā)明中有用的宿主菌可能之前業(yè)已通過遺傳工程進行操作。在一些實施方式中，遺傳工程化宿主細胞或菌株可以是蛋白酶缺陷型菌株。在其它實施方式中，真菌宿主細胞的多種天然基因的表達將被減少或被失活。這些基因包括，例如編碼蛋白酶和纖維素分解酶的基因，如內切葡聚糖酶(endoglucanases(EG))和外切纖維二糖水解酶(exocellobiohydrolases(CBH))的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美國專利5,650,322公開了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。也參考USP5,472,864。載體——盡管下面的描述具體指asAA，本領域的技術人員將容易理解，相同或相似的方法適用于DNA構建物和載體，用于將編碼GA的多核苷酸導入宿主細胞中。根據(jù)本發(fā)明，構建包括編碼本發(fā)明涉及的asAA之核酸的DNA構建物，以便將asAA轉移進宿主細胞。在一個實施方式中，DNA構建物通過表達載體被轉移進宿主細胞，該表達載體包括可操縱性連接到asAA編碼序列上的調節(jié)序列。載體可以是任何載體；當被導入真菌宿主細胞時，該載體被整合進宿主細胞基因組并被復制。對于載體列表，參考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，<WWW.fgsc.net>)。合適的表達載體和/或整合載體的另外的例子被提供于上文中的Sambrooketal.，(1989)、上文中的Ausubel(1987)、vandenHondeletal.(1991)inBennettandLasure(Eds.)MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPresspp.396-428以及美國專利5,874,276中。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。在優(yōu)選的實施方式中，編碼本發(fā)明涉及的asAA的核酸被可操縱性連接到合適的啟動子，其在真菌宿主細胞中顯示轉錄活性。該啟動子可以源自相對于宿主細胞是同源的或異源的蛋白質編碼基因。優(yōu)選地，該啟動子在木霉屬宿主中是有用的。啟動子的合適的非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一個實施方式中，啟動子對于宿主細胞而言是天然的啟動子。例如，當里氏木霉是宿主時，啟動子是天然的里氏木霉啟動子。在優(yōu)選的實施方式中，啟動子是里氏木霉cbh1，其是誘導型啟動子并且以登記號D86235(AccessionNo.D86235)被存于Genbank中?！罢T導型啟動子(induciblepromoter)”為在環(huán)境調控或發(fā)育調控下具有活性的啟動子。在另一個實施方式中，啟動子為對于真菌宿主細胞而言是異源的啟動子。有用的啟動子的其它例子包括來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunbergetal.，(1984)Mol.CellBiol.42306-2315和Boeletal.，(1984)EMBOJ.31581-1585)、黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏木霉纖維素二糖水解酶1(EPA137280A1)的基因的啟動子。在一些優(yōu)選的實施方式中，asAA編碼序列被可操縱性地連接到信號序列上。編碼信號序列的DNA優(yōu)選地是與將被表達的asAA基因天然關聯(lián)的序列。優(yōu)選地，信號序列由編碼Ak-asaA的白曲霉asaA基因編碼。更優(yōu)選地，信號序列與SEQIDNO2的信號序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的實施方式中，包括在將被導入真菌宿主細胞中的DNA構建物或載體之中的信號序列和啟動子序列來自相同的來源。例如，在一些實施方式中，信號序列是可操縱性連接到cdh1啟動子上的cdh1信號序列。在一些實施方式中，表達載體還包括終止序列。在一個實施方式中，終止序列和啟動子序列來自相同的來源。在另一個實施方式中，終止序列與宿主細胞同源。一個特別合適的終止子序列是來自木霉屬菌株特別是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nubergetal.，(1984)，見上文；和Boeletal.，(1984)，見上文)。在一些實施方式中，表達載體包括選擇標記。優(yōu)選的選擇標記的例子包括賦予抗微生物抗性的標記(例如潮霉素和腐草霉素)。也發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)選擇標記在本發(fā)明中有用，包括本領域已知為amdS、argB和pyr4的那些標記。在用于木霉轉化的載體系統(tǒng)中有用的標記在本領域中是已知的。(參見，例如Finkelstein，BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI中第6章，F(xiàn)inkelsteinetal.Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；以及Kinghornetal.(1992)APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一個優(yōu)選的實施方式中，選擇標記是amdS基因，其編碼酶-乙酰胺酶，從而允許轉化細胞依靠乙酰胺作為氮源而生長。構巢曲霉amdS基因作為選擇標記的使用在Kelleyetal.，(1985)EMBOJ.4475-479和Penttilaetal.，(1987)Gene61155-164被描述。包括具有編碼asAA的多核苷酸的DNA構建物的表達載體，可以是能夠在給定的真菌宿主微生物中自主復制或能夠整合進宿主的DNA中的任何載體。在一些實施方式中，表達載體是質粒。在優(yōu)選的實施方式中，考慮了兩種類型的表達載體，用以獲得基因表達。第一表達載體包括DNA序列，其中啟動子、asAA編碼區(qū)以及終止子都起源自將被表達的基因。在一些實施方式中，通過缺失不期望的DNA序列(例如編碼不需要的結構域的DNA)來截短基因，以留下在其自身轉錄和翻譯調節(jié)序列的控制下而被表達的結構域。第二類型表達載體被預先裝配，并包含高水平轉錄所需的序列，以及選擇標記。在一些實施方式中，asAA基因的編碼區(qū)或其部分被插入這一通用表達載體，使得其處于表達構建物啟動子和終止子序列的轉錄控制下。在一些實施方式中，基因或其部分被插入強cbh1啟動子的下游。用于連接包括編碼asAA的多核苷酸、啟動子、終止子和其它序列的DNA構建物的方法以及用于將它們插入到合適載體中的方法，在本領域中是已知的。連接(linking)通常通過在適宜的限制位點進行連接反應(ligation)而完成。如果這類位點不存在，則根據(jù)常規(guī)實踐，使用合成的寡核苷酸接頭。(參見，Sambrook(1989)，見上文；以及BennettandLasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego(1991)pp70-76。)。另外，使用已知的重組技術，可以構建載體(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology)。當期望獲得具有一個或多個失活基因的真菌宿主細胞時，可以使用已知的方法(例如，美國專利5,246,853、美國專利5,475,101和WO92/06209中公開的方法。)?；蚴Щ羁梢酝ㄟ^完全或部分缺失、通過插入失活或通過使得基因對于它的預期目的無功能化的任何其它手段(這樣基因被阻止而不能表達功能蛋白)而實現(xiàn)。已被克隆的任何來自木霉屬某種或其它絲狀真菌宿主的基因可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實施方式中，可以通過用本領域已知的方法，將欲被失活的期望基因的一種形式插入到質粒中，實現(xiàn)基因缺失。然后，在位于期望基因編碼區(qū)內部的適宜限制性酶切位點(一個或多個)處切割缺失質粒，并用選擇標記取代基因編碼序列或其部分。待被缺失基因的座位側翼的DNA序列(優(yōu)選約0.5至2.0kb之間)，保持在標記基因的任一邊。適宜的缺失質粒通常具有存在于其中的單一限制性酶切位點，以使得含有缺失基因的片段，包括側翼DNA序列和選擇標記基因能夠被作為單一線性片段而被去除。宿主細胞的轉化、表達和培養(yǎng)——將DNA構建物或載體導入到宿主細胞包括技術，例如轉化；電穿孔；核顯微注射；轉導；轉染(例如，脂轉染介導的和DEAE-Dextrin介導的轉染)；與磷酸鈣DNA沉淀物溫育；用DNA包被微粒進行的高速轟擊；以及原生質體融合。普通轉化技術在本領域中是已知的(參見，例如上文Ausubeletal.，(1987)，第9章；以及上文Sambrook(1989)，和Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。異源蛋白在木霉屬中的表達被描述在USP6,022,725；美國專利6,268,328；Harkkietal.(1991)；EnzymeMicrob.Technol.13227-233；Harkkietal.，(1989)BioTechnol.7596-603；EP244,234；EP215,594；以及Nevalainenetal.，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″，inMOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，Eds.LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp.129-148。對于曲霉屬菌株的轉化，還參考Caoetal.，(2000)Sci.9991-1001、EP238023以及Yeltonetal.(1984)Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474。優(yōu)選地，用載體系統(tǒng)構建遺傳上穩(wěn)定的轉化體，從而編碼asAA的核酸被穩(wěn)定整合進宿主菌株染色體中。然后，通過已知技術純化轉化體。在一個非限制性例子中，在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上，通過它們更快的生長速率和形成具有平滑而非粗糙的輪廓的圓形菌落，從不穩(wěn)定轉化體區(qū)分出含有amds標記的穩(wěn)定轉化體。另外，在一些情況下，通過使轉化體生長在固體非選擇性培養(yǎng)基(即，缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上、從該培養(yǎng)基收獲孢子，并測定這些孢子隨后在含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長的百分比，進行進一步的穩(wěn)定性試驗。替代地，本領域中已知的其它方法可以被用來選擇轉化體。在一個具體的實施方式中，用于轉化的木霉屬某種(Trichodermasp.)的制備過程包括從真菌菌絲體制備原生質體。(參見Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實施方式中，菌絲體得自萌發(fā)的營養(yǎng)孢子。菌絲體用酶處理，該酶消化細胞壁產(chǎn)生原生質體。然后，原生質體，在懸浮培養(yǎng)基中，在滲透穩(wěn)定劑存在下得到保護。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常，這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M至1.2M之間變化。優(yōu)選的是，在懸浮培養(yǎng)基中使用約1.2M山梨醇溶液。DNA被吸收進宿主木霉菌菌株取決于鈣離子濃度。通常，約10mMCaCl2至50mMCaCl2之間的濃度被用在吸收溶液中。在吸收溶液中除了需要鈣離子外，通常包括的其它化合物是緩沖體系，例如TE緩沖液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0緩沖液(嗎啡啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認為，聚乙二醇起著融合細胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基中的內容物被輸送至木霉菌菌株的細胞質中以及質粒DNA被轉移到核。該融合經(jīng)常使得多拷貝質粒DNA能夠整合進宿主染色體。通常，含有木霉菌原生質體或細胞的懸浮液被用于轉化，所述原生質體或細胞已經(jīng)在105至107/mL，優(yōu)選2×106/mL的密度下經(jīng)過透性處理。將100μL體積的、在適宜溶液(例如1.2M山梨醇；50mMCaCl2)中的這些原生質體或細胞與期望的DNA混合。通常，高濃度的PEG被加入到吸收溶液。0.1至1體積的25％PEG4000可以被加入到原生質體懸浮液。然而，優(yōu)選的是將約0.25體積加入到原生質體懸浮液中。添加劑例如二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到吸收溶液并幫助轉化。對于其它真菌宿主細胞，相似的步驟也是可以利用的。(參見，例如美國專利6,022,725和6,268,328，兩者都被引入作為參考)。一般而言，該混合物隨后在大約0℃下溫育10至30分鐘。然后，另外的PEG被加入到混合物，以進一步提高對期望基因或DNA序列的吸收。25％PEG4000通常以轉化混合物之體積的5至15倍的體積被加入；然而，更多或更少的體積都可以是適合的。25％PEG4000優(yōu)選以轉化混合物之體積的10倍體積被加入。在加入PEG之后，然后在加入山梨醇和CaCl2溶液之前，將轉化混合物或者在室溫下或者在冰上溫育。然后，原生質體懸浮液被進一步加入到生長培養(yǎng)基的熔融等分試樣中。當該生長培養(yǎng)基含有生長選擇(例如乙酰胺或抗生素)時，該生長培養(yǎng)基僅允許轉化體生長。一般而言，細胞在含有生理鹽和養(yǎng)分的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)(參見，例如Pourquie，J.etal.，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.etal.，AcademicPress，pp.71-86，1988和Ilmen，M.etal.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。也發(fā)現(xiàn)普通商業(yè)上制備的培養(yǎng)基(例如酵母麥芽提取物(YeastMaltExtract(YM))培養(yǎng)液、LuriaBertani(LB)培養(yǎng)液和沙氏葡萄糖(SabouraudDextrose)(SD)培養(yǎng)液)在本發(fā)明中有用。培養(yǎng)條件也是標準的，(例如，在振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐中，在適宜的培養(yǎng)基中，于大約28℃，溫育培養(yǎng)物直至獲得asAA表達的期望水平)。對于一種給定的絲狀真菌，優(yōu)選的培養(yǎng)條件在本領域中是已知的；并可以在科學文獻中和/或從真菌來源處，例如AmericanTypeCultureCollection(美國模式培養(yǎng)物保藏中心)和FungalGeneticsStockCenter(美國堪薩斯州醫(yī)學中心真菌遺傳學庫中心)查找到。在建立起真菌生長后，細胞被暴露于有效導致或允許本文所定義的asAA表達的條件中。在具有GSH活性的asAA編碼序列受誘導型啟動子調控的情況下，誘導劑(例如糖、金屬鹽或抗菌劑)被以誘導asAA表達的有效濃度加入到培養(yǎng)基。asAA活性的鑒定——為了評價用編碼本發(fā)明所涉及的asaA之異源多核苷酸轉化的細胞系表達具有GSH活性的asAA，可以在蛋白質水平、RNA水平或通過使用特別針對α淀粉酶活性和/或產(chǎn)生的功能生物學鑒定法而進行試驗。通常，所使用的試驗包括RNA印跡法、斑點印跡法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈式反應)或原位雜交，使用適當標記的探針(基于核酸編碼序列)以及常規(guī)DNA印跡法和放射自顯影。另外，具有GSH活性的asAA的產(chǎn)生和/或表達可以在樣品中直接測量，例如，通過直接測量培養(yǎng)基中的還原糖例如葡萄糖的試驗和通過測量葡糖淀粉酶活性、表達和/或產(chǎn)量的試驗進行。對測量GSH活性有用的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過任何方便的方法被測量，例如通過使用葡萄糖試劑盒No15-UV(SigmaChemicalCo.)或儀器例如TechniconAutoanalyzer進行測量。還參考可從InstrumentationLab.(Lexington，MA)通過商業(yè)渠道獲得的葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒。另外，基因表達可以通過免疫學方法評價，例如對細胞的免疫組織化學染色；組織切片；或組織培養(yǎng)基的免疫測定，例如通過蛋白質印跡或ELISA進行評價。此類免疫測定可以被用于定性或定量評價asAA的表達。此類方法的細節(jié)對于本領域技術人員而言是已知的，并且用于實踐這類方法的許多試劑是商業(yè)可得的。α淀粉酶活性可以通過使用DNS法被測定，如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所描述。葡糖淀粉酶活性可以通過3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylicacid(DNS))法被測定(參見，Gotoetal.，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)。在本發(fā)明的一些實施方式中，由木霉屬或曲霉屬宿主表達的具有GSH活性的asAA為每升1克蛋白質以上(g/L)、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，以及也可以是培養(yǎng)基的100g/L以上。純化asAA的方法——通常，細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的asaA(包括n-asAA或r-asAA)被分泌到培養(yǎng)基中，并且可以被純化或分離，例如通過從細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中除去不需要的組分而被純化或分離。在一些情況下，AsaA可以以細胞形式被產(chǎn)生，這使得從細胞裂解液回收成為必要。在這樣的情況下，使用本領域技術人員常規(guī)采用的技術，從酶被產(chǎn)生的細胞中純化酶。例子包括，但不限于，親和層析(Tilbeurghetal.，(1984)FEBSLett.16215)；離子交換色譜法(Goyaletal.，(1991)Biores.Technol.3637；Fliessetal.，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhaietetal.，(1984)J.Appl.Biochem.6336；和Ellouzetal.，(1987)Chromatography396307)，包括使用具有高分辯能力的物質的離子交換(Medveetal.，(1998)J.ChromatographyA808153)；疏水相互作用色譜(TomazandQueiroz，(1999)J.ChromatographyA865123)；兩相分配(Brumbauer，etal.，(1999)Bioseparation7287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅膠上或陽離子交換樹脂例如DEAE上進行的色譜；層析聚焦；SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)；硫酸銨沉淀和凝膠過濾，使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。發(fā)酵——在本發(fā)明的一些實施方式中，表達異源asAA的真菌細胞在分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵條件下生長。典型的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成成分在發(fā)酵開始時被設定，并且在發(fā)酵過程中不經(jīng)受人為改變。因此，在發(fā)酵開始時，用期望的生物體(一種或多種)接種培養(yǎng)基。在此方法中，在不向系統(tǒng)加入任何成分的情況下，允許發(fā)酵發(fā)生。典型地，依據(jù)碳源的加入，分批發(fā)酵可稱為“分批”，并且經(jīng)常努力控制因素例如pH和氧濃度。分批系統(tǒng)的代謝物和生物物質組成持續(xù)變化，直至發(fā)酵停止的時刻。在分批培養(yǎng)物中，細胞由遲緩期進入到高速生長的對數(shù)期，最終達到生長速率降低或停止的穩(wěn)定期。如果不處理，處于穩(wěn)定期的細胞最終死亡。通常，處于對數(shù)期的細胞負責大量產(chǎn)生終產(chǎn)物。在標準分批體系中的變化是“喂料-分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)”系統(tǒng)，該系統(tǒng)也在本發(fā)明中有用。在典型的分批系統(tǒng)的這種變化中，隨著發(fā)酵的進程，底物以一定增量加入。當分解代謝物阻遏傾向于抑制細胞代謝和期望在培養(yǎng)基中具有限量的底物時，喂料-分批系統(tǒng)是有用的。測量喂料-分批系統(tǒng)中的實際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)可測量的因素例如pH、溶解的氧和廢氣例如CO2分壓的變化進行估計。分批和喂料-分批發(fā)酵在本領域中是常見和熟知的。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中確定的發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)加入到生物反應器中，同時移出等量的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)，以進行發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵通常使培養(yǎng)物維持在恒定的高密度，其中細胞主要處于對數(shù)生長期。連續(xù)發(fā)酵允許調節(jié)影響細胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一種因素或任意數(shù)量的因素。例如，在一個實施方式中，限制性營養(yǎng)物例如碳源或氮源被維持在固定的速率，所有其它參數(shù)允許調節(jié)。在其它系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以持續(xù)改變，而由培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力保持穩(wěn)態(tài)生長條件。因此，由于培養(yǎng)基的排除導致的細胞損失必須依據(jù)發(fā)酵中的細胞生長速率進行平衡。調節(jié)營養(yǎng)物和生長因素以進行連續(xù)發(fā)酵工藝的方法以及使產(chǎn)物形成速率最大化的技術是工業(yè)微生物領域熟知的。植物表達——在一些實施方式中，編碼本發(fā)明涉及的asAA的多核苷酸可以在植物宿主中被轉化和表達。本文中所使用的宿主植物包括特定的植物部分和其子代。植物部分包括莖、葉、根和種子，以及還包括特定的組織，例如但不限于胚芽和胚乳。宿主植物可以是雙子葉植物，例如大豆、煙草、番茄、馬鈴薯、甜菜或單子葉植物例如禾谷植物(如玉米、大麥、小麥、高梁、水稻和類似的禾谷植物)。用于植物轉化的DNA構建物可以通過本領域中熟知的方法構建而成。DNA構建物將包括感興趣的asAA基因的編碼區(qū)和任選包括啟動子序列和選擇標記，所述感興趣的asAA基因被可操作性地連接到在植物中表達所需要的調控序列上。調控序列包括啟動子和終止子序列。對啟動子的選擇取決于表達是否將是組成型、誘導型或組織特異性或是否在特定的發(fā)育階段(參見Tagueetal.，PlantPhysiol.(1988)，86506)。對于組成型表達，下面的啟動子可能是有用的，35SCaMV、19SCaMV、Adh、胭脂氨酸合成酶(Nos)、蔗糖合成酶、cab、PepCase、水稻肌動蛋白(例如Actl)(McElroyetal.，(1990)PlantCell2163)、α-tublin和玉米泛蛋白1(maizeubiquitin1)(Christensenetal.，(1989)PlantMol.Biol.12619-632)。誘導型啟動子是僅在植物被暴露于一些特定的外部刺激時才啟動轉錄的啟動子。誘導型啟動子的例子包括化學誘導和創(chuàng)傷誘導啟動子，例如PR啟動子(如PR-1、PR-2、PR-3以及特別是煙草PR-1a啟動子(USP5,614,395))或噬菌體T7啟動子。創(chuàng)傷誘導啟動子包括蛋白酶抑制劑的啟動子(例如多酚氧化酶、LAD和TD的啟動子)和馬鈴薯pin2的啟動子(Xuetal.，(1993)PlantMol.Biol22573-588)。組織特異性啟動子例如胚乳啟動子包括zmGBS，玉米顆粒結合型淀粉合成酶基因啟動子；ZmZ27，玉米醇溶蛋白基因啟動子；osGT1，水稻谷蛋白1基因啟動子以及PR5，水稻谷醇溶蛋白基因啟動子(Russelletal.，(1997)TransgenicRes.6157-168)。誘導型、組成型和組織特異型植物啟動子對于本領域普通技術人員是熟知的。增強子序列經(jīng)常被整合進植物轉化載體，以增強基因表達。增強子可以包括，例如，內含子序列例如玉米adh1基因的內含子。選擇標記是容易獲得的并且在本領域中已知的?？梢允褂美鏱ar-bialaphos或EPSPS-草甘膦選擇系統(tǒng)(Whiteetal.，(1990)Nucl.AcidsRes.181062)、hph潮霉素磷酸轉移酶(Blochingetal.，Mol.CellBiol.42929-2931)、和nptll卡那霉素抗性基因(Messingetal.，(1982)Gene19259-268和Bevanetal.，(1983)Nature304184-187)。用在DNA構建物和/或表達載體的多種轉錄終止子是可得的。合適的終止子序列包括那些已知在植物中起作用的終止子，例如但不限于35SCaMV終止子、tml終止子、胭脂氨酸合成酶(Nos)終止子和pesrbcSE9終止子。根據(jù)傳統(tǒng)的已知技術，DNA構建物或表達載體可以被整合進宿主植物或植物部分。這些技術中的一些技術對于雙子葉植物優(yōu)選包括根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移，對于單子葉植物優(yōu)選包括微粒轟擊、PEG介導的原生質體轉化、電穿孔，以及還包括農桿菌感染。(參考USP6,803,499、USP6,777,589、Potrykusetal.，(1985)Mol.Gen.Genet199169-177、Potrykus(1990)Biotechnol8535、Kleinetal.，(1987)Nature32770-73、Shimamotoetal.，(1989)Nature338274、Frommetal.，(1990)Biotechnol.8833-839)。許多適合與這些轉化系統(tǒng)一起使用的載體是可得的。(參見McElroyetal.(1991)Mol.Gen.Genet.231150-160)。基因表達可以通過本領域已知的方法以及本領域所描述的測量真菌表達的方法測量。組合物——根據(jù)本發(fā)明特別有用的酶組合物是顆粒淀粉水解酶組合物，其包括與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的asAA。在一些實施方式中，asAA得自asAA并且特別是白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶在木霉屬或曲霉屬宿主中的異源表達。本發(fā)明的另一個特別有用的酶組合物是包括與SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％序列同一性的截短型asAA的顆粒淀粉水解酶組合物。在進一步的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物將包括具有GSH活性的asAA酶的組合，其包括a)與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的具有GSH活性的完整型asAA；和b)具有GSH活性的截短型asAA。在一些實施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將是與SEQIDNO9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在一些實施方式中，具有GSH活性的完整型asAA的量與在酶組合物中具有GSH活性的asAA的總量相比，至少為約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和98％。在其它實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物中，具有GSH活性的完整型asAA與具有GSH活性的截短型asAA的比率將是約10％至90％、20％至80％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、50％至50％、55％至45％、60％至40％、65％至35％、70％至30％、80％至20％和90％至10％(完整型比截短型)。在一些優(yōu)選的實施方式中，完整型和截短型的比率將在約40％至60％和約60％至40％之間。在一些實施方式中，asAA可作為無細胞濾液被獲得(例如其中asAA從培養(yǎng)基中被分離得到)，而在其它實施方式中，asAA可從含有真菌宿主細胞的培養(yǎng)基中獲得，所述真菌宿主細胞表達和分泌含有GSH活性的asAA。在進一步的方面，本發(fā)明包括含有從木霉屬細胞產(chǎn)生的具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α蛋白酶(asAA)的發(fā)酵或培養(yǎng)基，所述木霉屬細胞包括編碼與SEQIDNO3有至少90％序列同一性的asAA的異源多核苷酸。如本領域的技術人員所理解地，用在組合物中的具有GSH活性的asAA的量和本發(fā)明的方法將取決于asAA的酶活性。在一些實施方式中，存在于酶組合物的asAA的范圍為每gds為0.01至40SSU/gds；0.01至30SSU/gds；0.01至20SSU/gds；0.01至15.0SSU/gds和0.01至10SSU/gds。根據(jù)本發(fā)明另一個特別有用的酶組合物是如上公開的顆粒淀粉水解酶組合物，其另外包含葡糖淀粉酶。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)可以是野生型或者是遺傳修飾的葡糖淀粉酶，其包括變種和雜種葡糖淀粉酶。一般來說，葡糖淀粉酶可以源自細菌、植物和真菌來源。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的優(yōu)選葡糖淀粉酶是由幾種絲狀真菌菌株和酵母菌株產(chǎn)生的。具體而言，從曲霉屬和木霉屬菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是重要的。這些葡糖淀粉酶的來源包括黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其變體(Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136和USP6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶及其變體(Hataetal.，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)以及Aspergillusshirousami(參見Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chenetal.(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chenetal.，(1994)BiochemJ.302275-281)。葡糖淀粉酶還得自踝節(jié)菌屬(Talaromyces)的菌株例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜熱踝節(jié)菌(T.thermophilus)的那些菌株(WO99/28488；USPNo.RE32,153；和USPNo.4,587,215)；根霉屬的菌株例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉屬(Mucor)菌株；木霉屬菌株，例如里氏木霉和綠色木霉；以及腐質霉屬菌株，例如灰腐質霉(參見Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136；Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Tayloretal.，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；US專利4,514,496；US專利4,092,434；以及Jensenetal.，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。在本發(fā)明中有用的其它葡糖淀粉酶包括得自羅氏阿太菌(Atheliarolfsii)的那些葡糖淀粉酶及其變體(WO04/111218)。商業(yè)上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶，例如是從黑曲霉產(chǎn)生的酶(來自GenencorInternationalInc.，商品名為DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904X)或根霉屬的種產(chǎn)生的酶(來自ShinNihonChemicals，Japan，商品名為CU.CONC)。也可以是商業(yè)消化酶，商品名為GLUCZYME，來自AmanoPharmaceuticals，Japan(Takahashietal.，(1985)J.Biochem.98663-671)。另外的酶包括根霉屬某種(Rhizopussp.)的3種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW74,000)、“Gluc2”(MW58,600)和“Gluc3”(MW61,400)”。發(fā)現(xiàn)Gluc1在本發(fā)明中特別有用。一些GA酶也是顆粒淀粉水解酶(一種或多種)GSHE(參見，例如Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。這些GA-GSHEs不僅具有葡糖淀粉酶活性，而且能夠水解顆粒(粗)淀粉。GA-GSHEs已經(jīng)從真菌細胞中回收得到，尤其已經(jīng)從絲狀真菌細胞例如腐質屬某種(Humicolasp.)、曲霉屬某種(Aspergillussp.)、木霉屬某種(Trichodermasp.)以及根酶屬某種(Rhizopussp.)中回收得到。米根霉GA-GSHE已經(jīng)被描述在Ashikarietal.，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP4,863,864中。也可參考雪白根霉?；腋|酶GA-GSHE被描述于Allisonetal.，(1992)Curr.Genet.21225-229；Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-852；Camposetal.，(1995)App.AndEnviron.Microbiol.612436-2438和歐洲專利171218。編碼該酶的基因在本領域中也稱為為“gla1”。泡盛曲霉河內變種(Aspergillusawamorivar.kawachi)GA-GSHE被描述在Hayashidaetal，(1989)Agric.Biol.Chem53923-929。AspergillusshirousamiGA-GSHE由Shibuyaetal.，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用于本發(fā)明的一種具體的酶制劑包括從BioconIndia，Ltd，India可獲得的以名稱“M1”出售的酶制劑。在一些優(yōu)選的實施方式中，葡糖淀粉酶是源自木霉屬的GA-GSHE，特征在于具有SEQIDNO11的蛋白質序列或與SEQIDNO11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在其它優(yōu)選的實施方式中，葡糖淀粉酶是源自曲霉屬的GA-GSHE，特征在于具有SEQIDNO13的蛋白質序列或與SEQIDNO13具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在一個實施方式中，GA-GSHE酶可以源自灰腐質霉的菌株，特別是灰腐質霉高溫變種的菌株(參見，美國專利4,618,579)。在一些優(yōu)選的實施方式中，灰腐質霉GA-GSHE酶從包括ATCC16453、NRRL(USDANorthernRegionalResearchLaboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224和NRRL15225的真菌以及其基因改造菌株中回收。這些種產(chǎn)生免疫學上相同的葡糖淀粉酶酶制劑(參見EP0171218)。在其它優(yōu)選的實施方式中，灰腐質霉GA-GSHE可以具有SEQIDNO12的蛋白質序列或與SEQIDNO12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在酶組合物中有用的葡糖淀粉酶的量是在0.001至10.0GAU/gds、也在0.01至10.0GAU/gds以及也在0.1至10.0GAU/gds的范圍內。GA-GSHE制劑的活性可以根據(jù)葡糖淀粉酶的活性被定義。在一些實施方中，酶組合物將包括與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、98％和99％的序列同一性的asAA和葡糖淀粉酶，其中asAA得自asAA的異源表達，尤其是白曲霉asAA在木霉屬和青霉屬中的異源表達。該葡糖淀粉酶可以是未被遺傳修飾的酶或該酶可以是變種或雜種GA。在其它實施方式中，酶組合物將包括葡糖淀粉酶、完整型asAA和如上所定義的截短型asAA的組合。在一些優(yōu)選的實施方式中，GA得自曲霉屬菌株，例如DISTILLASE_。在其它實施方式中，GA得自根霉屬、木霉屬或腐質霉屬菌株。更具體地，在一些實施方式中，asAA酶組合物將與葡糖淀粉酶組合，該葡糖淀粉酶包括與序列SEQIDNO11、SEQIDNO12或SEQIDNO13具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的氨基酸序列。盡管不意欲于限制本發(fā)明，其它特別優(yōu)選的酶組合物包括下面的組合a)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；b)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和與SEQIDNO9具有至少96％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；c)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶、與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA、和與SEQIDNO9具有至少96％的序列同一性的asAA；d)本發(fā)明包含的asAA酶組合物和含有與SEQIDNO11有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；e)本發(fā)明包含的asAA酶組合物和含有與SEQIDNO12有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；和f)本發(fā)明包含的asAA酶組合物和含有與SEQIDNO13有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。一些特別有用的酶組合物包括與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。另一個特別有用的酶組合物包括與SEQIDNO3有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。仍然另一個特別有用的酶組合物包括與SEQIDNO9有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。在一些實施方式中，具有GSH活性(SSU)的asAA與GA活性(GAU)的比率在40∶1至1∶40的范圍內、還在30∶1至1∶30的范圍內、還在20∶1至1∶20的范圍內和15∶1至1∶15的范圍內。在進一步的實施方式中，該比率(SSU比GAU)將在約20∶1至1∶10的范圍內；約10∶1至1∶10；約10∶1至1∶5；約5∶1至1∶5；約4∶1至1∶4；約3∶1至1∶3；約2∶1至1∶4以及還在約2∶1至1∶2的范圍內。在一些優(yōu)選的實施方式中，SSU與GAU的比率將在約4∶1至2∶1之間。在其它實施方式中，具有GSH活性的asAA和GA以這樣的比率存在當在相同的條件下以相同的水平被供給時，該比率使得對底物中的顆粒淀粉的水解大于這些酶的相加結果。在一些情況下，水解將增加至少1.0倍、增加至少1.5倍、增加至少2.0倍、以及還增加至少3.0倍。本發(fā)明的組合物所包含的成分的精確量將取決于酶的組合。通常，具有GSH活性的asAA以每克淤漿干固體約0.01至15.0SSU的量與顆粒淀粉底物的淤漿混合。在一些實施方式中，具有GSH活性的asAA以每克淤漿干固體約0.01至10.0SSU、約0.01至5.0SSU、約0.05至10.0SSU、約0.05至5.0SSU、約0.1至10.0SSU、約0.1至5.0SSU、約0.1至2.0SSU、約0.25至2.5SSU、約0.5至5.0SSU、約0.5至2.5SSU以及也以約0.5至1.5SSU的量被加入。如本領域人員所理解，用在本發(fā)明的方法和組合物中的葡糖淀粉酶的數(shù)量取決于該葡糖淀粉酶的酶活性。通常，每克(ds)被調節(jié)到20-45％干固體的淤漿中可以加入0.001至10.0GAU的量的葡糖淀粉酶。在一些實施方式中，葡糖淀粉酶以每克(ds)淤漿0.01至10GAU之間、0.01至5.0GAU之間、0.05至5.0GAU之間、0.1至10.0GAU之間、0.1至5.0GAU之間、0.1至2.0GAU之間、0.25至1.5GAU之間的葡糖淀粉酶的量被加入。在一個優(yōu)選的實施方式中，葡糖淀粉酶的劑量范圍為從0.1至2.0GAU/g(ds)淤漿。附加的酶可以被包括在本發(fā)明所涉及的組合物和方法中。這些在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)有用的附加的酶包括脫支酶，例如支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。這類酶水解α-1，6-糖苷鍵。因此，在淀粉水解期間，脫支酶從淀粉的非還原端連續(xù)除去葡萄糖單元。可以用在本發(fā)明的組合物中的另一個酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。這些是外部作用產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylases)，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷鍵的水解。這些酶中的一些，特征在于具有從4.5至7.0的最適pH范圍和從40℃至65℃的最適溫度范圍。商業(yè)β淀粉酶可獲自例如GenencorInternationalInc.的SPEMZYMEBBA和OPTIMALT。附加的酶可以包括α淀粉酶，其特征可以在于或不在于具有GSH活性。α淀粉酶的例子既包括細菌和真菌α淀粉酶又包括其變體。具體的非限制性的例子包括來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的α淀粉酶和其變種或雜種(USP5,093,257；USP6,093,562；USP5,736,499；USP5,958,739；USP6,436,888；USP6,867,031；WO96/39528；WO96/23874和WO05/001064)。商業(yè)可得的α淀粉酶是SPEZYMEFRED和SPEZYMEETHYL(GenencorInternationalInc.)。也發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精葡聚糖轉移酶(cyclodextringlucanotransferases(CGTases))(E.C.2.4.1.19)及其變體可用在本發(fā)明中(USP5,278,059；USP5,545,587和WO05/003337)?？梢员皇褂玫倪M一步的附加酶是蛋白酶，例如真菌和細菌的蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如得自曲霉屬、木霉屬、毛酶屬和根霉屬的那些蛋白酶，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米赫毛霉(M.miehei)。其它酶包括但不限于纖維素酶，例如內切葡聚糖酶；半纖維素酶，例如甘露聚糖酶；脂肪酶(例如E.C.3.1.1.3)、葡糖氧化酶；果膠酶；木聚糖酶、轉葡糖苷酶和α-1，6-葡糖苷酶(例如E.C.3.2.1.20)和角質酶(cutinases)(例如E.C.3.1.1.74)。被包括在本發(fā)明的方法中的這些酶的有效量可以被本領域技術人員容易地確定。在一些實施方式中，抗菌素可以被加入到本發(fā)明的組合物和發(fā)酵培養(yǎng)基中。抗菌素是殺死或抑制微生物生長的化合物。包括根據(jù)本發(fā)明的asAA的酶組合物，可以包括用于淀粉轉化特別是顆粒淀粉轉化的組合物；清洗組合物(cleaningcompositions)；用于紙和紙漿生產(chǎn)的組合物；釀造組合物；烘烤組合物(bakingcompositions)；用于增甜劑的組合物以及類似物。在一個優(yōu)選的實施方式中，在一個優(yōu)選的實施方式中，包括本發(fā)明的asAA和任選地asAA與葡糖淀粉酶之組合的酶組合物將被用于產(chǎn)生醇。在一些實施方式中，使用本發(fā)明的組合物，至少8％、10％、12％、14％、16％和18％的乙醇被生產(chǎn)。在一些實施方式中，乙醇將在同步糖化發(fā)酵期間被產(chǎn)生。在一些實施方式中，酶組合物將同時與顆粒淀粉底物的淤漿和乙醇產(chǎn)生微生物組合，并且混合物在單一步驟中被發(fā)酵。該淤漿可以具有約10-50％ds；約10-45％ds；約15-40％ds；約20-40％ds；約25-40％ds；或約25-35％ds。顆粒淀粉底物可以得自任何植物部分，包括莖、谷粒、根和塊莖。特別優(yōu)選的植物來源包括玉米、小麥、黑麥、高梁、水稻、黍、大麥、木薯(cassava)、豆科植物例如豆類(bean)和豌豆、馬鈴薯、甘薯、香蕉、甘蔗和木薯(tapioca)。特別考慮的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。來自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，包括玉米固體物(cornsolids)，例如玉米仁(kernels)、麩(brans)和/或玉米穗(cobs)。此外，谷?？梢员环旨?fractionated)(例如，對于玉米，分級為胚乳、胚芽或纖維(麩)；以及對于小麥，分級為谷蛋白(gluten)、淀粉A和B)。淀粉可以是經(jīng)過淀粉精制工藝的高度精制的生淀粉(highlyrefinedrawstarch)或原料(feedstock)。本領域的一般技術人員將熟知可以利用的方法，這些方法可以被用于制備在本發(fā)明所涉及的方法中所使用的顆粒淀粉底物。這些方法中的一些包括使用錘磨機和輥式粉碎機對整谷粒進行干法磨粉，以及包括濕磨法。在一些實施方式中，經(jīng)過磨碎的谷粒之至少80％、70％、60％、50％、40％、30％將通過0.5mm的篩。在其它實施方式中，細小的顆粒大小是優(yōu)選的；并因此，磨碎了的谷粒之至少80％、85％、90％和95％將通過0.5mm的篩。仍然在其它實施方式中，磨碎了的谷?？梢允谴植陬w粒；在這些情況下至少90％的磨碎谷粒將通過1.0mm、1.5mm或2.0mm的篩，但僅僅約少于5％、10％和15％將通過0.5mm的篩。各種各樣的淀粉是商業(yè)上可得的。例如，玉米淀粉可以從Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；小麥淀粉可以從Sigma獲得；甘薯淀粉可以從WakoPureChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；以及馬鈴薯淀粉可以從NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(Japan)獲得。多篇參考文獻已經(jīng)報道了在谷粒中發(fā)現(xiàn)的淀粉的數(shù)量，并且查閱了TheAlcoholTextbook，3rdEd.K.Jacquesetal.，Eds.1999，NottinghamUniversityPress。例如，玉米含有約60-68％的淀粉；大麥含有約55-65％的淀粉；黍含有約75-80％的淀粉；小麥含有約60-65％的淀粉；以及精白米(polishedrice)含有約70-72％的淀粉。在一些實施方式中，顆粒淀粉底物被漿化(通常使用水)并且淤漿包括i)約10％到約55％的干固體含量(ds)；ii)約15％到約50％的干固體含量；iii)約20％到約45％的干固體含量；iv)約25％到約45％的干固體含量；v)約30％到約45％的干固體含量；vi)約30％到約40％的干固體含量；以及vii)約30％到約35％的干固體含量。使顆粒淀粉淤漿與根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在顆粒淀粉底物中的淀粉糊化溫度以下的溫度中接觸，以產(chǎn)生葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明的方法所使用的精確溫度，取決于所使用的具體淀粉底物。通常的淀粉糊化溫度范圍公開在Swinkels，STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY第32-38頁，edsVanBeynumetal.，(1985)MarcelDekkerInc.，NY和THEALCOHOLTEXTBOOK，AREFERENCEFORTHEBEVERAGE，F(xiàn)UELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，edsJacquesetal.，1999，NottinghamUniversityPress，UK。在一些實施方式中，本發(fā)明包含的方法將在至少約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的溫度中進行。在其它實施方式中，該溫度將在約25-65℃、約30-65℃、約35-65℃、約40-65℃和約45-65℃之間。在其它實施方式中，該溫度將在約25-45℃、約25-40℃和約30-35℃之間。在優(yōu)選的實施方式中，淀粉底物未曾經(jīng)受用以液化的熱條件。在一些實施方式中，本發(fā)明包括的方法將在pH3.0至7.0之間、pH3.0至6.0之間、pH3.0至5.0之間、3.5至6.0之間、pH3.5至5.0之間和pH3.5至4.5之間的pH范圍內進行。在一些實施方式中，該方法的停留時間為約2至300小時，但更通常地2至120小時。在一些實施方式中，該方法被進行約5至100小時。在其它實施方式中，該方法被進行約5至80小時。仍然在其它實施方式中，該方法被進行至少約5小時但100小時以下。在其它實施方式中，該步驟被進行至少約10小時但100小時以下。在一些實施方式中，顆粒淀粉的干固體之至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％被水解。在一些實施方式中，顆粒淀粉底物被完全水解。在一些實施方式中，在100小時中，顆粒淀粉的至少90％被水解。在某些實施方式中，在24小時內，至少90％的顆粒淀粉底物被水解。在其它實施方式中，在24小時內，至少95％的顆粒淀粉底物被水解。葡萄糖的產(chǎn)量(總的增溶的干固體的百分數(shù))可以至少約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。在一些實施方式中，葡萄糖可以被用于產(chǎn)生高果糖糖漿。在優(yōu)選實施方式中，葡萄糖被連續(xù)產(chǎn)生并基本上所有葡萄糖都被用在該方法中，以產(chǎn)生終產(chǎn)物，例如乙醇和副產(chǎn)品如DDGS。(參考MOLECULARSTRUCTUREANDFUNCTIONOFFOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCHETAL，APPLIEDSCIENCEPUBLISHERS，LONDON)。葡萄糖也可以用于發(fā)酵產(chǎn)生其它終產(chǎn)物，包括，但不限于有機酸、酶、甘油、氨基酸、抗壞血酸中間體以及其它復合化合物，例如激素和抗生素。實驗提供下面的實施例以展示和進一步示例性說明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方式和方面，并不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實際上，預期的是，這些教導將用于進一步優(yōu)化本文中描述的方法系統(tǒng)。在隨后的公開和試驗部分，使用了下面的縮寫具有GSH活性的asAA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；asaA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶，如SEQIDNO3中所說明，并且其得自asAA在白曲霉中的內源性表達)；Tr-asaA(白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶在里氏木霉宿主中的表達)；AkAA(具有SEQIDNO3的酸穩(wěn)定性α淀粉酶并且有時與asaA互換使用)；GA(葡糖淀粉酶)HGA(包括SEQIDNO12的序列的灰腐質霉GA)；TrGA(包括SEQIDNO11的序列的木霉屬GA)；wt％(重量百分比)；℃(攝氏度)；rpm(轉/每分鐘)；H2O(水)；dH2O(去離子水)；d1H2O(去離子水，Milli-Q過濾)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(體積摩爾濃度)；mM(體積毫摩爾濃度)；μM(體積微摩爾濃度)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘/數(shù)分鐘)；hr(s)(小時/數(shù)小時)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；DO(溶解氧)；鄰苯二甲酸鹽緩沖液(于水中的鄰苯二甲酸鈉，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2])；SDS(十二烷基磺酸鈉)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)；w/v(重量體積比)；w/w(重量比)；v/v(體積比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，PaloAlto，CA)；DDGS(含固體干酒糟)；MT(公噸)；和EtOH(乙醇)。下面的試驗和方法被用于下面提供的實施例中葡糖淀粉酶試驗使用熟知的試驗測量葡糖淀粉酶活性，該試驗基于葡糖淀粉酶催化對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside(PNPG))水解成葡萄糖和對硝基苯酚的能力。在堿性pH中，硝基苯酚形成與葡糖淀粉酶活性成比例的黃顏色，并且在400nm下被監(jiān)測，并與酶標準品比較，計量為GAU。1個“葡糖淀粉酶活性單位(GlucoamylaseActivityUnit)”(GAU)被定義為產(chǎn)生1克還原糖所需的酶的量，計算為在pH4.2、于60℃，每小時由可溶性淀粉(4％ds)產(chǎn)生的葡萄糖。酸穩(wěn)定性α淀粉酶活性(acid-stablealphaamylaseactivity)的測量是基于在pH4.5于50℃中，通過酶樣品的等分試樣水解可溶性馬鈴薯淀粉底物(4％ds)的程度。使用DNS法測量還原酶含量，如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428所描述。1單位的酶活力(SSU，可溶性淀粉單位(solublestarchunit))相當于在具體的溫育條件中，每分鐘釋放1mg葡萄糖的還原能力?？偟矸酆康臏y定酶-酶淀粉液化和糖化方法(雙酶法)被用于測定總淀粉含量。在典型的分析中，2g干樣品被放入100ml科耳勞奇瓶(Kohlraucshflask)中，并且加入45mlpH7.0的MOPS緩沖液。該淤漿被充分攪拌30分鐘。加入1.0mlSPEZYMEFRED(1∶50稀釋于水中)，并加熱到沸騰，持續(xù)3-5分鐘。該瓶被置于加壓釜中，維持在121℃中，達15分鐘。在熱壓處理后，該瓶被置于95℃水浴中，加入1ml的1∶50稀釋的SPEZYMEFRED，并溫育45分鐘。調節(jié)pH到pH4.2，而溫度被降到60℃。隨后加入20ml醋酸鹽緩沖液，pH4.2。通過加入1.0ml的1∶100稀釋的OPTIDEXL-400(來自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)進行糖化，并于60℃持續(xù)溫育18小時。通過于95℃加熱10分鐘，終止酶反應。使用葡萄糖作為標準物，利用HPLC分析測定總糖組成。從總糖中減去在室溫下未經(jīng)酶處理之樣品的水抽提物中的可溶性淀粉水解產(chǎn)物。殘留淀粉碘試驗將發(fā)酵醪(beer)(發(fā)酵液)樣品在2ml塑料離心管中離心。傾去上清液，將含有沉淀的管置于冰浴中。將幾滴0.025N碘溶液(0.1N碘，來自VWR目錄號VW3207-1，稀釋4×)被加到該沉淀中，并混合。陽性(+)淀粉顯示的顏色范圍是藍色到紫色，并且顏色強度與淀粉濃度成正比。陰性結果(-)保持淡黃色。總蛋白分析使用Kieldhal法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC)，(1983)，Methods22B608thEd.StPaul，MN)，測定樣品配制液中的總氮(N)。蛋白質含量由6.25×總氮計算出。乙醇和糖類測定使用HPLC法測定樣品中乙醇和碳水化合物組成，如在此所述a)將1.5mLEppendorf離心管裝滿發(fā)酵罐發(fā)酵醪，并在冰上冷卻10分鐘；b)該樣品管在Eppendorf臺式離心機(Eppendorftabletopcentrifuge)中離心1分鐘；c)將0.5mL上清液樣品轉移到含0.05mL的Kill溶液(1.1NH2SO4)的試管中，并允許靜置5分鐘；d)將5.0mL水加入到試管樣品中，然后通過0.45μm尼龍針頭過濾器(NylonSyringeFilter)過濾到HPLC瓶中；和e)在HPLC上運行。HPLC條件a)乙醇系統(tǒng)柱PhenomenexRezexOrganicAcidColumn(RHM-單糖)#00H-0132-KO(等同于Bio-Rad87H)柱溫60℃流動相0.01NH2SO4流速0.6mL/min檢測器RI注射體積20μLb)糖類系統(tǒng)柱PhenomenexRezexCarbohydrate(RCM-單糖)#00H-0130-KO(等同于Bio-Rad87H)柱溫70℃流動相納米純DIH2O流速0.8mL/min檢測器RI注射體積10μL(3％DS材料)該柱基于糖類的分子量分離，這些糖類被稱為DP1(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(聚合度大于3的寡糖)。如下制備用在實施例7-16中的asaA。在表達asaA的里氏木霉(根據(jù)實施例2和3制備)的發(fā)酵結束時，通過離心分離生物量，并且使用10,000分子量截留超濾膜(cut-offultrafiltrationmembrane)濃縮澄清的培養(yǎng)物濾液。使用該具有90SSU/g的超濾濃縮液。如下制備用在實施例7-16中黑曲霉葡糖淀粉酶使用如在USP3,249,514中描述的經(jīng)選擇的黑曲霉菌株。發(fā)酵之后，使用包括過濾和離心在內的常規(guī)分離方法，分離真菌菌絲體。通過在5℃中進行超濾，濃縮該澄清的濾液，達到規(guī)定的活力。實施例1克隆白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因。從白曲霉菌絲體過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。根據(jù)制造商關于真菌的指示，使用FastDNAKit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM方案。就勻漿化過程而言，將樣品在FastPrepInstrument上，以速度4.0處理30秒。依據(jù)A.Kaneko，etal.(Kanekoetal.，(1996)，J.FermBioeng81292-298)的asaA序列，設計PCR引物。正向引物包含用于定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。α6引物的序列是CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQIDNO.6)，而Akaa3引物的序列是CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQIDNO.7)。通過凝膠提取法(gelextraction)(GelPurificationKit，Qiagen)，分離2.36kbPCR產(chǎn)物；并根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)方案，克隆入pENTR/D。然后，載體被轉化進以化學方式所致感受態(tài)的Top10大腸桿菌(Top10E.coli(Invitrogen))中，它具有卡那霉素選擇。用限制性酶消化來自幾個克隆的質粒DNA，以確認正確大小的插入物。對幾個克隆中的α淀粉酶基因插入物進行測序(Sequetech，MountainView，CA)(SEQIDNO1)。來自1個克隆的質粒DNA，pENTR/D_Akaa#11，被加入到帶有pTrex3g/amdS目的載體的LR克隆酶反應(LRclonase_reaction)(InvitrogenGateway系統(tǒng))中。在LR克隆酶反應中進行的重組使來自pENTR/D載體的白曲霉asaA代替目的載體之CmR和ccdB基因。該重組在目的載體的cbhI啟動子和終止子之間定向插入asaA。48bp和50bp的重組位點序列，分別保留在α淀粉酶的上游和下游。LR克隆酶反應的等分試樣，被轉化進化學感受態(tài)的Top10E.coli中，并在羧芐青霉素選擇下過夜生長。對幾個克隆中的質粒DNA進行限制性消化，以確認正確的插入物大小。為從細菌質粒中移出真菌表達盒，按照StratageneQuickChange方案，將EcoRI位點3′加入到amdS基因上。確認整個真菌表達盒的序列。用EcoRI消化來自克隆pTrex3g_Akalpha#1(圖4)的質粒DNA，以釋放包括cbhI啟動子asaAcbhI終止子amdS的表達盒。使用標準技術通過瓊脂糖提取方法，純化該7.8kb的表達盒，并且轉化入從公眾可得的菌株QM6a衍生到的里氏木霉菌菌株中，如下面進一步描述。實施例2里氏木霉的生物射彈轉化里氏木霉孢子懸浮液被鋪在直徑～6cm的MABA轉化板的中心處(150μl的5×107-5×108孢子/ml的懸浮液)。然后，該板在生物通風廚中被風干。將阻擋屏(Stoppingscreens)(BioRad165-2336)和微載體固定器(macrocarrierholders)(BioRad1652322)浸泡在70％的乙醇中，并風干。DriRite干燥劑被置于小培養(yǎng)皿(6cmPyrex)中，并用Whatman濾紙覆蓋。將該含有微載體(BioRad165-2335)的微載體固定器平放于濾紙的上面，并將培養(yǎng)皿蓋重新放回去。通過將60mg鎢M-10粒子(微載體，0.7微米，BioRad#1652266)加入到Eppendorf管中，制備鎢粒子懸浮液。加入1ml乙醇(100％)。在乙醇溶液中使鎢渦旋(votex)，并使其浸泡15分鐘。以最大速度，短暫地微量離心Eppendorf管，以沉淀鎢。輕輕倒出乙醇，并用無菌蒸餾水洗滌3次。在水洗滌液被第三次輕倒出后，鎢被重懸在1ml無菌50％甘油中。至少每2周一次配制新鮮的鎢。對于每次轉化，通過將25μl懸浮鎢加入到1.5mlEppenderf管而制備轉化反應物。隨后，依次連續(xù)加入0.5-5μlDNA(XbaI消化的表達盒)、25μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亞精胺。該反應物被連續(xù)渦旋5-10分鐘，使鎢保持懸浮狀態(tài)。然后，Eppendorf管被短暫地微量離心并被輕輕倒出液體。用200μl70％的乙醇洗滌鎢沉淀，短暫微量離心成沉淀并被傾去液體。用200μl100％的乙醇洗滌沉淀，短暫微量離心成沉淀，并倒出液體。將鎢沉淀重懸于24μl100％的乙醇中。將Eppendorf管置于超聲水浴中15秒，并將8μl等分試樣轉移到干燥過的微載體的中心處。該微載體被留置在干燥過的培養(yǎng)皿中，進行干燥。He罐(Hetank)被開啟到1500psi。將1000psi可裂膜(可裂膜圓片(rupturediscs))(BioRad165-2329)用在ModelPDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem(BioRad)中。當鎢溶液變干時，阻擋屏和微載體固定器被插入PDS-1000中。將含有目標里氏木霉孢子的MABA板置于阻擋屏下6cm處。29英寸Hg的真空度被施加到室上，并保持該真空度。氦生物射彈粒子輸送系統(tǒng)(HeBiolisticParticleDeliverySystem)射擊。使該室通風；并且移出MABA板，以在28℃溫育直至菌落出現(xiàn)(5天)。對于該實施例2，配制下面的溶液，改性amdS生物射彈瓊脂(ModifiedamdSBiolisticagar(MABA))每升部分I，在500mldH2O中制備1000×鹽1ml高質量瓊脂(Nobleagar)20gPH達6.0，高壓滅菌部分II，在500mldH2O中制備乙酰胺0.6gCsCl1.68g葡萄糖20gKH2PO415gMgSO4·7H2O0.6gCaCl2·2H2O0.6gpH達4.5，0.2微米過濾除菌；放入150℃烘箱中溫熱，加到瓊脂上，混合，倒板。室溫下保存。1000×鹽每升FeSO4·7H2O5gMnSO4·H2O1.6gZnSO4·7H2O1.4gCoCl2·6H2O1g加到1LdH2O0.2微米過濾除菌實施例3里氏木霉的PEG介導的原生質體融合轉化將萌發(fā)孢子的菌絲體(于30℃，在Difco的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar(PDA))上生長5天)的1-2cm2瓊脂塊(agarplug)，接種到處于250ml、4擋板搖瓶中的50mlYEG(含20g/L葡萄糖的5g/L酵母提取物)培養(yǎng)液中；并在200rpm和30-37℃下，溫育16-20小時。通過將搖瓶內容物轉移進50ml錐形管中并以2500rpm旋轉10分鐘，回收菌絲體。上清液被丟棄而菌絲體沉淀被轉移到250ml、0.22mCA或PES的Corning過濾瓶中，該過濾瓶含有40ml過濾過的β-D葡聚糖酶溶液。該溶液在30℃、200rpm下被溫育2小時，以產(chǎn)生原生質體。原生質體通過過濾收集，經(jīng)過無菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，進入50ml錐形管中。通過以2000rpm離心5分鐘，沉淀原生質體，并且丟棄上清液。用50ml1.2M山梨醇洗滌原生質體沉淀1次；離心(2000rpm，5分鐘)并丟棄上清液。用25ml山梨醇/CaCl2洗滌沉淀。使用血球計對原生質體進行計數(shù)，然后通過以2000rpm離心5分鐘而形成沉淀。丟棄上清液，并將原生質體沉淀重懸于山梨醇/CaCl2中，該山梨醇/CaCl2的體積足以產(chǎn)生原生質體濃度為1.25×108個/ml的原生質體溶液。對于每一轉化，20μg等分試樣的表達載體DNA(體積不大于20μl)被轉移到冰上的15ml錐形管中。原生質體懸浮液(200μl)和50μlPEG溶液被加到每一管中。這被緩慢混合并在冰上溫育20分鐘。PEG(2ml)溶液被加到每一轉化管中并在室溫下孵育5分鐘。4ml山梨醇/CaCl2溶液被加入到每一管中(總體積6.2ml)并被輕輕混合。然后，2ml轉化混合物被加入到3個熔融(50℃)上層瓊脂管中的每一個中。每一上層瓊脂混合物被倒在單獨的轉化板上，并于30℃溫育4至7天。對于采用amdS選擇的轉化，使用乙酰胺/山梨醇板和上層瓊脂。選擇板與轉化板相同，但不含山梨醇。通過轉移分離的菌落到新鮮的含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基中，純化推定的轉化體。如下配制培養(yǎng)基和溶液。1)40mlβ-D-葡聚糖酶溶液——在40ml1.2M山梨醇中，溶解600mgβ-D-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.，SanMateo，CA)和400mgMgSO4·7H2O。2)200mlPEG混合物——在200mldIH2O中，溶解50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O。每月新鮮配制。3)山梨醇/CaCl2溶液——在1.2M山梨醇中溶解50mMCaCl2。4)乙酰胺/山梨醇瓊脂——部分I——在200mldlH2O中溶解0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升華)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20gKH2PO4、0.6gMgSO4·7H2O、0.6gCaCl2·2H2O、1ml1000×鹽(參見下面)，pH調節(jié)到pH5.5，用dH2O使體積達到300毫升，并過濾除菌。部分II——20g高質量瓊脂(Nobleagar)和218g山梨醇被加到1L量筒中，用dlH2O使體積達到700mls，并高壓滅菌。部分II被加到部分I，得到1L的最終體積。5)1000×鹽——混合5gFeSO4·7H2O、1.6gMnSO4·H2O、1.4gZnSO4·7H2O、1gCoCl2·6H2O，并用dIH2O使體積達到1L。過濾除菌。實施例4黑曲霉的PEG介導的原生質體融合轉化從萌發(fā)孢子的黑曲霉板取出2cm2瓊脂塊，接種到50mlYEG(5g/L酵母提取物，含有20g/L葡萄糖)培養(yǎng)液中，其中該培養(yǎng)液處于250ml、4擋板搖瓶中。以200rpm，于30-37℃中，溫育瓊脂塊16-20小時；菌絲體通過無菌Miracloth濾器被收集，并且用溶液A(SolutionA)洗滌。洗滌過的菌絲體被無菌轉移到40ml原生質體化溶液(protoplastingsolution)中，并在30℃、200rpm溫育1-2小時，原生質體化進展被顯微監(jiān)測。原生質體化反應物通過無菌Miracloth被過濾到2個50ml無菌一次性離心管中，并用溶液B(SolutionB)使每一管的體積達到45毫升。在2500rpm下離心原生質體5分鐘，以獲得沉淀，并丟棄上清液。用20ml體積的溶液B再洗滌沉淀2次。該沉淀被重懸在10ml溶液B中，并使用血球計對原生質體計數(shù)。原生質體被再次離心并丟棄上清液。原生質體被新重懸在溶液B中，以達到～1×107個/100μl。在冰上，100μl原生質體溶液被加入到預冷的15ml管中，每一個轉化一個管。10μgDNA以不超過10μl的體積加入。加入溶液C(SolutionC)(12.5ul)，輕輕混合，并在冰上溫育20分鐘。MMS上層瓊脂(對于每一轉化而言，做3管，每管10ml)被熔融并保持在55℃。從冰上移走原生質體；將溶液C(1ml)和溶液B(2ml)加入到每個管中并緩慢混合所述管。1ml原生質體混合物被加入到3個上層瓊脂管中的每一個中，并將所述上層瓊脂倒在MMS板上。對于每一轉化，重復這一操作；并將板于30℃溫育4-7天。溶液A(每500ml)——0.44gK2HPO4、0.34gKH2PO4、48.156g無水MgSO4(FW120.37)；以及加入dIH2O到500ml的終體積，pH5.5。過濾除菌并在室溫下儲藏。原生質體化溶液——在40ml溶液A中，溶解180單位的β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc)。0.2微米過濾器，過濾除菌。溶液B(每500ml)——5ml1MTris，pH7.5；2.77gCaCl2(FW110.99)；109.32g山梨醇(FW182.2；1.2M)；以及加入dIH2O，達到500ml的最終體積。過濾除菌并在室溫下儲藏。溶液C(每500ml)——250gPEG4000；2.77gCaCl2；5ml1MTris，pH7.5；加入dIH2O，達到500ml的最終體積。過濾除菌。MMS瓊脂*——在1LdIH2O中溶解，6g/LNaNO3；0.52g/LKCl；1.52g/LKH2PO4；218.5g/LD-山梨醇；1ml/L痕量元素(參見下文)；10g/L瓊脂(上層瓊脂中的低熔點瓊脂糖)。高壓滅菌。滅菌后，無菌加入10ml50％葡萄糖和1.25ml20％MgSO4·7H2O。*對于amdS選擇，用0.59g/L乙酰胺和3.4g/LCsCl替代MMS中的硝酸鹽。痕量元素溶液在250mldIH2O中溶解，1g/LFeSO4·7H2O8.8g/LZnSO4·7H2O0.4g/LCuSO4·5H2O0.15g/LMnSO4·4H2O0.1g/LNa2B4O7·10H2O50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O混合并加入0.2ml濃HCl以溶解。用dIH2O使體積達到1L。過濾除菌。實施例5用asaA基因轉化的里氏木霉的發(fā)酵和在里氏木霉克隆中的活性分析一般地，遵照Foremanetal.(Foremanetal.(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的發(fā)酵方案進行。更具體地，對于每一個菌株，進行重復發(fā)酵，顯示于圖5A中。用1.5ml冷凍孢子懸浮液，接種0.8L含有5％葡萄糖的Vogels基本培養(yǎng)基(Davisetal.，(1970)METHODSINENZYMOLOGY17A，第79-143頁和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONSOFAMODELORGANISM，OxfordUniversityPress，(2000))。48小時后，將每一培養(yǎng)物轉移到處于14LBiolafitte發(fā)酵罐中的6.2L同樣的培養(yǎng)基中。該發(fā)酵罐在每分鐘8個標準升的氣流下，于25℃以750RPM運行。初始葡萄糖被消耗完后1小時時，25％(w/w)乳糖進料開始進行，并且以碳限制模式進料，以防止乳糖積聚。分別使用葡糖氧化酶測定試劑盒或含有加入以切割乳糖的β-半乳糖苷酶的葡糖己糖激酶測定試劑盒，監(jiān)測葡萄糖和乳糖的濃度(InstrumentationLaboratoryCo.，Lexington，MA)。定期取樣，以監(jiān)測發(fā)酵進展。在InternationalEquipmentCompany(NeedhamHeights，MA)醫(yī)用離心機中，將收集的樣品于50ml離心管中以3/4速度旋轉。在具有MOPS(嗎啡啉丙磺酸)SDS運行緩沖液(runningbufier)和LDS樣品緩沖液的還原條件下，使樣品上清液進行4-12％BIS-TRISSDS-PAGE凝膠試驗(圖5A)。在另外的發(fā)酵中，樣品上清液基本上如上所述進行操作。然而，獲得完整型和截短型Tr-asaA的不同比例。圖5B泳道2示出了50kD和90kD之間的3條主要帶。使用本領域已知的修改方法(Hellmanetal.，(1995)Anal.Biochem.224451-455)消化凝膠上的3條帶。提取肽，使用反相HPLC分離，并測定肽質量和質譜/質譜碎裂模式(ms/msfragmentationpattern)。所得到的肽圖譜確認了兩條較低MW的帶是截短型。一條帶代表截短型asAA，其中截短發(fā)生在SEQIDNO3的氨基酸位置434和580之間；而第二條帶代表截短型asAA，其中截短發(fā)生在SEQIDNO3的大約氨基酸位置581處。每條帶表現(xiàn)出α淀粉酶和GSH活性。實施例6具有GSH活性的天然和重組白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asaA)的pH穩(wěn)定性的比較在pH4.5中，用20mM乙酸鹽緩沖液，將如上所述重組產(chǎn)生的asaA(Tr-asaA)樣品和天然asaA樣品稀釋到相等的蛋白質濃度。反應在pH3至7的pH水平中，于50℃下，在100mM檸檬酸/NaOH緩沖液中進行30分鐘。在樣品管中，將1.0mL反應物加到5mL10％玉米淀粉(CargillFoods，MN)中，該玉米淀粉在100mM、pH4.5的乙酸鹽中。管于50℃中振蕩20分鐘。然后，加入0.5mL2.0％NaOH。管被旋轉，并且使用二硝基水楊酸分析法(DinitoSalicylicAcid(DNS)Assay)(Gotoetal.，(1994)，見上文)測定0.5ml上清液中的還原糖。結果描繪在圖6中。r-asaA在pH3.9下表現(xiàn)出100％的殘余活性。相比之下，n-asaA在pH4.5下表現(xiàn)出100％的殘余活性。實施例7在未蒸煮過的整粒粉碎玉米粉(wholegroundcorn)底物的同步糖化發(fā)酵(SSF)期間，Tr-asaA濃度的效應在來自無細胞培養(yǎng)物濾液的葡糖淀粉酶(GA)的兩個水平(0.5和1.0GAU/g)中，評價Tr-asaA。制備百分之三十六的玉米面粉淤漿，其中含有干玉米浸漬液(drycornsteep)(占玉米面粉的2.5％)。用稀硫酸調節(jié)該淤漿的pH至4.8。淤漿的總干固體是33.85％。在含有100gm(克)醪液(mash)(淤漿)的125ml燒瓶中，進行發(fā)酵。加入期望水平的酶，然后加入3ml增殖的酵母淤漿，以起始發(fā)酵。通過將0.26gm(克)干Fali酵母加入到100gm(克)醪液中，制備酵母接種物，其中醪液中的GA活性為0.9GAU/g原材料固體。該淤漿被置于32℃的水浴中，并輕輕混合約17小時。在不同的時間間隔，取出發(fā)酵樣品(發(fā)酵醪)，進行HPLC分析。72小時后，終止發(fā)酵；并在60℃干燥發(fā)酵醪，以獲得含固體干酒糟(DDGS)。測定DDGS中的淀粉含量，并且通過加入碘，抽樣調查終止發(fā)酵后的發(fā)酵醪中的不溶性固體中的淀粉。在該研究中所使用的酶是黑曲霉GA。表1總結了乙醇水平、醪液固體的碘染色和DDGS的淀粉百分比。表1中所示結果證明了Tr-asaA通過葡糖淀粉酶增強了顆粒玉米淀粉的水解。表1在酵母發(fā)酵條件下，顆粒玉米淀粉轉化成乙醇期間asaA的效應實施例8利用葡糖淀粉酶和α淀粉酶的顆粒淀粉底物的轉化在0.5GAU/gds的葡糖淀粉酶存在下，在同步糖化發(fā)酵條件下，將不同來源的商業(yè)α淀粉酶與Tr-asaA比較。使用在前所述的可溶淀粉底物(solublestarchsubstrate(SSU))法試驗，測定商業(yè)α淀粉酶的活性。表2**表示重組菌使用如實施例7所述的整粒磨碎玉米進行乙醇發(fā)酵。來自表2所列來源的α淀粉酶，以每克磨碎玉米1.0SSU的量加入，葡糖淀粉酶以0.5GAU/g的量加入。在發(fā)酵過程期間，取樣并分析乙醇含量(圖7)。在發(fā)酵之后，分離不溶性固體(DDGS)，并在pH5.0中測定玉米醪液中的殘留淀粉含量。結果總結于表3中。表3平均(Ave)％v/vEtOH表3中的結果清楚地顯示出在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下，Tr-asaA對于幫助葡糖淀粉酶水解顆粒淀粉是非常有效的。另外，如從該表中所觀察到的，在使用本發(fā)明的酶組合時，發(fā)酵中所產(chǎn)生的乙醇百分比(18.44)較大，而DDGS中殘留淀粉百分比(9.0)顯著較低。實施例9使用Tr-asaA的乙醇發(fā)酵中，對整粒破碎小麥(全麥磨碎小麥粉(wholegroundwheat))的評價在36％的全麥磨碎小麥的淤漿中，加入干玉米浸漬液，加入量為2.5％——這基于全麥磨碎小麥的重量。在含有100gm醪液的125ml燒瓶中，進行發(fā)酵。用稀硫酸，將淤漿的pH調到4.8。醪液被稀釋到33.85％ds的終濃度。葡糖淀粉酶(0.5GAU/g磨碎小麥)和asaA(1.0SSU/g整粒磨碎小麥)被加到醪液中。隨后加入3.0ml繁殖的酵母，以起動發(fā)酵。通過將0.26gm的干Fali酵母加入到100gm的醪液中，制備酵母接種物。在伴隨溫和攪拌的同時，于32℃水浴中進行發(fā)酵試驗。在不同的時間間隔取出發(fā)酵液(發(fā)酵醪)的樣品，離心，以對糖類組成和乙醇進行HPLC分析(表4)。表4用于乙醇生產(chǎn)的酵母發(fā)酵中的全麥磨碎顆粒淀粉實施例10底物處理對乙醇產(chǎn)量和含固體干酒糟(DDGS)組成的影響對于燃料醇發(fā)酵，使用錘磨機，使整粒破碎玉米底物經(jīng)受常規(guī)的干法磨粉工藝，以減小顆粒大小。制備3種不同的醪液。處理1(Treatment1(Trt1))是高溫處理，其包括根據(jù)現(xiàn)有技術方法程序，通過噴射蒸煮(jetcooking)，在pH5.6用3.5U/gSPEZYMEETHYL批式液化36％ds的玉米面粉淤漿，該玉米面粉的淤漿中含有0.9％的干玉米浸漬液(drycornsteep(DCS))。該淤漿被置于90℃浴中1.5小時，混合，然后冷卻到30℃，用稀硫酸將pH調節(jié)到5.0。用水進一步稀釋淤漿到32.71％ds。處理2(Treatment2(Trt2))是低溫處理。通過于60℃，用稀硫酸將pH調節(jié)到5.0，溫育36％的、含有0.9％DCS的玉米面粉淤漿3小時而制備醪液。在溫育之前，加入0.05GAU/g葡糖淀粉酶。處理3(Treatment3(Trt3))是室溫處理——在將玉米淤漿用于用0.5GAU葡糖淀粉酶/g玉米和1.0SSU/g玉米的Tr-asaA進行的發(fā)酵之前，在室溫下獲得玉米淤漿。然后，對每一處理進行酵母發(fā)酵，如實施例7所述。在發(fā)酵后，測定乙醇產(chǎn)量，并通過離心分離每一處理的不溶性固體，于60℃干燥，并且測定總糖類含量和氮含量。結果闡明在表5中，其中Trt3是本發(fā)明所涉及的方法。表5在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下，對整粒破碎玉米底物的不同處理的乙醇產(chǎn)量和DDGS組成的比較如從表5示出的結果所觀察到根據(jù)本發(fā)明的方法(Trt3)所處理的DDGS中的殘留淀粉百分比，小于得自現(xiàn)有技術處理(Trt1)或低溫處理(Trt2)的殘留淀粉百分比。與Trt1和Trt2的4.8％或3.8％相比，Trt3的值是3.5％。與現(xiàn)有技術處理(Trt1)相比，根據(jù)本發(fā)明Trt3的DDGS中的總蛋白含量和所產(chǎn)生的乙醇的量較高。實施例11顆粒玉米淀粉與純化的白曲霉α淀粉酶和純化的黑曲霉葡糖淀粉酶的溫育酶純化采用使用AKTA(AmershamPharmacia，Biotech.，NJ)的制備型高壓液相色譜(HPLC)法，純化黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)和白曲霉α淀粉酶(AkAA)，都被從培養(yǎng)物濾液純化而來。在典型的試驗中，使用離心柱(spincolumn)(Bio-Rad，CA)，用10mMMES緩沖液(pH5.75)使兩個粗酶樣品脫鹽，以降低電導率。樣品被帶到2MNH4SO2中。上樣到Q-Sepharose柱(Amersham，Biosciences，NJ)，并用20mMMES緩沖液(pH5.75)洗脫，使用1.5MKCl梯度。具有相應活性的部分被合并在一起并進行濃縮，用于進一步的實驗。顆粒玉米淀粉用純化酶溫育純化酶制備物被加入到于0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的4.0％顆粒玉米淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)中，如下所述用于掃描電子顯微鏡(SEM)分析。在32℃中溫育0.5GAU/g玉米淀粉的純化GA；1.0SSU/g淀粉的純化AkAA；以及組合起來的GA與AkAA，并溫和攪拌。在2、4和8小時的時間間隔時取出等分試樣(0.75ml)，離心；并且通過上面實施例中所述的方法，測定可溶性糖。沉淀被重懸于蒸餾水(5ml)，并被離心。沉淀再次重懸于5ml無水乙醇(99％)中，攪拌以均勻混合并離心。醇處理的沉淀在管中被風干，并用于SEM分析。SEM分析大約200μl干體積被轉移到1.5mlEppendorf管，并且加入0.8ml無水乙醇。組分被渦旋以制備淀粉顆粒的懸浮液。幾滴懸浮液被置于剛清潔過的玻璃蓋玻片上，并允許被風干。用碳粘合劑調整片(carbonadhesivetabs)將蓋玻片安放在樣品臺(specimenstub)上，四周噴涂膠體銀粘合劑(ElectronMicroscopySciences，F(xiàn)t.Washington，PA)，并在ScanCoatSixSputterCoater(EdwardsHighVacuumIntl.Crawley，UK)上用薄層金涂覆。使用Quanta200FEG掃描電子顯微鏡(FEIInc.，Hillsboro，Ore)，在1,000×和5,000×的儀器放大倍數(shù)下，在二級電子成像模式中，于5kv下進行掃描電子顯微。從樣品臺上不同的區(qū)域獲得8到10個圖像。單獨酶處理或組合酶處理對于顆粒玉米淀粉的影響，在圖8和9中被予以例示性說明。水解和顯微檢查圖8例示性說明了還原糖(mg/ml還原當量)，其被測定為作為用AkAA和GA進行的顆粒淀粉水解的結果，4小時后所釋放出的葡萄糖。單獨使用葡糖淀粉酶的顆粒淀粉的降解是4.9mg/ml；單獨使用AkAA的顆粒淀粉的降解僅為0.3mg/ml。然而，使用GA和AkAA組合的顆粒淀粉降解是12.1mg/ml。酶被組合起來的降解值說明了協(xié)同相互作用，其顯著大于這些酶的加和值。使用掃描電子顯微鏡觀察如本實施例所述處理的淀粉顆粒。如圖9所示，用純化的AkAA溫育的玉米淀粉顆粒確實顯示出較小的表面變化。這些表面變化被觀察到是小的針刺小孔。用純化的GA溫育的玉米淀粉顆粒顯示出許多小的清晰的深孔。顯著地，用GA和AkAA的組合溫育的玉米淀粉顆粒顯示出大量寬而深的穿透性腔隙。另外，在用GA和AkAA的組合溫育的顆粒中，觀察到暴露出顆粒中心的層化結構的表面腐蝕。實施例12顆粒玉米淀粉淤漿的干固體百分含量對乙醇產(chǎn)量的影響用水將玉米面粉制成淤漿，獲得36％ds的醪液。在用硫酸將pH調節(jié)到4.5之前，將小量玉米浸漬液(占淤漿的0.2％)與400ppm(0.04％)脲一起加入到醪液中。淤漿的干固體含量從20％ds被調節(jié)至36％ds。在含有總量為100g醪液的125ml瓶中，進行發(fā)酵。酶被稀釋，以便對每一種酶，使用0.5ml的恒定體積。用3ml酵母接種每一個瓶，其中酵母在使用前已繁殖17小時。酵母繁殖步驟涉及將0.5％干Fali酵母加入到含0.5GAU/gGA和1.5SSU/gAkAA的25％ds醪液中；以及在32℃水浴中溫育，同時溫和混合。以約24小時的時間間隔，在60℃中干燥發(fā)酵醪的樣品，以便獲得DDGS。表6DS含量對在75小時時的乙醇產(chǎn)量和DDGS中殘留淀粉的影響除了在高固體下外(數(shù)據(jù)未示出)，幾乎所有在發(fā)酵期間產(chǎn)生的葡萄糖(DP-1)都被轉化成乙醇。對于每一個測試的％DS，AkAA增加了產(chǎn)生乙醇的速率和數(shù)量。在所有情況下，當AkAA與GA結合使用時，DDGS中的淀粉百分比下降；并且進一步地，當與未添加AkAA的DDGS中的淀粉百分比相比時，在來自具有高至36％的玉米淀粉底物的DDGS中發(fā)現(xiàn)的淀粉百分比被減半。圖10顯示，當玉米淤漿中％ds增加時，AkAA對乙醇產(chǎn)量的影響增加。這些結果證實了AkAA對水解顆粒淀粉尤其在高固體百分含量下具有正效應。實施例13在DIH2O中，制備33％的玉米面粉(AzureStandardFarms)淤漿，400ppm脲被加入其中。調節(jié)pH到5.0。在含有100g醪液的125ml瓶中進行發(fā)酵，并且進行下面的處理。A)黑曲霉GA和AkAA以1.0GAU/g和3.0SSU/gds摻混；B)HGA-GSHE在1.0GAU/gds；C)HGA-GSHE在1.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds；D)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和E)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds。這些酶被稀釋，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通過加入1.0ml酵母淤漿來接種發(fā)酵罐之前，制備Fali干酵母在水中的3％淤漿，并在32℃水浴中混合1小時。瓶被置于32℃水浴中，并且溫和混合醪液。在發(fā)酵期間，移取樣品，進行HPLC分析。在72小時之后終止發(fā)酵，并于62℃干燥發(fā)酵醪，獲得DDGS。通過雙酶法測定DDGS的淀粉含量。表7實施例14在DIH2O中制備33％的玉米面粉(AzureStandardFarms)淤漿，400ppm脲被加入其中。用5NH2SO4調節(jié)pH到4.5。在含有100g醪液的125ml燒中，進行發(fā)酵。稀釋如下所示的酶，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通過加入1.0ml酵母淤漿來接種發(fā)酵罐之前，制備Fali干酵母在水中的3％淤漿，并在32℃水浴中混合1小時。瓶被置于32℃水浴中，并且溫和混合醪液。在發(fā)酵期間，移取樣品，進行HPLC分析。在72小時之后終止發(fā)酵，并于62℃干燥發(fā)酵醪，獲得DDGS。通過雙酶法測定DDGS的淀粉含量。對于下面的表8，酶處理是2.25SSUAkAA和0.75GAU/gds的黑曲霉GA-DISTILLASE(AkAA/AnGA)；2.25SSUAkAA和0.72GAU/gHGA(AkAA/HGA)以及2.25SSUAkAA和1.6GAU/gTrGA(AkAA/TrGA)。表8實施例15在DIH2O中制備33％的玉米面粉(AzureStandardFarms)淤漿，400ppm脲被加入其中。用5NH2SO4調節(jié)pH到4.5。在含有100g醪液的125ml燒中，進行發(fā)酵。稀釋如下所示的酶，使得0.5ml被加入到每一瓶中。在通過加入1.0ml酵母淤漿來接種發(fā)酵罐之前，制備Fali干酵母在水中的3％淤漿，并在32℃水浴中混合1小時。瓶被置于32℃水浴中，并且溫和混合醪液。在發(fā)酵期間，在22.5、46和71小時時移取樣品，進行HPLC分析。在71小時之后終止發(fā)酵。黑曲霉葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入到所有瓶中。另外，AkAA酶處理包括a)完整型AkAA和b)圖5B的截短型AkAA酶，它們被合并在一起(參見實施例5)；在固定的AkAA劑量水平1.5SSU/gds下，以完整型比截短型的不同比率進行試驗。增加完整型AkAA與截短型AkAA的比率得到增加的乙醇產(chǎn)率。在發(fā)酵結束時(71小時)，乙醇產(chǎn)率的差別沒在22.5小時時或46小時時顯著。如在圖11所觀察到，在71小時時，具有截短型AkAA所發(fā)生的乙醇產(chǎn)率，比無AkAA的對照組要高。完整型AkAA的量從占總量的0％逐漸提高至50％，導致乙醇產(chǎn)率增加。實施例16支鏈淀粉酶與葡糖淀粉酶和AkAA的組合產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)率制備36％的玉米面粉淤漿，并將干玉米浸漬液以玉米重量的2.5％被加入其中。調節(jié)淤漿的pH到4.8。通過將100gm醪液放置在125ml瓶中，在不經(jīng)任何進一步處理的下，淤漿被用于發(fā)酵。期望量的酶被加入到每一燒中，如表9所示，然后，燒瓶中接種3ml的增殖17小時的酵母。每一條件被重復試驗兩次。所用的酶是來自無細胞培養(yǎng)濾液的黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)，其中所述無細胞培養(yǎng)濾液通過在旋轉蒸發(fā)儀中蒸發(fā)被濃縮到683GAU/gm酶；5540SSU/ml酶的AkAA；和作為OptimaxL-100提供的支鏈淀粉酶。燒瓶被置于30℃水浴中，并用磁性攪拌棒溫和攪拌。在不同的時刻，移出發(fā)酵醪樣品，進行HPLC分析。在72小時后，發(fā)酵被終止。于60℃干燥一部分發(fā)酵醪，獲得DDGS。然后測定DDGSs的淀粉含量。表9如從表9觀察到，支鏈淀粉酶提高了發(fā)酵速度，并稍微增加了乙醇。然而，支鏈淀粉酶似乎對72小時時的終乙醇產(chǎn)率無影響。另外，對于DP＞2、DP-2、DP-1，測量了％w/v，乳酸和甘油數(shù)據(jù)未示出。權利要求1.酶組合物，包括酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶，所述酸穩(wěn)定性α淀粉酶具有顆粒淀粉水解(GSH)活性、并與SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性。2.權利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA與SEQIDNO3的序列具有至少95％的序列同一性。3.權利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA與SEQIDNO3的序列具有至少99％的序列同一性。4.權利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA具有SEQIDNO3的序列。5.權利要求1所述的酶組合物，其中所述葡糖淀粉酶得自絲狀真菌。6.權利要求5所述的酶組合物，其中所述絲狀真菌是曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、腐質霉屬(Humicola)和根霉屬(Rhizopus)。7.權利要求6所述的酶組合物，其中所述曲霉屬是黑曲霉(A.niger)。8.權利要求6所述的酶組合物，其中所述絲狀真菌是木霉屬。9.權利要求1所述的酶組合物，其中所述葡糖淀粉酶具有GSH活性。10.權利要求1所述的酶組合物，其中，在所述酶組合物中，asAA與葡糖淀粉酶活性的比率(SSU∶GAU)是10∶1至1∶10。11.權利要求1所述的酶組合物，進一步包括截短型asAA，所述截短型asAA包括SEQIDNO3的氨基酸序列的至少65％，并與其具有至少95％的序列同一性。12.權利要求1所述的酶組合物，進一步包括選自蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、α淀粉酶及其組合的酶。13.權利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA得自宿主細胞中的異源表達。14.權利要求13所述的酶組合物，其中所述宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。15.權利要求14所述的酶組合物，其中所述絲狀真菌宿主細胞是木霉屬細胞。16.酶組合物，包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性并與SEQIDNO9的序列有至少96％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。17.權利要求16所述的酶組合物，進一步包括葡糖淀粉酶。18.權利要求16所述的酶組合物，進一步包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性并與SEQIDNO3的序列具有至少85％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。19.權利要求17所述的酶組合物，進一步包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性并與SEQIDNO3的序列具有至少85％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。20.權利要求16所述的酶組合物，其中所述asAA得自絲狀真菌宿主細胞中的異源表達。21.權利要求20所述的酶組合物，其中所述宿主細胞是木霉屬細胞。22.酶組合物，包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性并與SEQIDNO3的序列具有至少90％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。23.水解顆粒淀粉的方法，包括使含有顆粒淀粉的底物與權利要求1所述的酶組合物在所述底物中的顆粒淀粉的糊化溫度以下的溫度中接觸，并獲得水解的淀粉，其中所述底物的干固體的至少60％被水解。24.權利要求23所述的方法，其中所述底物得自玉米、小麥、高梁、大麥、黑麥或其組合。25.權利要求24所述的方法，其中所述底物是玉米。26.權利要求23所述的方法，其中所述溫度在35℃至65℃之間。27.提高包括葡糖淀粉酶的組合物的顆粒淀粉水解活性的方法，包括將(a).具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的、并與SEQIDNO3的序列有至少90％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，(b).具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的、并與SEQIDNO9的序列有至少96％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，或(c).a)和b)的組合，與包括葡糖淀粉酶的組合物進行組合；和與在相同的條件下，在包括所述葡糖淀粉酶的組合物中的顆粒淀粉的水解相比，獲得顆粒淀粉水解的增加。28.權利要求27所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶得自曲霉屬、木霉屬、根霉屬或腐質霉屬的菌株。29.權利要求27所述的方法，其中所述水解的淀粉的至少90％是葡萄糖。30.具有α淀粉酶活性和顆粒淀粉水解活性的多肽，包括與SEQIDNO9具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。31.在絲狀真菌宿主細胞中產(chǎn)生具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶的方法，包括a)用DNA構建物轉化絲狀真菌宿主細胞，所述DNA構建物包括在所述絲狀真菌宿主細胞中具有轉錄活性的啟動子，所述啟動子可操作性連接到異源多核苷酸，所述異源多核苷酸編碼具有GSH活性并與SEQIDNO3有至少90％序列同一性的asaA，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉化的絲狀真菌宿主細胞，使得表達所述asAA和c)產(chǎn)生所述asAA。32.權利要求31所述的方法，進一步包括回收所產(chǎn)塵的asAA。33.權利要求31所述方法，其中所述絲狀真菌宿主細胞是木霉屬細胞。34.權利要求33所述方法，其中所述木霉屬細胞是里氏木霉細胞。全文摘要本發(fā)明涉及源自白曲霉菌株的、具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)、具有GSH活性的asAA在絲狀真菌宿主細胞中的異源表達以及包括具有GSH活性的asAA的酶組合物，所述的酶組合物任選包括葡糖淀粉酶。文檔編號C12R1/885GK1981038SQ200580022270公開日2007年6月13日申請日期2005年5月24日優(yōu)先權日2004年5月27日發(fā)明者N·迪恩-科萊曼,S·M·菲斯克,S·E·蘭茨,P·尼夫－克魯托夫,M·J·佩普森,J·K·希泰申請人:金克克國際有限公司