專利名稱：對(duì)酶進(jìn)行篩選和選擇的新方法
目前用于新的酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的策略是由假設(shè)來(lái)驅(qū)動(dòng)的。首先，指定特定應(yīng)用所需要的酶活性，接著使用針對(duì)所指定的酶活性的酶活性試驗(yàn)作為篩選工具來(lái)檢索相關(guān)的酶。典型地，所述檢索包括對(duì)可能表達(dá)想要的酶活性的一種或多種生物進(jìn)行篩選。通常這些生物是微生物，例如細(xì)菌、酵母和真菌。
或者，可針對(duì)編碼或預(yù)期編碼具有想要的酶活性的蛋白的基因，通過(guò)檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定相關(guān)的酶。這些檢索依賴于基于被編碼的基因產(chǎn)物與已知基因產(chǎn)物之間的同源性，向新的基因指派功能(注解(annotation))。當(dāng)目標(biāo)基因已被鑒定出，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆和表達(dá)，可針對(duì)想要的活性對(duì)其產(chǎn)生的蛋白加以測(cè)試。
這些方案最終導(dǎo)致對(duì)具有想要的活性的一種或多種酶的鑒定。一旦這些酶被鑒定出，可在最終的應(yīng)用中針對(duì)正確的功能性對(duì)它們加以測(cè)試。該方案，尤其是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的途徑，受益于大量的、并仍逐步增加的被注解基因的庫(kù)，所述的庫(kù)可從目前的測(cè)序程序獲得。
但是，由假設(shè)驅(qū)動(dòng)的方案也具有若干缺點(diǎn)。例如，在最終應(yīng)用中對(duì)相關(guān)酶的測(cè)試僅發(fā)生在篩選的最后階段，這表明，大量的勞動(dòng)，包括對(duì)大量微生物的培養(yǎng)是否成功僅能在篩選的末尾得到驗(yàn)證。通常其轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ骷僭O(shè)是錯(cuò)誤的，這就導(dǎo)致了針對(duì)錯(cuò)誤的酶活性的檢索以及篩選努力的失敗。
此外還通常發(fā)生如下情況因?yàn)槿鄙賹?duì)應(yīng)用系統(tǒng)的理解，針對(duì)特定最終應(yīng)用的相關(guān)酶活性完全不能被預(yù)先指定。在此類情況下，篩選試驗(yàn)也不能被指定，對(duì)于相關(guān)酶的檢索是不可行的。
在被注解基因用作為用于鑒定新的酶的來(lái)源的情況下，對(duì)于注解的質(zhì)量有強(qiáng)依賴性?？赡馨l(fā)生注解是錯(cuò)誤的這種情況。此外，使用被注解的基因從本質(zhì)上是保守的方案，其不會(huì)導(dǎo)致對(duì)全新的、意想不到的基因產(chǎn)物的鑒定。
雖然(可能的)功能現(xiàn)在能被指派給多種基因，但仍有相當(dāng)數(shù)量的基因不能被注解。未被注解的基因的百分比在不同生物中有所不同，其可能在20-70％的范圍內(nèi)。這意味著，相當(dāng)數(shù)量的基因沒(méi)有包括在以數(shù)據(jù)庫(kù)方案針對(duì)相關(guān)酶的檢索中，由此在基于假設(shè)的篩選中沒(méi)有被利用上。
在基于假設(shè)的篩選中，一直需要酶試驗(yàn)來(lái)鑒定相關(guān)的酶。試驗(yàn)的開(kāi)發(fā)是復(fù)雜的過(guò)程，事實(shí)上通常會(huì)形成酶篩選中的瓶頸。試驗(yàn)開(kāi)發(fā)通常包括合成可用于鑒定相關(guān)酶的合適底物。合成正確的底物通常是試驗(yàn)開(kāi)發(fā)的主要障礙?；蛘?，用于酶的天然底物可被化學(xué)或酶促修飾，使得其成為用于篩選目的的合適底物(例如，染料化合物結(jié)合到天然底物上)。但是，如果合成的底物與天然底物不同，鑒定出的對(duì)合成底物展示活性的酶可能在天然底物上不能展示出活性。
為克服由假設(shè)驅(qū)動(dòng)的方案的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種篩選的補(bǔ)充形式應(yīng)用基質(zhì)篩選。
在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用基質(zhì)篩選中，篩選參數(shù)是應(yīng)用基質(zhì)中的功能性改變。
在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用基質(zhì)篩選中，酶活性不需要預(yù)先指定，即，其無(wú)須在篩選過(guò)程之前已知。這與基于假設(shè)的篩選在原理上就有所不同，在基于假設(shè)的篩選中，首先指定酶活性，所述酶活性應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生想要的基質(zhì)功能性的指定改變，由此選擇或制備能用于探測(cè)前面指定的酶活性的合適的底物。
國(guó)際申請(qǐng)WO 00/67025公開(kāi)了此類基于假設(shè)的方案的例子其公開(kāi)了對(duì)可用于篩選脂肪酶的合成熒光標(biāo)記?；视王サ孜锏闹苽?。由此，這些底物被特意開(kāi)發(fā)，以篩選指定的酶，即，脂肪酶的活性，此外，這些底物與其中將使用脂肪酶的最終應(yīng)用不相似。相反，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用基質(zhì)篩選不以任何方式受限于提前指定酶活性的需要，因此允許對(duì)在基于假設(shè)的方案中沒(méi)有被鑒定為相關(guān)的酶加以鑒定。根據(jù)本發(fā)明的方案將大大增加酶篩選的命中率。
例如，當(dāng)針對(duì)應(yīng)用基質(zhì)中特定功能性改變(例如，大豆原漿粘度的降低)對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，在篩選過(guò)程中會(huì)鑒定出編碼能完成此功能性改變的酶的所有克隆。相反，在基于假設(shè)的篩選中，首先指定能完成此改變的酶活性，例如，蛋白酶或一種或一組特定的細(xì)胞壁降解酶(或其組合)，據(jù)此開(kāi)發(fā)用于在篩選中找到此類酶的酶試驗(yàn)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明因此提供了用于鑒定目標(biāo)酶的方法，其中，在應(yīng)用基質(zhì)上對(duì)一組候選酶進(jìn)行篩選，優(yōu)選地，以至少中等的處理量水平進(jìn)行，針對(duì)在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的能力對(duì)酶加以選擇。
在本發(fā)明的上下文中，在應(yīng)用基質(zhì)中的功能性改變被定義為可通過(guò)任何分析方法測(cè)量或探測(cè)的酶反應(yīng)導(dǎo)致的應(yīng)用基質(zhì)中的任何物理或化學(xué)變化。此類功能性改變的例子是聚集狀態(tài)、顏色、水結(jié)合、粘度、凝膠形成、香味情況、臭味形成等的改變。
相關(guān)酶活性可以是但不限于，蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、連接酶、酯酶、水解酶、糖酶、單加氧酶、雙加氧酶所施加的活性中的至少一種。
具體地，本發(fā)明的方法包括下述步驟a)提供一組侯選酶，b)在應(yīng)用基質(zhì)上篩選所述候選酶的組，優(yōu)選地，以至少中等的處理量水平進(jìn)行，c)選出在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的酶的亞組，d)從所述酶的亞組中選出在進(jìn)一步的應(yīng)用檢驗(yàn)中具有想要的活性的酶，e)確定酶的活性。
對(duì)酶活性的確定可以在本發(fā)明方法的任何階段來(lái)進(jìn)行。但是，無(wú)須之前針對(duì)待篩選酶活性的本質(zhì)對(duì)應(yīng)用基質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
可以以若干種方式產(chǎn)生候選酶的組。例如，候選酶的組通過(guò)在有益于一種或多種酶的表達(dá)的條件下培養(yǎng)的一組微生物來(lái)提供。微生物組的成員可以是不同的微生物物種和/或可以是來(lái)自特定微生物物種的不同菌株。一種或多種酶可以細(xì)胞內(nèi)積累或者可以分泌到培養(yǎng)基中。
為根據(jù)本發(fā)明對(duì)候選酶進(jìn)行篩選，培養(yǎng)各個(gè)克隆(表達(dá)文庫(kù)內(nèi))，直到達(dá)到想要的生物質(zhì)濃度或者想要的細(xì)胞密度。取決于候選酶是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生還是分泌到培養(yǎng)基中，分別制備細(xì)胞提取物或培養(yǎng)上清液用于篩選。
為篩選細(xì)胞內(nèi)積累的酶，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以將細(xì)胞內(nèi)的酶釋放出來(lái)，在根據(jù)本發(fā)明的篩選中與應(yīng)用基質(zhì)發(fā)生相互作用。典型地，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備不含細(xì)胞的提取物。為篩選細(xì)胞外的酶，通過(guò)離心，可選地，接著進(jìn)行超濾步驟，將細(xì)胞從培養(yǎng)液中移出，由此對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選。
優(yōu)選地，通過(guò)在合適的宿主生物中克隆和表達(dá)的一組相應(yīng)基因或cDNA來(lái)提供候選酶的組，即通過(guò)表達(dá)文庫(kù)來(lái)提供。對(duì)于編碼候選酶的組的基因或cDNA的組的來(lái)源和/或宿主生物的選擇將還取決于待選擇的酶的預(yù)期應(yīng)用。
編碼候選酶的組的基因或cDNA的組可以來(lái)自任何目標(biāo)生物，即，動(dòng)物(包括人)或植物物種或微生物。表達(dá)文庫(kù)可以在多種宿主生物中制得，例如細(xì)菌(例如，Escherichia coli、Bacillus subtilis)、酵母(例如，Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis)、有絲真菌(例如，Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、昆蟲(chóng)細(xì)胞或本領(lǐng)域已知的其它蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，例如不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。
優(yōu)選地，在Bacillus subtilis或Escherichia coli中表達(dá)來(lái)自細(xì)菌的基因或cDNA的組，在Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae或Kluyveromyces lactis中表達(dá)來(lái)自酵母的基因或cDNA的組，在例如Aspergillus niger或Aspergillus oryzae中表達(dá)來(lái)自真菌的基因或cDNA的組，在合適的微生物宿主(對(duì)宿主的選擇可以例如取決于被編碼的酶的大小和性質(zhì))中表達(dá)來(lái)自動(dòng)物或植物的基因或cDNA的組。
尤其對(duì)于具有大基因組的生物，例如真核生物而言，優(yōu)選使用cDNA來(lái)提供候選酶的組?？蛇x地，制備和組合來(lái)自在不同條件下培養(yǎng)的生物的不同的cDNA文庫(kù)。
對(duì)于一次命中而言，待篩選的克隆的量除了其它因素之外還取決于基因的組的來(lái)源生物。
在原核生物的情況下，可以從在特定環(huán)境下獲得的mRNA群來(lái)構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。通過(guò)在多種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞以及在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，可以獲得相當(dāng)全面的mRNA譜。用于此的方法是本領(lǐng)域公知的?；蛘撸呀?jīng)描述了一些方法用于構(gòu)建基因組細(xì)菌(表達(dá))文庫(kù)，這是通過(guò)用特定內(nèi)切核酸酶切割基因組DNA并在合適的載體中克隆獲得的DNA片段來(lái)進(jìn)行的。這些方案導(dǎo)致了對(duì)細(xì)菌表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建。
在真核生物(有絲真菌、酵母、植物等)的情況下，表達(dá)文庫(kù)通常以cDNA文庫(kù)的形式來(lái)構(gòu)建。構(gòu)建此類cDNA表達(dá)文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域已知的。因?yàn)檎婧松镏械幕驍?shù)量(范圍從烘焙酵母的大約6,000至植物的大約30,000或更多)比細(xì)菌(大約2,500至大約4,500的范圍內(nèi))高得多，并且因?yàn)楂@得真核生物基因組的完全展示所需的培養(yǎng)條件的數(shù)量也比原核生物高得多，所以給出真核生物基因組的完全展示的表達(dá)文庫(kù)的文庫(kù)大小(克隆的數(shù)量)通常是原核生物所需的10-100倍。結(jié)果，對(duì)真核生物而言，來(lái)自需要被篩選以鑒定特定基因的表達(dá)文庫(kù)的克隆數(shù)量通常比原核生物要大得多。
通過(guò)cDNA的文庫(kù)構(gòu)建方法固有地暗示了表達(dá)庫(kù)的高重復(fù)率大量基因?qū)⒊霈F(xiàn)超過(guò)1次。隨著文庫(kù)中所有基因的展示達(dá)到完全，該重復(fù)率將大幅增加。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，候選酶的組，例如表達(dá)文庫(kù)可被精練，以降低候選對(duì)象的數(shù)量，產(chǎn)生經(jīng)精練的候選酶的組，其也被稱為候選酶的輕巧(smart)組，例如，輕巧型表達(dá)文庫(kù)。
精練過(guò)程可以去除在文庫(kù)中展示了不止一次的大部分克隆，即可以去除重復(fù)克隆。結(jié)果，每種克隆僅有一個(gè)或幾個(gè)代表物留在經(jīng)精練的文庫(kù)中，即，候選酶的精練組。候選酶的精練組將因此含有最小數(shù)量的被認(rèn)為與篩選目的相關(guān)的成員。對(duì)于策略性理由而言，重復(fù)可被有目的地重新引入表達(dá)文庫(kù)，例如，使得對(duì)整個(gè)表達(dá)文庫(kù)培養(yǎng)期間特定克隆的生長(zhǎng)失敗最小化。
精煉過(guò)程還可以從表達(dá)文庫(kù)中去除沒(méi)有或沒(méi)有顯著蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的克隆。結(jié)果，用于根據(jù)本發(fā)明的篩選的經(jīng)精練表達(dá)文庫(kù)富含蛋白質(zhì)過(guò)量生產(chǎn)者的克隆。蛋白質(zhì)過(guò)量生產(chǎn)者是經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的克隆，其表達(dá)來(lái)自克隆基因的蛋白，表達(dá)水平使得克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)情況與未轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主生物的背景蛋白質(zhì)表達(dá)情況可區(qū)分開(kāi)。
根據(jù)本發(fā)明的精練過(guò)程，即例如對(duì)表達(dá)文庫(kù)針對(duì)重復(fù)率和/或蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)進(jìn)行的成員篩選可以以多種方法進(jìn)行。
蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)可以例如作為SDS-PAGE上一條或多條額外條帶的出現(xiàn)被識(shí)別。但是，SDS-PAGE需要付出大量勞動(dòng)，96孔SDS-PAGE具有低分辨率。SDS-PAGE的類似方法，例如，芯片上實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)系統(tǒng)，例如Agilent出售的那些，更適用于至少中等處理量的篩選。
看起來(lái)良好適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)成員進(jìn)行中等或者甚至高處理量篩選的系統(tǒng)是質(zhì)譜?？梢曰谠诶绲鞍姿庀?qū)Υ郎y(cè)文庫(kù)的克隆進(jìn)行質(zhì)譜分析之后所獲得的獨(dú)特印記開(kāi)展精練過(guò)程。此類分析可以在細(xì)胞外(分泌的)以及在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上進(jìn)行。
用于分析細(xì)胞外蛋白的典型程序如下所述。首先通過(guò)離心，以及可選地隨后進(jìn)行超濾步驟和/或適合去除副產(chǎn)品(例如碳水化合物和鹽)的樣品預(yù)處理，從培養(yǎng)液中除去細(xì)胞，對(duì)不含細(xì)胞的上清液進(jìn)行緩沖，以優(yōu)化蛋白水解消化的條件。通過(guò)合適的蛋白酶，例如胰蛋白酶對(duì)樣品進(jìn)行處理，可選地，接著(色譜)脫鹽，并注射進(jìn)質(zhì)譜儀。得到的質(zhì)譜由具有取決于克隆的蛋白組分的分子量分布的肽圖組成。相似克隆將給出相似的圖，允許對(duì)重復(fù)克隆加以鑒定。當(dāng)克隆過(guò)量表達(dá)特定蛋白質(zhì)時(shí)，較之不含過(guò)量表達(dá)的蛋白質(zhì)的克隆而言這將導(dǎo)致質(zhì)譜中額外的肽。額外的肽的分子量與它們的片段化譜一起成為過(guò)量生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的獨(dú)特印記。
為分析細(xì)胞內(nèi)蛋白，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)制備不含細(xì)胞的提取物。優(yōu)選地，使用盡量少與隨后的篩選步驟相互影響的方法來(lái)制備提取物。
各種質(zhì)譜儀都是目前可獲得的，其離子化方法(例如，電噴霧離子化(ESI)或基質(zhì)輔助激光解吸附離子化(MALDI))以及質(zhì)量測(cè)定的方法(例如，飛行時(shí)間(TOF)、四極(Q)、三級(jí)式四極(TQ)或四極飛行時(shí)間(QTOF)、離子回旋加速共振(ICR)、(線性)離子阱等)有所不同。優(yōu)選地，使用具有高分辨率以及工作循環(huán)(duty cycle)的質(zhì)譜儀。在一種設(shè)定中，選用的質(zhì)譜儀與作為離子化技術(shù)的MALDI，以及TOF、QTOF或兩級(jí)或三級(jí)式Q或(線性)離子阱質(zhì)量分析儀一起操作。
上文所述的精練過(guò)程可用于任何表達(dá)文庫(kù)。因此，本發(fā)明提供了一種方法，用于通過(guò)去除重復(fù)和/或通過(guò)去除沒(méi)有或沒(méi)有顯著蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的克隆來(lái)精練表達(dá)文庫(kù)。
在合適的應(yīng)用基質(zhì)上對(duì)未精練的，或優(yōu)選精練的候選酶的組加以篩選，選出能在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的酶的亞組。功能性改變可以是由任何酶反應(yīng)導(dǎo)致的、可被分析方法測(cè)量或探測(cè)到的應(yīng)用基質(zhì)中的任何物理或化學(xué)改變。
用于根據(jù)本發(fā)明的篩選的合適的應(yīng)用基質(zhì)原則上可以是類似目標(biāo)特定最終應(yīng)用的任何基質(zhì)。由此無(wú)須特意針對(duì)篩選特定的預(yù)定酶活性對(duì)應(yīng)用基質(zhì)加以調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，目標(biāo)最終應(yīng)用是食品和/或飼料應(yīng)用。
因此，對(duì)用于篩選的應(yīng)用基質(zhì)的選擇還由其中待篩選酶應(yīng)當(dāng)具有活性的、想要的最終應(yīng)用來(lái)確定。
優(yōu)選地，應(yīng)用基質(zhì)應(yīng)當(dāng)盡可能接近最終(大規(guī)模)應(yīng)用，即，應(yīng)當(dāng)與最終應(yīng)用的底物具有基本相同的組分，和/或至少是最終應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)證代表物。
技術(shù)人員將理解，在不背離本發(fā)明宗旨的情況下，應(yīng)用基質(zhì)可以例如含有與相應(yīng)最終應(yīng)用中存在的量略有不同的量的例如蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂類。例如，可能必須使用比最終應(yīng)用含有更大量的水的應(yīng)用基質(zhì)?；蛘呋虼送?，應(yīng)用基質(zhì)的組分，例如在相關(guān)于蛋白、碳水化合物和/或脂類含量或比例的方面，與最終應(yīng)用的組合物略有不同。
優(yōu)選地，應(yīng)用基質(zhì)的組分與最終應(yīng)用的組分至少70重量％(基于應(yīng)用基質(zhì)以及最終最終的干物質(zhì)含量)對(duì)應(yīng)，更優(yōu)選地，至少80％，進(jìn)一步更優(yōu)選地，至少90％，最優(yōu)選地，至少95％。
優(yōu)選地，應(yīng)用基質(zhì)還應(yīng)當(dāng)在時(shí)間上可再現(xiàn)地生產(chǎn)。在時(shí)間上可再現(xiàn)生產(chǎn)指，應(yīng)用基質(zhì)的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生隨時(shí)間基本相同總組分的基質(zhì)，和/或應(yīng)用基質(zhì)的生產(chǎn)不應(yīng)經(jīng)歷不能被調(diào)節(jié)的季節(jié)性改變。應(yīng)用基質(zhì)還應(yīng)當(dāng)優(yōu)選與在至少中等處理量水平(例如，微滴定板形式)上進(jìn)行的篩選相容，以及優(yōu)選與移液和泵吸過(guò)程相容(例如，沒(méi)有大的塊狀物)。應(yīng)用基質(zhì)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有穩(wěn)定的物理狀態(tài)。
例如，對(duì)于面包制作而言，應(yīng)用基質(zhì)可以是可由其制造面包的特定面團(tuán)，或者，可由其制造面包的面團(tuán)的經(jīng)驗(yàn)證代表物，例如，小麥(或者其它目標(biāo)谷物)面粉或原漿；對(duì)奶酪制造而言，應(yīng)用基質(zhì)可以是全脂(牛)奶或凝乳；對(duì)于醬油去粘化而言，應(yīng)用基質(zhì)可以是濃縮的大豆原漿。
典型地，以中等處理量水平篩選指每周篩選至少一千，例如一千至十萬(wàn)份樣品(克隆)。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的篩選還適于在低處理量水平上進(jìn)行，即，小于每周一千份樣品。
本發(fā)明包括若干種實(shí)施方式，用于在目標(biāo)應(yīng)用基質(zhì)上篩選一組候選酶并且隨后選出在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的酶的亞組。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，選出在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生一般功能性改變的酶的亞組。一般功能性改變是不預(yù)先指定也不限制為特定性質(zhì)的改變的功能性改變。其可以是可被任何分析方法測(cè)量或探測(cè)到的酶反應(yīng)導(dǎo)致的應(yīng)用基質(zhì)中的任何物理或化學(xué)改變。由此不需要指定在目標(biāo)應(yīng)用基質(zhì)中待選擇的酶將獲得何種類型的功能性改變。
對(duì)在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生一般功能性改變的酶的亞組進(jìn)行選擇需要非常普適性的探測(cè)方法和/或技術(shù)，即，能探測(cè)在應(yīng)用基質(zhì)中發(fā)生的任何功能性改變的方法和/或技術(shù)。若干方法和/或技術(shù)可用于該目的，例如下述這些。
熱探測(cè)，例如，微量熱分析，原則上是合適的技術(shù)，因?yàn)閹缀跛?化學(xué))反應(yīng)都伴隨熱量產(chǎn)生的改變(放熱和吸熱)。熱探測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)是其可能不是一直都足夠敏感。
可用于鑒定應(yīng)用基質(zhì)中的一般功能性改變的另一參數(shù)是基質(zhì)的介電常數(shù)。介電探針是可獲得的，其能非常敏感地測(cè)量媒介，例如應(yīng)用基質(zhì)中介電常數(shù)的改變。
基于半導(dǎo)體測(cè)量的技術(shù)，例如電子鼻(electronic nose)和/或嘴(mouth)尤其適合于產(chǎn)生小分子的情況。
合適的技術(shù)還有基于紅外和RAMAN光譜的技術(shù)，例如，F(xiàn)ourier變換紅外光譜(FTIR)。這是探測(cè)紅外光束造成的振動(dòng)躍遷的技術(shù)。光譜中吸收條帶的頻率與振動(dòng)基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能量差相關(guān)。這些吸收條帶對(duì)于特定的原子組是特異的。FTIR產(chǎn)生的光譜可由于應(yīng)用基質(zhì)中的一般功能性改變而變化。
非常適合用于測(cè)量應(yīng)用基質(zhì)中普通改變的技術(shù)是高分辨率超聲波光譜(HRUS)。高分辨率超聲波光譜測(cè)量基于對(duì)通過(guò)應(yīng)用基質(zhì)傳播的、高的超聲波頻率的聲波的速率和衰減加以測(cè)量。HRUS提供了對(duì)廣范圍基質(zhì)屬性的迅速的非破壞性分析。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是超聲波通過(guò)光學(xué)不透明的應(yīng)用基質(zhì)傳播的能力。HRUS使用壓電式換能器產(chǎn)生了縱向變形的超聲波。測(cè)定這些波傳播的主要特征是超聲波速率和超聲波衰減系數(shù)。超聲波速率的值是密度和縱向調(diào)制彈性模量的函數(shù)。超聲波的吸收和散射決定超聲波衰減系數(shù)的值。
總之，HRUS技術(shù)基于測(cè)量當(dāng)超聲波通過(guò)應(yīng)用基質(zhì)時(shí)超聲波發(fā)生的變化。因此，超聲波測(cè)量代表了探測(cè)應(yīng)用基質(zhì)中一般功能性改變的優(yōu)選技術(shù)。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了超聲波光譜，優(yōu)選地，HRUS用于篩選酶活性的用途。特別地，在合適的底物上對(duì)上述候選酶的組加以篩選，針對(duì)能在底物中產(chǎn)生功能性改變的能力選出酶，其中，使用超聲波光譜，優(yōu)選是HRUS來(lái)測(cè)量所述功能性改變。合適的底物可以是想要發(fā)現(xiàn)在其上具有活性的酶的任何底物。優(yōu)選地，合適的底物是上述應(yīng)用基質(zhì)。優(yōu)選地，超聲波光譜以動(dòng)力學(xué)方式進(jìn)行，按照下文所述。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)(普通)功能性改變的探測(cè)用所謂的動(dòng)力學(xué)分析來(lái)進(jìn)行，即，其中反應(yīng)隨時(shí)間進(jìn)行的分析。反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間段可從數(shù)分鐘，例如2或5或10分鐘，變動(dòng)至數(shù)小時(shí)，例如，2或4或8至24小時(shí)。優(yōu)選地，反應(yīng)從起始點(diǎn)開(kāi)始，即，從酶加入到應(yīng)用基質(zhì)中的時(shí)刻開(kāi)始(T＝0)。動(dòng)力學(xué)分析有利地允許了對(duì)相對(duì)背景活性篩選的酶活性的正確測(cè)定，所述背景活性可內(nèi)在性地存在于候選酶的組的成員中和/或存在于應(yīng)用基質(zhì)自身中。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，如上所述針對(duì)應(yīng)用基質(zhì)中一般功能性改變的第一次篩選和選擇的結(jié)果實(shí)際上是候選酶的組(例如，表達(dá)文庫(kù))的基質(zhì)特異性亞組。有利地，對(duì)特定應(yīng)用基質(zhì)而言，針對(duì)每種生物，此類基質(zhì)特異性表達(dá)文庫(kù)僅必須產(chǎn)生一次。表達(dá)文庫(kù)可被貯藏，使得在新的應(yīng)用問(wèn)題被提出的情況下它們可被直接獲得。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，在對(duì)提供應(yīng)用基質(zhì)中一般功能性改變的這些酶進(jìn)行選擇之后，再在應(yīng)用基質(zhì)上對(duì)獲得的酶的亞組(例如，基質(zhì)特異性表達(dá)文庫(kù))進(jìn)行篩選，選出能在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生指定功能性改變(即，更類似和/或更接近最終應(yīng)用中的想要的功能性改變的功能性改變)的酶的進(jìn)一步亞組。
應(yīng)用基質(zhì)中的指定功能性改變被預(yù)先指定，這取決于在最終應(yīng)用中想要的功能性改變。其可以例如是選自由聚集狀態(tài)、顏色、水結(jié)合、粘度、凝膠形成、香味情況、臭味形成等的改變的一種功能性改變。
用于探測(cè)指定功能性改變的技術(shù)類型取決于指定的功能性改變。可使用多種測(cè)量和/或其組合來(lái)探測(cè)應(yīng)用基質(zhì)中指定的功能性改變，例如用DH測(cè)量、多種色度和光譜技術(shù)、使用熱敏電阻、介電屬性測(cè)量、超聲測(cè)量、質(zhì)譜測(cè)量、介電常數(shù)測(cè)定、粘度測(cè)量、流變測(cè)量等來(lái)進(jìn)行。
對(duì)這些相對(duì)于未處理基質(zhì)的改變的探測(cè)可以通過(guò)直接測(cè)量基質(zhì)或其提取物來(lái)進(jìn)行。對(duì)基質(zhì)的直接測(cè)量可以，例如通過(guò)流變測(cè)量、反射或吸光度測(cè)量、粘度測(cè)量等來(lái)進(jìn)行。
一些時(shí)候可能需要間接測(cè)量，即不在基質(zhì)本身上進(jìn)行的測(cè)量，例如，在從不可溶基質(zhì)來(lái)測(cè)量低分子量組分的釋放的情況下。在此類情況下，可以從基質(zhì)中提取低分子量組分以允許進(jìn)行定量?；蛘?，間接測(cè)量可以包括對(duì)酶處理時(shí)從基質(zhì)釋放的可揮發(fā)組分的組成的改變加以測(cè)定(例如，使用GC-MS)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，在應(yīng)用基質(zhì)上對(duì)候選酶的組加以篩選，直接針對(duì)在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生指定功能性改變的能力加以選擇。省略掉針對(duì)應(yīng)用基質(zhì)中一般功能性改變的第一次篩選。
在又一種實(shí)施方式中，針對(duì)在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生指定功能性改變的能力對(duì)候選酶的(亞)組進(jìn)行的篩選重復(fù)至少一次。在這種實(shí)施方式中，與進(jìn)一步的篩選相比，針對(duì)應(yīng)用基質(zhì)中指定改變的第一次篩選可以針對(duì)較不嚴(yán)格的改變。在第一次篩選中，做出粗略選擇，其中用于選擇的條件并不非常嚴(yán)格。在該步選出的候選者可以以更嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)被進(jìn)一步選擇。此種兩階段選擇可實(shí)現(xiàn)更高處理量的篩選，因此可能是人們想要的。其中可能與兩階段選擇相關(guān)的應(yīng)用的例子是，通過(guò)特定氨基酸在奶酪中產(chǎn)生風(fēng)味。在第一階段，選擇能產(chǎn)生提高的水平的游離氨基酸的候選酶的組，這是使用，例如通過(guò)茚三酮染色探測(cè)來(lái)進(jìn)行的。然后在進(jìn)一步篩選中，針對(duì)特定游離氨基酸的產(chǎn)生對(duì)選出的候選者加以測(cè)試。對(duì)于奶酪應(yīng)用而言，這些特定氨基酸可以是，例如，甲硫氨酸或苯丙氨酸，它們?cè)诤芏嗄汤曳N類中是重要的香味前體。
有利地，本發(fā)明允許可在本發(fā)明的任何階段指定與一種或多種酶分子相關(guān)的酶活性，而不必針對(duì)待鑒定酶活性的性質(zhì)對(duì)應(yīng)用基質(zhì)進(jìn)行預(yù)先調(diào)節(jié)。
對(duì)酶的酶活性的指定可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來(lái)進(jìn)行。例如，其可被建立為何種產(chǎn)物在應(yīng)用基質(zhì)中作為(選出的)酶的酶活性的結(jié)果而形成。其還可被建立為選出的酶在何種特定(模型)底物上展示出活性。還可以測(cè)定選出的酶的氨基酸序列并且分析序列與已知序列的同源性。后一種可能性可以已經(jīng)在精練表達(dá)文庫(kù)的階段進(jìn)行。
在應(yīng)用基質(zhì)上的篩選通常在微滴定板或試管規(guī)模(100μl至5ml)上發(fā)生。對(duì)樣品培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移而言，可以使用移液設(shè)備，可選地，與機(jī)器手和流通系統(tǒng)相結(jié)合。對(duì)樣品操縱的選擇很大程度上由所涉及的應(yīng)用基質(zhì)的物理參數(shù)來(lái)確定。
在應(yīng)用基質(zhì)上篩選一組候選酶之后獲得的酶的亞組或進(jìn)一步亞組可以以更大的規(guī)模在進(jìn)一步的應(yīng)用試驗(yàn)中被篩選。雖然不必是完全規(guī)模，但進(jìn)一步的應(yīng)用篩選通常較之以克計(jì)的規(guī)?；蚋鸵?guī)模的應(yīng)用基質(zhì)篩選的規(guī)模要大得多。此類進(jìn)一步應(yīng)用試驗(yàn)的例子是微型奶酪和幼面包塊。在該進(jìn)一步應(yīng)用篩選中展示出積極性能的候選者被選出，在代表最終應(yīng)用的完全規(guī)模應(yīng)用試驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。
通常，在本發(fā)明的方法中進(jìn)行的篩選的規(guī)模會(huì)增大。結(jié)果，典型地，處理量能力隨著規(guī)模增加降低，這是因?yàn)楹笄?logistical)和操作方面的原因。通常以幾個(gè)至成百上千微升的量培養(yǎng)表達(dá)文庫(kù)，以同樣的規(guī)模進(jìn)行分析。該水平上的處理量為至少千的數(shù)量級(jí)，例如每周千至十萬(wàn)份樣品(克隆)，其是中等處理量。在用于本發(fā)明的方法時(shí)，表達(dá)文庫(kù)的大小通常降低至制備表達(dá)文庫(kù)的生物基因組中存在的基因總數(shù)的大約20-30％。這表明，相關(guān)候選者的數(shù)量降低至數(shù)百至數(shù)千，精確數(shù)量取決于待測(cè)生物。本發(fā)明的方法有利地允許在進(jìn)一步應(yīng)用試驗(yàn)中對(duì)最多數(shù)百候選者進(jìn)行篩選。在進(jìn)一步應(yīng)用試驗(yàn)中篩選之后，通常留下最多10-20個(gè)候選者用于完全規(guī)模的應(yīng)用試驗(yàn)。總的來(lái)說(shuō)，這導(dǎo)致了表達(dá)文庫(kù)和完全規(guī)模應(yīng)用檢驗(yàn)之間有效的選擇途徑(funnel)，其中，僅針對(duì)特定應(yīng)用中的有效性對(duì)蛋白加以選擇。使用本發(fā)明的方法鑒定的(選出的)酶具有很大機(jī)會(huì)在完全規(guī)模的應(yīng)用中正確并且有效的表現(xiàn)。
在完全規(guī)模的應(yīng)用中，通常需要大量的酶和底物。此外，這種規(guī)模的花費(fèi)通常很高，限制了該階段的處理量。根據(jù)本發(fā)明在應(yīng)用基質(zhì)上進(jìn)行的預(yù)先篩選有利地降低了在完全規(guī)模應(yīng)用上待測(cè)酶的量。
本發(fā)明的方法有利地用于鑒定不能通過(guò)基于假設(shè)的篩選方法來(lái)鑒定的新穎的酶活性。
本發(fā)明的方法可被用于選擇或鑒定一種酶活性，還可用于選擇或鑒定兩種或多種酶活性的混合。通常，酶活性混合由不同酶分子提供。但是，單種酶分子可提供不同類型的活性也是可能的。
本發(fā)明顯示，應(yīng)用基質(zhì)中的功能性改變可以有利地被用作為篩選參數(shù)，用于選擇想要的酶活性。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于生產(chǎn)通過(guò)第一個(gè)方面的方法選出的酶。所述方法包括在有益于生產(chǎn)所述酶的條件下培養(yǎng)能表達(dá)所述選出的酶的微生物，以及回收產(chǎn)生的酶。對(duì)酶的回收可以包括下述步驟例如，分離微生物細(xì)胞，產(chǎn)生不含細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，通過(guò)例如超濾來(lái)濃縮不含細(xì)胞的上清液，通過(guò)合適的穩(wěn)定劑對(duì)液體培養(yǎng)物的上清液或超濾濾出物進(jìn)行穩(wěn)定，對(duì)來(lái)自液體培養(yǎng)物上清液或超濾濾出物的酶進(jìn)行進(jìn)一步純化，通過(guò)制粒和/或干燥技術(shù)制備固體酶組合物。優(yōu)選地，能表達(dá)所述選出的酶的微生物是用下述多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主生物，所述多核苷酸含有編碼選出的酶的表達(dá)盒。


圖1.在奶基質(zhì)中對(duì)三種酶的活性進(jìn)行的超聲測(cè)量。
圖2.在奶酪凝乳基質(zhì)中對(duì)脂肪酶的活性進(jìn)行的超聲測(cè)量。
圖3.在小麥面粉懸浮液中對(duì)五種酶的活性進(jìn)行的超聲測(cè)量。
圖4.在大豆-WUS基質(zhì)中對(duì)果膠酶的活性進(jìn)行的超聲測(cè)量。
圖5.對(duì)培養(yǎng)上清液和不含細(xì)胞的提取物中強(qiáng)化(spiked)的酶的活性進(jìn)行的超聲測(cè)量。
實(shí)施例1 制備奶酪凝乳基質(zhì)制備奶酪凝乳基質(zhì)的代表性方法如下所示。在離心管中于30℃加熱全脂牛奶(250克)。在該溫度，輕柔攪拌下，直接加入165μl CaCl2，接著加入54.4μl Maxiren180(從DSM Food Specialties，The Netherlands獲得)。然后停止攪拌，混合物在30℃保持60分鐘。然后在Sorvall GS-3旋轉(zhuǎn)器中對(duì)離心管進(jìn)行離心(5500rpm，25℃)，小心去除上清液。用以1cm的間隔安裝在框架上的拉伸線切刀(cutters of stretched wire)，手工切割沉淀。測(cè)量沉淀體積，加入等體積的NaCl/乳酸溶液(NaCl 90g/L，12.75ml乳酸/L)。使用Ultra-Turrax對(duì)混合物進(jìn)行均化。均化期間，加入按照下文所述制備的63μl細(xì)胞裂解物。測(cè)量總體積，通過(guò)加入等于該體積33％的量的NaCl溶液(4.5％w/v)，稀釋均質(zhì)物?，F(xiàn)在奶酪凝乳基質(zhì)即可用于應(yīng)用篩選。
制備細(xì)胞裂解物按照下述方法來(lái)制備細(xì)胞裂解物；將45ml生理鹽溶液加入到5mlDELVO-TECLL55D(從DSM Food Specialties，The Netherlands獲得)細(xì)胞懸浮液中，離心(5000rpm，Sorvall GS3，10分鐘，25℃)。棄去上清液，將沉淀重新懸浮于5ml生理鹽溶液中，重新離心。最后的循環(huán)重復(fù)三次，沉淀最終被懸浮于5ml生理鹽溶液中。然后，加入630μl裂解酶(從Sigma，the Netherlands獲得)溶液(20mg/ml)，混合物貯藏于30℃(1小時(shí))，緊接著在室溫下額外孵育(1小時(shí))。對(duì)最終的溶液進(jìn)行離心(4000rpm，10分鐘)；小心取出上清液(＝細(xì)胞裂解物)，貯藏于-20℃。
實(shí)施例2制備小麥面粉基質(zhì)制備小麥面粉基質(zhì)的代表性方法如下所示。使用Kolibri面粉(從MENEBA，the Netherlands獲得)來(lái)制備面粉懸浮液；將6.9g面粉加入到11g去離子水中，同時(shí)用旋轉(zhuǎn)振蕩器混合。用Ultra-Turraz混合器對(duì)面粉懸浮液進(jìn)行均化，并將其在正弦Coulter混合器(從Coulter ElectronicsLimited，United Kingdom獲得)上放置10-30分鐘。
該制備之后緊接著，必須將面粉懸浮液在30℃水浴中孵育至少30分鐘，這在有或沒(méi)有酶的情況下進(jìn)行。然后用超聲波水浴(從SonicorInstrument Cooperation，USA獲得)對(duì)樣品進(jìn)行脫氣。小麥面粉基質(zhì)即可在基質(zhì)篩選中被測(cè)量。
實(shí)施例3 制備從大豆獲得的水不溶性底物(WUS)基質(zhì)制備從大豆獲得的WUS基質(zhì)的代表性方法如下所示。在H2O中制得5％w/v大豆WUS制備物。在連續(xù)攪拌下，將大豆-WUS在室溫下孵育過(guò)夜。大顆粒沉淀之后，收集上清液，其即可用于應(yīng)用篩選。
實(shí)施例4使用超聲波光譜在奶基質(zhì)中測(cè)量酶活性按照下文所述在奶中對(duì)三種酶的活性進(jìn)行超聲測(cè)量。運(yùn)行超聲波光譜儀HR-US102，按照廠商(Ultrasonic Scientific，Ireland)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。
將牛奶裝入HR-US102超聲波光譜儀(Ultrasonic Scientific，Ireland)的1ml超聲波小腔(cell)，令其在30℃平衡。溫度平衡之后，加入酶，接著進(jìn)行反應(yīng)。按照下文所述測(cè)試了多種酶和添加物A.以1∶100稀釋Maxiren180，加入到奶中(20μl酶/1ml奶)B.以1∶100稀釋PiccantaseR8000，加入到奶中(30μl酶/1ml奶)C.以1∶100稀釋Maxilact2000，加入到奶中(10μl酶/1ml奶)D.以1∶1000稀釋Maxilact2000，加入到奶中(10μl酶/1ml奶)
所有酶都從DSM Food Specialties，The Netherlands獲得。活性曲線示于圖1中圖A至D。
數(shù)據(jù)顯示，超聲技術(shù)能在一種基質(zhì)(牛奶)中測(cè)量非常多樣的酶活性，例如蛋白酶(Maxiren180)、脂肪酶(PiccantaseR8000)和β-乳糖酶(Maxilact2000)。因此，超聲波光譜方法非常適合用作為普適性的探測(cè)方法，用于根據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)篩選方案。此外，信號(hào)改變的速率取決于加入的酶的量，這由兩條Maxilact曲線(高及低劑量)清楚顯示。針對(duì)Maxiren和PiccantaseR8000的圖A和B還顯示了8分鐘平衡期。
實(shí)施例5 使用超聲波光譜在奶酪凝乳基質(zhì)中測(cè)量酶活性按照下文所述，在根據(jù)實(shí)施例1制備的奶酪凝乳中，對(duì)一種酶的活性進(jìn)行超聲測(cè)量。運(yùn)行超聲波光譜儀HR-US102，按照廠商(UltrasonicScientific，Ireland)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。
將奶酪凝乳+PiccantaseR8000裝入HR-US102超聲波光譜儀的小腔1，將奶酪凝乳單獨(dú)裝入HRUS的小腔2，在30℃對(duì)兩個(gè)小腔都進(jìn)行反應(yīng)。
圖2顯示，超聲技術(shù)能在奶酪凝乳基質(zhì)中測(cè)量酶活性，例如脂肪酶(PiccantaseR8000)。
實(shí)施例6 使用超聲波光譜在小麥面粉基質(zhì)中測(cè)量酶活性按照下文所述，在小麥面粉懸浮液中，對(duì)五種酶的活性進(jìn)行超聲測(cè)量。
按照實(shí)施例2所述制備面粉懸浮液。隨后，將面粉懸浮液在30℃水浴中孵育至少30分鐘，這在有或沒(méi)有酶的情況下進(jìn)行。然后用超聲波水浴(從Sonicor Instrument Cooperation，USA獲得)對(duì)樣品進(jìn)行脫氣。
運(yùn)行超聲波光譜儀HR-US102，按照廠商(Ultrasonic Scientific，Ireland)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。將面粉懸浮液+酶裝入HR-US102的小腔1，小腔2裝入沒(méi)有酶的面粉懸浮液。在30℃下對(duì)樣品進(jìn)行平衡之后，按照廠商說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)量樣品的超聲波速率。
按照下文所述測(cè)試了多種酶和添加物A.與500ppm*Bakezyme GO1500孵育的面粉懸浮液B.與300ppm*Bakezyme HS2000孵育的面粉懸浮液C.與38ppm*Bakezyme P500孵育的面粉懸浮液D.與171ppm*Bakezyme B500孵育的面粉懸浮液E.與60ppm*Lipopan-F孵育的面粉懸浮液注意*ppm是mg酶/kg面粉所有Bakezyme酶都從DSM Bakery Ingredient，The Netherlands獲得，Lipopan-F從Noyozymes，Denmark獲得。
活性曲線示于圖3，圖A至E。
數(shù)據(jù)顯示，超聲技術(shù)能在小麥面粉基質(zhì)中測(cè)量非常多樣的酶活性，例如葡萄糖氧化酶(Bakezyme GO1500)、木聚糖酶(BakezymeHS2000)、淀粉酶(Bakezyme P500)、蛋白酶(Bakezyme B500)和脂肪酶*(Lipopan F)。
實(shí)施例7使用超聲波光譜在大豆-WUS基質(zhì)中測(cè)量酶活性按照下文所述，在根據(jù)實(shí)施例3制備的大豆-WUS中，對(duì)兩種酶的活性進(jìn)行超聲測(cè)量。運(yùn)行超聲波光譜儀HR-US102，按照廠商(UltrasonicScientific，Ireland)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。
將大豆-WUS+酶裝入HR-US102超聲波光譜儀的小腔1，將大豆-WUS單獨(dú)裝入HRUS的小腔2，反應(yīng)進(jìn)程之后是在30℃測(cè)量相對(duì)超聲波速率。
PectinexUltra SP(Novozymes，Denmark)，稀釋為10μl/500mlWUSRapidasePress(DSM Food Specialties，The Netherlands)，稀釋為50μl/500ml WUS圖4顯示，超聲技術(shù)能在大豆-WUS基質(zhì)中測(cè)量酶活性，例如果膠酶(RapidasePress和PectinexUltra SP)。
實(shí)施例8使用超聲波光譜在奶基質(zhì)中測(cè)量在上清液和不含細(xì)胞的提取物中強(qiáng)化的酶活性通過(guò)超聲波測(cè)量來(lái)測(cè)定Bacillus subtilis培養(yǎng)上清液(A)和Bacillussubtilis不含細(xì)胞的提取物(B)中強(qiáng)化的酶活性。運(yùn)行超聲波光譜儀HR-US102，按照廠商(Ultrasonic Scientific，Ireland)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。
將牛奶裝入HR-US102超聲波光譜儀(Ultrasonic Scientific，Ireland)的1ml超聲波小腔，令其在30℃平衡。溫度平衡之后，加入從標(biāo)準(zhǔn)的48小時(shí)Bacillus subtilis發(fā)酵獲得的100μl上清液(A)或從同樣的48小時(shí)Bacillus subtilis發(fā)酵獲得的100μl不含細(xì)胞的提取物(B)，接著進(jìn)行反應(yīng)。在兩種實(shí)驗(yàn)中，在強(qiáng)化或不強(qiáng)化乳酸酶的情況下，對(duì)上清液和不含細(xì)胞的提取物進(jìn)行分析。為進(jìn)行強(qiáng)化，在B.subtilis樣品中以1∶1000稀釋Maxilact2000。
數(shù)據(jù)顯示，超聲波技術(shù)能在復(fù)雜的蛋白制劑中測(cè)量酶活性。
按照下文所述來(lái)制備上清液和不含細(xì)胞的提取物將B.subtilis菌株從冷凍試管直接接種到100ml TY培養(yǎng)液(16克胰蛋白胨/l，10克酵母提取物/l，5克NaCl/升；用NaOH調(diào)節(jié)pH至7)，在37℃和250rpm下培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)的發(fā)酵之后，通過(guò)在5000rpm離心10分鐘來(lái)收獲細(xì)胞。收集上清液，用一次性0.22μm無(wú)菌過(guò)濾真空系統(tǒng)(Millipore，Bedford USA)進(jìn)行過(guò)濾，貯藏于-20℃。
將細(xì)胞沉淀懸浮于磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中，針對(duì)48小時(shí)培養(yǎng)物的光密度來(lái)校正所用的PBS的量。將細(xì)胞懸浮液在含有用于細(xì)胞破碎的玻璃珠的試管中分為1ml一份的小份。使用供應(yīng)商推薦的Blue基質(zhì)方案，在Fastprep(Q-Biogen，Illkirch，F(xiàn)rance)中進(jìn)行破碎。破碎進(jìn)行兩次，其間將樣品放在冰上預(yù)冷和冷卻。破碎之后，通過(guò)在10,000個(gè)離心1分鐘去除細(xì)胞碎片和基質(zhì)。不含細(xì)胞的提取物被貯藏于-20℃。
權(quán)利要求
1.一種方法，用于鑒定目標(biāo)酶，所述方法包括在應(yīng)用基質(zhì)上篩選一組候選酶，優(yōu)選地，以至少中等的處理量水平進(jìn)行，并且針對(duì)在所述應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的能力對(duì)酶進(jìn)行選擇。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，包括a)提供一組侯選酶，b)在應(yīng)用基質(zhì)上篩選所述候選酶的組，優(yōu)選地，以至少中等的處理量水平進(jìn)行，c)選出在所述應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的酶的亞組，d)從所述酶的亞組中選出在進(jìn)一步的應(yīng)用檢驗(yàn)中具有想要的活性的酶，e)確定選出的酶的酶活性。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，特征c)的所述功能性改變是所述應(yīng)用基質(zhì)中的一般功能性改變。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，特征c)的所述功能性改變是所述應(yīng)用基質(zhì)中的指定功能性改變。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，使用超聲波光譜來(lái)測(cè)量特征c)的所述功能性改變。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，還包括重復(fù)步驟c)，以選出進(jìn)一步的酶的亞組，所述進(jìn)一步的酶的亞組能在所述應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生較特征c)的前面測(cè)量的功能性改變而言更嚴(yán)格的功能性改變。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述候選酶的組由在合適的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)的一組基因提供，即，由表達(dá)文庫(kù)提供。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，通過(guò)去除重復(fù)克隆和/或去除沒(méi)有或沒(méi)有顯著的蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的克隆來(lái)所述精練表達(dá)文庫(kù)。
9.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述應(yīng)用基質(zhì)是全脂奶、凝乳、奶酪漿體、面包面團(tuán)、谷物面粉懸浮液、谷物原漿或大豆原漿。
10.一種方法，用于生產(chǎn)按照前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法選出的酶，所述方法包括在有益于生產(chǎn)所述酶的條件下培養(yǎng)能表達(dá)所述酶的微生物，以及回收產(chǎn)生的酶。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述微生物是用下述多核苷酸轉(zhuǎn)化過(guò)的宿主生物，所述多核苷酸包含編碼所述選出的酶的表達(dá)盒。
12.將應(yīng)用基質(zhì)中功能性改變作為篩選參數(shù)用于選擇想要的酶活性的用途。
13.超聲波光譜在篩選酶活性中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定目標(biāo)酶的方法，所述方法包括在應(yīng)用基質(zhì)上篩選一組候選酶，優(yōu)選地，以至少中等的處理量水平進(jìn)行，并且針對(duì)能在應(yīng)用基質(zhì)中產(chǎn)生功能性改變的能力對(duì)酶進(jìn)行選擇。在應(yīng)用基質(zhì)中，本發(fā)明的篩選方法無(wú)須在應(yīng)用所述篩選方法之前指定待篩選的酶活性。
文檔編號(hào)A23C19/00GK1981050SQ200580022211
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者阿伯圖斯·阿拉德·蒂克·范, 馬賽力斯·威廉默斯·伊麗莎白·瑪麗亞·帝勒勃格·范, 約特·史蒂文·約翰·格里帝斯瑪, 莫倫·馬莎·安格塔·歐勒斯通, 鮑克·佛克爾茨瑪, 利嘉·韋斯特拉肯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司