專利名稱：用于處理生物樣品的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于處理生物樣品的裝置。具體而言，本發(fā)明涉及包括壓電材料、用于處理生物組織和/或細(xì)胞的芯片卡盒(cartridge)和/或生物芯片裝置。
背景技術(shù)：
組織通常包含生物基質(zhì)內(nèi)部的細(xì)胞，該生物基質(zhì)為組織提供機(jī)械強(qiáng)度。為了從組織分離細(xì)胞、核酸或蛋白，需要進(jìn)行組織破碎和細(xì)胞裂解(細(xì)胞破裂，cell lysis)步驟。
傳統(tǒng)的組織破碎和細(xì)胞裂解方法耗時(shí)且費(fèi)力。這些方法采用具有類似攪拌器部件以產(chǎn)生剪切力的電動(dòng)機(jī)械均漿器，其物理地破碎固態(tài)組織并釋放組織內(nèi)部的細(xì)胞。隨后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械或熱處理以使細(xì)胞裂解，以便提取細(xì)胞間和/或細(xì)胞內(nèi)的成分。
對(duì)于適于微機(jī)械和/或自動(dòng)化工藝的其他組織破碎方法，其采用酶解組織破碎方法(WO 2004/046305，結(jié)合于此作為參考)是可行的。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了通過(guò)超聲處理破碎孢子和細(xì)胞(P.Belgrader et.al.，Ahal.Chem.，1999，714232-4236；Belgrader et.al.，Biosensors andBioelectronics，2000，14849-852；Taylor et.al.，Anal.Chem.，2001，73492-496)。然而，這適用于細(xì)胞裂解，而對(duì)于破碎組織是不可行的。此外，超聲處理裝置為外部裝置，并且未整合(集成)于諸如μ-TAS或MEMS的自動(dòng)化系統(tǒng)內(nèi)。
已經(jīng)采用壓電材料作為外部致動(dòng)裝置以引發(fā)細(xì)胞裂解(P.Belgrader et.al.，Anal.Chem.，1999，714232-4236)。然而，通常需要高電壓以致動(dòng)壓電材料，并且另外，由于材料的熱傳導(dǎo)，需要隔熱材料以阻止溫度上升使細(xì)胞退化。這使得難以將壓電材料結(jié)合到微型裝置內(nèi)。
也已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了用于探測(cè)病原菌的全集成生物芯片(R Liu et.al.，Anal.Chem.，2004，76(7)1824-1831)。生物芯片內(nèi)的壓電圓盤(pán)僅用來(lái)增大生物芯片內(nèi)流體的混合效率。芯片內(nèi)還包括電連接和印刷電路板。集成在該生物芯片中的電化學(xué)泵和電連接的存在使得該生物芯片用于一次性(可拋棄的)應(yīng)用過(guò)于昂貴。
因此，本領(lǐng)域需要一種可用于處理生物樣品，尤其是生物組織的便宜的一次性裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了上述問(wèn)題，并提供了一種用于處理生物樣品的容易使用、便宜且有效的裝置。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種包括壓電材料的用于破碎樣品組織與/或裂解細(xì)胞的裝置。
尤其是，壓電材料由調(diào)頻交流電壓驅(qū)動(dòng)。
本發(fā)明的壓電裝置包括壓電材料；以及與該壓電材料接觸的至少第二材料；且其中該第二材料在與壓電材料接觸的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。該粗糙表面改善了空化效應(yīng)(cavitation effect)。
第二材料優(yōu)選地被貼附至壓電材料。尤其是，第二材料被膠粘或固定到壓電材料上。粗糙表面可以根據(jù)任何標(biāo)準(zhǔn)方法制作，例如，粗糙表面可以通過(guò)硅珠層形成。例如，將硅珠層貼附到與壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上的第二材料的表面上。硅珠的直徑可以為100至400μm。
第二材料可以是任何合適的材料，尤其是，第二材料的楊氏模量為50至220Gpa。第二材料可以由金屬或聚合物材料制成。例如，金屬可以選自由鋼、不銹鋼、黃銅、銅和鋁組成的組。聚合物材料可以選自由聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚氯乙稀(PVC)組成的組。
壓電材料可以為盤(pán)片、桿或棒的形式，或者具有至少3個(gè)側(cè)面的平面形狀。
該裝置可以包括用來(lái)致動(dòng)壓電材料的裝置，例如施加、貼附或連接至該壓電材料的兩個(gè)電極。
該裝置尤其是一次性的。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的裝置為芯片卡盒。該芯片卡盒可以進(jìn)一步包括入口端口、出口端口、和至少一個(gè)室。該芯片卡盒可以單獨(dú)使用，或可以結(jié)合或集成到諸如微全分析系統(tǒng)(μ-TAS)或芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(lab-on-a-chip system)內(nèi)的生物芯片中。尤其是，本發(fā)明的芯片卡盒為一次性芯片卡盒。
根據(jù)另一方面，該裝置為生物芯片裝置并進(jìn)一步包括-離解室(dissociation chamber)；-試劑和緩沖液(緩沖劑)儲(chǔ)存腔；
-一個(gè)或多個(gè)閥；-一個(gè)或多個(gè)泵；以及-連接所述室、儲(chǔ)存腔和閥的通道。
該生物芯片裝置可用于生物樣品制備。
該裝置可以進(jìn)一步包括微型泵、結(jié)合與混合室和/或提取/洗脫/PCR室。該結(jié)合與混合室還可以包括壓電材料和與該壓電材料接觸的第二材料。第二材料可包括在與壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上的粗糙表面。粗糙表面可以通過(guò)硅珠層形成。該裝置可以進(jìn)一步包括閥，該閥為微型閥。該微型閥可以是聚二甲基硅氧烷(PDMS)隔膜微型閥。微型泵可以包括隔膜。隔膜可以是聚二甲基硅氧烷(PDMS)隔膜。
根據(jù)另一方面，該裝置可以進(jìn)一步包括注入孔。該裝置還可以被調(diào)整使得可以進(jìn)行自動(dòng)泵浦。
根據(jù)一個(gè)方面，該生物芯片裝置采用外部氣動(dòng)執(zhí)行機(jī)構(gòu)以致動(dòng)集成于芯片內(nèi)部的泵和閥。
提取/洗脫/PCR室可以沉積有磁性材料，例如沉積有坡莫合金，更具體地沉積有坡莫合金引腳(pin)。
結(jié)合與混合室可以包括涂敷有至少一種連接子(linker)的珠體，該連接子用于結(jié)合核酸分子。該珠體可以是磁性珠體。
該裝置可以由聚合物材料例如聚碳酸酯制成。
該裝置還可以包括集成到芯片的生物傳感器、RT-PCR和微陣列。
根據(jù)另一方面，該生物芯片裝置由至少三個(gè)層、用于閥的一個(gè)或多個(gè)隔膜以及用于泵的一個(gè)或多個(gè)隔膜構(gòu)成。第一層至少包括離解室、試劑和緩沖液儲(chǔ)存腔，第二層至少包括壓電材料，且其中閥和泵位于第二層與第三層之間的界面處，并且通道位于第一層與第二層以及第二層與第三層的界面處。
該生物芯片可以進(jìn)一步包括罩(cover)，以置于所述第一層上。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種在裝置內(nèi)破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法，包括以下步驟-加載樣品和試劑；-致動(dòng)壓電材料，其中該壓電材料與第二材料接觸，并且其中第二材料在與壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面，該粗糙表面接觸樣品；-獲得破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞；以及-回收洗出液。
粗糙表面可以根據(jù)任何標(biāo)準(zhǔn)方法形成，例如可以通過(guò)硅珠層形成粗糙表面。硅珠的直徑可以為100至400μm。
根據(jù)本發(fā)明的方法，壓電材料由外部電壓源致動(dòng)。該外部電壓源可以供給正弦波電壓。該正弦波電壓可以是任何合適的波形電壓，例如其可以具有-140V至+140V的峰-峰電壓。然而，該峰-峰電壓并不限于這些具體數(shù)值。該正弦波電壓具有調(diào)制頻率。該正弦波電壓可以為例如1.0kHz至20kHz。尤其是，該外部電壓源供應(yīng)調(diào)頻電壓以致動(dòng)壓電材料。
生物樣品可以是來(lái)自動(dòng)物、人、植物、細(xì)菌或病毒和/或細(xì)胞樣品的組織。樣品可以是新鮮的或冷凍的組織和/或細(xì)胞樣品。根據(jù)本具體實(shí)施方式
的另一方面，樣品為培養(yǎng)細(xì)胞、全血細(xì)胞、血清、尿、唾液或來(lái)自活組織檢查的組織。
根據(jù)本發(fā)明的方法，壓電材料的致動(dòng)產(chǎn)生沖擊和空化作用以引起組織破碎和/或細(xì)胞裂解。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括以下步驟分離、純化和/或擴(kuò)增從破碎的組織和裂解的細(xì)胞獲得的核酸，以及回收核酸。通過(guò)加入涂敷有至少一種連接子的珠體，可以從破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞回收核酸，并且其中通過(guò)致動(dòng)第二壓電材料以提高混合與結(jié)合效率進(jìn)行該珠體上的連接子與核酸的結(jié)合，以及回收連接至珠體的核酸。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供了一種包括壓電材料的壓電裝置，該壓電材料與至少第二材料接觸；且其中該第二材料在與該壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。該壓電裝置可用于本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置。


圖1A為芯片卡盒裝置的分解視圖。
圖1B為芯片卡盒裝置的橫剖面視圖。
圖2(A)為芯片卡盒裝置的原型照片。
圖2(B)示出了用于本發(fā)明的芯片卡盒和生物芯片裝置的驅(qū)動(dòng)器電路底座(主體)。
圖3為示出了掃描頻率高壓電源供應(yīng)的工作原理的電路拓?fù)洹?br> 圖4(A)和圖4(B)為包含(a)來(lái)自大鼠肝臟組織、(b)來(lái)自大鼠心臟組織的細(xì)胞碎片的破碎溶液的光學(xué)圖像。格柵距離為100μm。
圖5示出了平均破碎時(shí)間(s)與組織樣品重量(mg)之間的關(guān)系。破碎效率表示為通過(guò)所需時(shí)間破碎的最初組織尺寸，其中最初組織尺寸通過(guò)光學(xué)圖像加以確定。
圖6示出了破碎室溫度隨時(shí)間的變化。
圖7示出了RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。從左向右M標(biāo)記物，1由均漿器破碎的新鮮組織；2和3由微型室破碎的新鮮組織；4和5由微型室破碎的冷凍組織。18S和28S分別示出了18S和28S核糖體RNA的位置。
圖8(A)示出了從新鮮組織和冷凍組織提取的TP53基因的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠結(jié)果。測(cè)試中最長(zhǎng)的mRNA為1176bps。圖8(B)示出了具有360bps的β-微球蛋白的最短cDNA的相同結(jié)果。
圖9示出了生物芯片裝置的具體實(shí)施方式
。
圖10示出了該生物芯片裝置的示意性結(jié)構(gòu)。
圖11A示出了包括三個(gè)層的生物芯片裝置的結(jié)構(gòu)。該圖示出了儲(chǔ)存腔、泵、閥、通道和室連接的縱向(橫斷)剖面視圖。
圖11B示出了包括三個(gè)層的生物芯片裝置的結(jié)構(gòu)。該圖示出了離解室、泵、閥、通道和室連接的不同縱向(橫斷)剖面視圖。
圖12A示出了圖11B的離解室的詳細(xì)視圖，其中該離解室內(nèi)沒(méi)有樣品。
圖12B示出了圖11B的離解室的詳細(xì)視圖，其中該離解室內(nèi)具有生物樣品和溶液。
圖13(A)、(B)示出了流速與驅(qū)動(dòng)頻率以及流速與壓力特性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(B)工作頻率；(B)泵壓頭。
圖14示出了當(dāng)微型閥打開(kāi)時(shí)流速與微型閥壓力的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了例如芯片卡盒和/或生物芯片裝置的裝置，用于有效處理生物樣品，例如培養(yǎng)細(xì)胞、全血細(xì)胞、血清、尿、唾液、組織以及來(lái)自活組織檢查的組織，該生物樣品可以用作用于制備生物分子樣品諸如純化的DNA和RNA、用于基因相關(guān)測(cè)定的原始樣品。
本發(fā)明的裝置尤其適用于處理具有寬范圍的尺寸、在提取感興趣的基因之前需要被破碎的組織樣品。尤其是，本發(fā)明的裝置通過(guò)采用基于空化原理的技術(shù)(Liu R.H.，et al.，Anal.Chem.，2003，751911-1917；and Liu R.H.，et al.，Lab Chip，2002，2(3)，151-157)而利用壓電裝置破碎組織樣品。本發(fā)明的裝置允許同時(shí)破碎組織和裂解細(xì)胞。然而，本發(fā)明的裝置還可以用于處理(裂解)培養(yǎng)細(xì)胞、全血細(xì)胞、血清、尿、唾液。
根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的裝置是一次性的。因此，本發(fā)明的裝置便宜并且尤其適用于一次性(可拋棄的)應(yīng)用。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種用于樣品組織破碎和/或細(xì)胞裂解的、包括壓電裝置的裝置。
本發(fā)明的壓電裝置包括壓電材料；以及與該壓電材料接觸的至少第二材料，并且其中該第二材料在與該壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。該粗糙表面改善了空化效應(yīng)。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明的裝置為芯片卡盒(也稱為生物芯片芯片卡盒)，包括用于樣品組織破碎和/或細(xì)胞裂解的壓電裝置。該芯片卡盒可以進(jìn)一步包括入口端口、出口端口和至少一個(gè)室。該芯片卡盒進(jìn)一步包括進(jìn)行組織破碎和/或細(xì)胞裂解的室。該芯片卡盒可以單獨(dú)使用，或可以結(jié)合或整合到例如微全分析系統(tǒng)(μ-TAS)或芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)內(nèi)的生物芯片中。尤其是，本發(fā)明的芯片卡盒為一次性的芯片卡盒。
根據(jù)另一方面，該裝置為生物芯片裝置。
因此，本發(fā)明的裝置利用壓電(PZT)材料作為致動(dòng)器，以對(duì)新鮮或冷凍組織破碎和/或細(xì)胞裂解產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊和空化作用。
通過(guò)參考以示例說(shuō)明方式提供的圖示，將能更好地理解本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置的具體實(shí)施方式
，這些具體實(shí)施方式
并非為了限制本發(fā)明。此外，對(duì)于通過(guò)使用外部源致動(dòng)PZT裝置而處理生物樣品的方法，該方法可以應(yīng)用于本發(fā)明的芯片卡盒和生物芯片裝置。
芯片卡盒圖1A為本發(fā)明的芯片卡盒的分解視圖。該芯片卡盒的縱向(橫斷)剖面視圖示于圖1B。圖2為圖1的芯片卡盒的原型相片。該芯片卡盒具有25m×25mm×6mm的外部尺寸。然而，本發(fā)明的芯片卡盒并不限于這些尺寸。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)芯片卡盒的具體用途而選擇該尺寸。
如圖1、圖2和圖9所示，本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置是透明的，以便可以容易觀察和檢驗(yàn)破碎過(guò)程。
該芯片卡盒包括用于放入生物樣品和試劑的入口端口。圖1示出了制作在芯片卡盒的室側(cè)壁上的入口。然而，普通技術(shù)人員將會(huì)理解，可以使用任何已知的入口制作方式。該芯片卡盒設(shè)置有在引入所需的生物樣品和/或試劑之后，用于密封入口端口的密封部件。圖1示出了用來(lái)密封入口端口的4mm的固定螺釘(密封螺母)。固定螺釘?shù)某叽绺鶕?jù)入口端口的尺寸和直徑選擇。該芯片卡盒還包括在進(jìn)行組織破碎和/或細(xì)胞裂解之后，用于取出樣品溶液的出口端口。在圖1A所示的具體實(shí)例中，將外徑為1.5mm的玻璃管連接到室，以作為待抽取的破碎的樣品溶液的出口管。該管連接至1ml的注射器，以便可以收集在裂解結(jié)束之后所獲得的溶液。然而，對(duì)任何普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以根據(jù)本領(lǐng)域中任何已知的方法，將該出口端口制作和/或應(yīng)用于芯片卡盒。
該芯片卡盒包括與第二材料接觸的壓電材料，其中該第二材料在與該壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。尤其是，該壓電材料通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的任何合適手段貼附至第二材料。PZT被例如膠粘或固定到該第二材料。
該第二材料可以是任何合適的材料，例如金屬、聚合物材料、玻璃等。該第二材料可以是任何金屬，其例如選自由鋼、不銹鋼、黃銅、銅和鋁組成的組。該第二材料可以是任何合適的聚合物，其例如選自由聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚氯乙稀(PVC)組成的組。重要的是，該第二材料保持一定的剛性或者抗性，以便承受當(dāng)壓電材料被致動(dòng)時(shí)該壓電材料的彎曲。尤其是，該第二材料的楊氏模量(代表給定材料的絲、棒或者任意形狀結(jié)構(gòu)的應(yīng)力與應(yīng)變的比率的數(shù)目(量綱為磅每平方英寸或者達(dá)因每平方厘米))為50至220GPa。因此，根據(jù)特定方面，楊氏模量介于50至220GPa的任何材料可以用作芯片卡盒的第二材料。當(dāng)該第二材料是金屬時(shí)，PZT與第二材料可以通過(guò)導(dǎo)電膠膠粘在一起。該第二材料也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的合適方法固定至PZT材料。
該第二材料包括與生物樣品接觸的粗糙表面。根據(jù)第一種技術(shù)方法，加工與樣品接觸的第二材料表面以產(chǎn)生粗糙表面。根據(jù)另一種方法，由硅珠層產(chǎn)生粗糙表面。硅珠可以是用于水射流加工(使用來(lái)自噴嘴的高壓噴水切割材料的工業(yè)工藝)中的那些硅珠。它們具有非常鋒利的邊緣。硅珠可以具有任何尺寸，例如直徑為100至400μm。然而，根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法如何制作和形成粗糙表面，這對(duì)普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
在圖1A中，首先使用薄層的膠覆蓋厚度為0.2mm、直徑為15mm的黃銅或棉盤(pán)片。然后將硅珠置于薄層膠上，并在70℃下在加熱爐中固化1小時(shí)。隨后將直徑為10mm的PZT盤(pán)片(來(lái)自PHILIPSTM的PXE5)膠粘到黃銅盤(pán)的另一側(cè)，以用作致動(dòng)器。然而，普通技術(shù)人員將會(huì)明了，PZT不限于盤(pán)片的形狀，還可以是桿、棒、或者具有至少3個(gè)側(cè)面的平面形狀的任何其他結(jié)構(gòu)，例如具有三角形、方形、矩形等的平面形狀。該芯片卡盒可以由任何合適的材料制成，例如聚碳酸酯?？梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)控(CNC)加工并使用聚碳酸酯來(lái)制作該芯片卡盒。該芯片卡盒還包括室，在該室中進(jìn)行組織破碎和/或細(xì)胞裂解。圖1和2所示的室具有14.5mm的直徑和1mm的深度的尺寸。然而，可以根據(jù)具體要求調(diào)整該室的尺寸。圖1和2所示的芯片卡盒的總?cè)莘e約為165μl。
壓電材料由外部電壓源致動(dòng)。因此，PZT材料提供致動(dòng)裝置，例如連接至外部電壓源的兩個(gè)電極。當(dāng)?shù)诙牧蠟榻饘贂r(shí)，一個(gè)電極連接至PZT材料，而第二電極連接至第二材料。然而，當(dāng)?shù)诙牧蠟榉菍?dǎo)電材料時(shí)，例如聚合物材料，則兩個(gè)電極將連接至PZT材料。用于連接施加于PZT的電極的裝置將優(yōu)選地不集成到芯片卡盒。
一旦通過(guò)外部源致動(dòng)PZT材料，PZT材料和第二材料在生物樣品溶液內(nèi)產(chǎn)生氣泡。這種現(xiàn)象稱為空化現(xiàn)象。第二材料具有粗糙表面，優(yōu)選為硅珠層，該粗糙表面改善了氣泡的產(chǎn)生以及組織的裂解。該氣泡作用于生物樣品，導(dǎo)致組織破碎和/或細(xì)胞裂解。因此，當(dāng)生物樣品為組織例如腫瘤時(shí)，則同時(shí)進(jìn)行組織破碎和細(xì)胞裂解。取決于生物樣品的類型，可以在5～40秒內(nèi)進(jìn)行破碎和裂解。
如上所述，Liu R.H.，et al.，Anal.Chem.，2004，761824-1831披露了一種全集成生物芯片，其包括PZT盤(pán)片以通過(guò)微流技術(shù)提高接種在血液內(nèi)的目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞與免疫磁性捕獲珠體的混合和結(jié)合。相反，本發(fā)明的芯片卡盒和生物芯片裝置的PZT材料用于完全不同的用途。在本發(fā)明中，用途為破碎組織和裂解細(xì)胞。
為了致動(dòng)PZT材料以產(chǎn)生空化，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建了一種能夠產(chǎn)生正弦電壓的驅(qū)動(dòng)電路，該正弦電壓具有連續(xù)變化的頻率。該驅(qū)動(dòng)電路的規(guī)格定義如下-可調(diào)整的峰-峰交流電壓V0；-可調(diào)整的基本平均頻率fm；-可調(diào)整的振蕩頻率分量Δf0。
該振蕩頻率分量被設(shè)計(jì)成在3.3Hz連續(xù)變化。這意味著瞬時(shí)驅(qū)動(dòng)頻率由下式給出f＝fm+Δf0sin(wst)，其中ws＝2π(3.3Hz)基本頻率f0通常選擇為壓電材料的固有頻率。通過(guò)使用大范圍的正弦輸入(具有不同的頻率)激勵(lì)壓電材料而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由此可以精確地導(dǎo)出該數(shù)值。在共振時(shí)，壓電材料振動(dòng)最劇烈。
電路拓?fù)涫居趫D3。還示出了在不同階段的輸出波形及其符號(hào)。
圖2(A)和2(B)分別示出了微型芯片卡盒的原型和驅(qū)動(dòng)器電路底座。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，當(dāng)使空化芯片卡盒驅(qū)動(dòng)時(shí)，振蕩頻率分量首先設(shè)置為零。固有頻率調(diào)整為6.1kHz，并通過(guò)FFT模式下的示波器檢驗(yàn)。Δf0隨后設(shè)置為600Hz。因此，在5.6KHz和6.6kHz之間的頻率下驅(qū)動(dòng)壓電材料。
如前所述，壓電材料在受到致動(dòng)時(shí)產(chǎn)生熱量。P.Belgrader等人(Anal.Chem.，1999，714232-4236)在PZT盤(pán)片和細(xì)胞溶液之間使用隔熱材料(連接物)，從而防止溫度上升使細(xì)胞退化。此外，PZT盤(pán)片在裝置外部。隔熱材料對(duì)于防止熱量容易地傳導(dǎo)到溶液室是必須的。事實(shí)上，高溫影響生物分子諸如RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)的質(zhì)量。其對(duì)于RNA的質(zhì)量尤其有害。
在本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置中，施加了比Belgrader等人所用的電壓低的電壓，使得不需要隔熱材料(連接物)，并且另外使得PZT材料可以插入或集成到本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置。事實(shí)上，在本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置中，優(yōu)選通過(guò)施加變化的(調(diào)制的)頻率而致動(dòng)PZT材料。使用變化頻率驅(qū)動(dòng)PZT材料，由于破碎時(shí)間較短而產(chǎn)生更少的熱量，此外還改善了空化效率。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)施加變化頻率而致動(dòng)PZT。
圖6示出了本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置的破碎溫度(disruption temperature)上升，溫度通過(guò)插入K型熱偶測(cè)量并通過(guò)數(shù)字讀出器讀出。無(wú)需任何額外的冷卻，室溫度從約25℃的室溫上升到66℃的最大值。由于在本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置中可以在5～40秒內(nèi)進(jìn)行組織破碎和/或細(xì)胞裂解，因此溫度上升維持在25～45℃。
在組織破碎和/或細(xì)胞裂解的步驟之后，可以在本發(fā)明的芯片卡盒中執(zhí)行另外的步驟，用于純化、分離和檢測(cè)感興趣的分析物。該分析物可以是核酸、蛋白細(xì)菌、病毒、抗原等?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分析物的純化、分離和檢測(cè)。例如，在純化和分離核酸的情況下，可以使用免疫磁性捕獲珠體或者涂敷有包括polyT-oligo的至少一種連接子或用于特定核酸的具體序列互補(bǔ)的連接子的珠體。核酸隨后可以通過(guò)使用磁體捕獲珠體、洗下、并最終回收結(jié)合至珠體的核酸而回收。為了將核酸結(jié)合至珠體-連接子或結(jié)合至免疫磁性捕獲珠體，PZT材料可以如本領(lǐng)域所描述的被致動(dòng)并用于改善混合與結(jié)合。另外，通過(guò)添加所需的試劑，可以在芯片卡盒的室內(nèi)直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增(如RT-PCR、PCR等)。
芯片卡盒優(yōu)選為可拋棄(一次性使用)裝置，其可以獨(dú)立地用于處理例如生物組織的生物樣品。
然而，本發(fā)明的芯片卡盒還可以插入到本領(lǐng)域中已知的現(xiàn)有生物芯片裝置。對(duì)圖1和2所示的芯片卡盒如何進(jìn)行調(diào)整或修改，例如通過(guò)調(diào)整入口和出口端口，以使芯片卡盒更適于插入到生物芯片內(nèi)，這對(duì)于所有普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。例如，本發(fā)明的芯片卡盒可以被調(diào)整以插入到圖9的裝置中，更具體地插入到離解室內(nèi)部。
該芯片卡盒例如可以插入或者集成到例如微全分析系統(tǒng)(μ-TAS)或芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的生物芯片中。優(yōu)點(diǎn)在于，使用后，該芯片卡盒可以被廢棄，并將新的一次性的芯片卡盒插入到生物芯片內(nèi)。這使得整個(gè)過(guò)程受到污染的可能性降低。
因此，本發(fā)明還提供了在芯片卡盒或生物芯片內(nèi)破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法，包括以下步驟-加載試劑和樣品；-致動(dòng)壓電材料，其中該壓電材料與第二材料接觸，并且其中該第二材料在與壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面，該粗糙表面接觸該樣品；-獲得破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞；以及-回收洗出液。
由外部電壓源致動(dòng)該P(yáng)ZT材料。外部電壓源供給峰-峰電壓為例如50V至400V的正弦波電壓。可以施加任何合適的正弦波電壓，該電壓也可以是幾千伏特。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員明了如何選擇合適的電壓。尤其是，正弦波電壓的峰-峰電壓為-300V至+300V，更具體地為-180V至+180V，優(yōu)選為-140V至+140V。該正弦波電壓具有1.0kHz至20kHz的掃描頻率。尤其是，該掃描頻率為3.0kHz至8.0kHz。更具體地為5.6kHz至6.6kHz。甚至更具體地，該掃描頻率為3.3kHz。
如前所述，優(yōu)選由變化的(調(diào)制的)頻率致動(dòng)PZT材料。使用變化的(調(diào)制的)頻率驅(qū)動(dòng)PZT材料，空化效果強(qiáng)且所產(chǎn)生的熱量低。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)施加變化的(調(diào)制的)頻率而致動(dòng)PZT材料。
生物樣品可以是來(lái)自動(dòng)物、人體、植物、細(xì)菌、病毒和/或細(xì)胞樣品的組織。該樣品可以是新鮮的或者冷凍的組織樣品。該樣品還可以是經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、全血細(xì)胞、血清、尿、唾液或來(lái)自活組織檢查的組織。破碎和/或細(xì)胞裂解發(fā)生在芯片卡盒的離解室內(nèi)。
該方法進(jìn)一步包括以下步驟分離、純化和/或擴(kuò)增從破碎的組織和裂解的細(xì)胞獲得的核酸，以及回收核酸。試劑可以進(jìn)一步包括洗滌緩沖液、洗脫緩沖液和/或RT-PCR試劑。
核酸可以通過(guò)添加涂敷有至少一種連接子的珠體，并回收連接至珠體的核酸，而從破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞回收。該珠體可以是磁性珠體。核酸可以通過(guò)外部電磁場(chǎng)或永久磁場(chǎng)而回收?？梢酝ㄟ^(guò)致動(dòng)壓電材料以增大混合和結(jié)合效率，進(jìn)行珠體上的連接子與核酸的結(jié)合。回收的核酸分子為DNA、RNA和/或mRNA。
載入本發(fā)明的芯片卡盒和/或生物芯片裝置的組織樣品的量為0.1mg至100mg。此外，離解室可預(yù)先載入緩沖液。
根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種生物芯片，其包括-離解室；-試劑和緩沖液儲(chǔ)存腔；-一個(gè)或多個(gè)閥；
-一個(gè)或多個(gè)泵；以及-通道；而且條件為電連接不集成到該生物芯片內(nèi)。
該離解室也可以稱為破碎室。
該生物芯片包括一個(gè)或多個(gè)泵，其中該泵為微型泵。
根據(jù)另一方面，該裝置可以進(jìn)一步包括注入孔。該裝置還可以被調(diào)整使得可以實(shí)施自動(dòng)泵浦。
根據(jù)本發(fā)明的生物芯片(也稱為生物芯片裝置)的實(shí)例示于圖9。然而，圖9的生物芯片裝置已經(jīng)包括PZT盤(pán)片。
本發(fā)明的生物芯片可以由適于一次性生物芯片裝置的任何材料制成，例如聚合物材料。該聚合物材料可以是聚碳酸酯。該生物芯片裝置方便地為透明的，從而能夠觀察和檢驗(yàn)反應(yīng)的各個(gè)步驟。
該生物芯片裝置由至少三個(gè)層和用于閥及泵的一個(gè)或多個(gè)隔膜構(gòu)成。然而，其也可以由四個(gè)或多個(gè)層構(gòu)成。這些層可以組裝在一起。方便地，這些層可以通過(guò)利用任何組裝手段而結(jié)合在一起，或可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法融合在一起。然而，該覆蓋層作為可除去的層而提供。第一層至少包括離解室、試劑和緩沖液儲(chǔ)存腔、以及部分通道。第二層至少包括壓電材料。另外，第二層包括與由第一層內(nèi)的室和儲(chǔ)存腔上升的通道連接的部分通道，且其中閥和泵形成于第二層與第三層之間的界面處。此外，有通道形成在第二層與第三層之間以及第一層與第二層之間的界面處。該生物芯片可以進(jìn)一步包括罩層以覆蓋第一層。該罩層有助于防止當(dāng)PZT材料運(yùn)動(dòng)時(shí)裝置內(nèi)的液體溢出。
尤其是，第二層和第三層之間的界面包括用于閥和泵的凹部。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行調(diào)整，尤其是調(diào)整該凹部在裝置內(nèi)的位置，該調(diào)整使裝置能執(zhí)行相同的功能。
第三層可以進(jìn)一步包括致動(dòng)該閥和泵的裝置。尤其是，第三層可包括連接至氣動(dòng)源以致動(dòng)閥的通孔。
可以在圖11A和11B中看到該生物芯片裝置的結(jié)構(gòu)的實(shí)例。圖11A示出了儲(chǔ)存腔、泵、閥、通道和室連接的縱向(橫斷)剖面視圖，而圖11B示出了離解室、泵、閥、通道和室連接的不同縱向(橫斷)剖面視圖。
第一層包括離解室和試劑儲(chǔ)存腔。第一層進(jìn)一步包括穿過(guò)第一層和第二層的界面，分別從儲(chǔ)存腔和室路由的通道。該通道進(jìn)一步路由穿過(guò)第二層而進(jìn)入第三層，通向存在于第二層和第三層界面處的泵單元和閥單元。
該生物芯片可以進(jìn)一步包括結(jié)合與混合室。該生物芯片還可以包括提取/洗脫/PCR室。
圖11A示出了生物芯片包括第一層內(nèi)的儲(chǔ)存腔和室，而圖11B示出了包括離解室和室的生物芯片。圖11A和11B中涉及的室為提取/洗脫/PCR室。在這兩個(gè)圖示中，未示出結(jié)合與混合室。另外，應(yīng)該注意，圖11A和11B是指相同的生物芯片。然而，第一層內(nèi)的部件的差異是由于各個(gè)圖示中涉及的不同縱向(橫斷)剖面視圖所引起的。另外，圖12A和12B示出了圖11的生物芯片內(nèi)的離解室的放大視圖。
生物芯片裝置還可以包括第二室，該第二室為結(jié)合與混合室(也稱為“儲(chǔ)存腔”)，如圖9和圖10所示。因此，本發(fā)明的生物芯片裝置還可以包括結(jié)合與混合室內(nèi)的第二PZT材料(總是與第二材料接觸)。
該至少三個(gè)層、閥和微型泵隔膜以及罩層可以分別制造或者購(gòu)買(mǎi)，它們均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒(kit)，其包括至少三個(gè)層、罩和可選地用于閥和泵的隔膜、以及另外的一種或多種PZT材料。該試劑盒還包括罩層。這些層、隔膜、以及PZT材料在使用之前可以接合或者組裝在一起。可以通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的可拆卸緊固裝置進(jìn)行接合或組裝?？商鎿Q的，根據(jù)已知方法或技術(shù)可以將這些層膠粘在一起或者熔合在一起。
如上所述，第二材料可以是為PZT材料提供支撐的任何合適材料，從而防止其在致動(dòng)過(guò)程中彎曲。因此，第二材料的楊氏模量為50至220GPa。第二材料可以是金屬、聚合物、玻璃等。該金屬可以選自由鋼、不銹鋼、黃銅、銅和鋁組成的組。然而，也可以使用其他金屬。聚合物材料可以選自由聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚氯乙烯(PVC)組成的組。然而，也可以使用其他已知的聚合物。
該第二材料可以具有粗糙表面，該粗糙表面與樣品和/或細(xì)胞接觸。尤其是，由硅珠層形成該粗糙表面。硅珠的直徑可以為100至400μm。然而，與離解室內(nèi)的生物樣品接觸的第二材料的表面也可以具有平滑表面。
該P(yáng)ZT材料可以為任何合適的形式，例如盤(pán)片、桿或棒的形式，或者具有至少3個(gè)側(cè)面的平面形狀的結(jié)構(gòu)。
該P(yáng)ZT材料需要由外部電壓源來(lái)致動(dòng)。因此，該P(yáng)ZT材料和第二材料包括用于致動(dòng)PZT材料的裝置，例如兩個(gè)電極。當(dāng)?shù)诙牧蠟榻饘贂r(shí)，一個(gè)電極連接至PZT材料，而第二電極連接至第二材料。然而，當(dāng)?shù)诙牧蠟榉菍?dǎo)電材料例如聚合物材料時(shí)，則兩個(gè)電極將連接至PZT材料。用于連接或施加于PZT材料的電極的裝置將優(yōu)選地不集成到芯片卡盒內(nèi)。例如，用于連接的兩個(gè)可移除的引腳或其他部件可插入到該生物芯片裝置內(nèi)，以連接外部電壓源和PZT材料。該用于連接的部件是可拆除的。
該生物芯片的閥是微型閥。將由本領(lǐng)域中已知的任何合適材料制成的隔膜置于閥開(kāi)口中。微型閥的隔膜優(yōu)選由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。微型閥由外部氣動(dòng)源加以致動(dòng)。外部氣動(dòng)源提供真空和/或壓縮空氣以致動(dòng)微型閥。
本發(fā)明的生物芯片進(jìn)一步包括用于微型泵的隔膜。該微型泵隔膜可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。微型閥由外部氣動(dòng)源致動(dòng)。外部氣動(dòng)源提供真空和/或壓縮空氣以致動(dòng)該微型閥。
如圖9和圖10所示，該生物芯片可以進(jìn)一步包括提取/洗脫/PCR室。該提取/洗脫/PCR室可以沉積有坡莫合金引腳。外部電磁體可貼附到室下方，以便吸引連接或結(jié)合分析物(例如核酸)的磁性珠體。
結(jié)合與混合室可以包括與第二材料接觸的另外PZT材料以增強(qiáng)混合與結(jié)合。另外，結(jié)合與混合室可以包括涂敷有用于結(jié)合核酸分子的至少一種連接子的珠體，或者免疫磁性捕獲珠體。涂敷有用于結(jié)合核酸分子的至少一種連接子的珠體可以是磁性珠體。
該生物芯片可以進(jìn)一步包括可集成到該生物芯片內(nèi)的其他部件，例如生物傳感器、RT-PCR和微陣列。圖10示出了該裝置的工作過(guò)程。微型泵為大容量的微流控裝置。根據(jù)本發(fā)明的生物芯片的設(shè)計(jì)，所使用的微型泵的數(shù)目減少，并使用微型閥替代微型泵以引導(dǎo)試劑。圖10所示生物芯片裝置包括九個(gè)閥和一個(gè)微型泵以用于流體操縱；用于組織離解的PZT致動(dòng)的室和用于珠體-mRNA結(jié)合的PZT致動(dòng)的儲(chǔ)存腔；以及四個(gè)儲(chǔ)存腔，用于存儲(chǔ)洗滌緩沖液A、洗滌緩沖液B、洗脫/RT-PCR試劑和產(chǎn)物(RNA、mRNA或cDNA，取決于要求)。在微室內(nèi)部進(jìn)行mRNA提取和PCR，其中該微室沉積有磁性材料，例如沉積有坡莫合金，更具體地沉積有坡莫合金引腳。電磁體可以設(shè)置在室下方。
圖9為原型裝置的照片。用于操縱流體的泵和閥由外部氣動(dòng)源致動(dòng)。
從圖10可以看出，在使用該裝置之前，試劑被預(yù)加載入其各自的儲(chǔ)存腔和室。重量為0.1mg至100mg的組織樣品被置入預(yù)加載了70μl至100μl的PBS緩沖液的離解室。致動(dòng)涂敷有硅珠的PZT材料，以便對(duì)組織樣品產(chǎn)生強(qiáng)大的空化和沖擊力，這在60秒內(nèi)碎裂樣品。同時(shí)徹底裂解組織樣品的細(xì)胞。打開(kāi)閥V1-V2、V4-V5，且開(kāi)啟微型泵。包含生物分子的離解的生物溶液傳送到已經(jīng)預(yù)加載有結(jié)合緩沖液和磁性珠體的結(jié)合與混合儲(chǔ)存腔內(nèi)。該儲(chǔ)存腔還具有內(nèi)置的PZT材料用于提高混合效率。當(dāng)將磁性珠體(涂敷有OligodT)與裂解物組織溶液混合時(shí)，mRNA被Oligo dT捕獲并結(jié)合至磁性珠體的表面。打開(kāi)閥V3、V4、V5，并同時(shí)進(jìn)行微泵浦，從而將磁性珠體移動(dòng)至用于洗脫的提取和PCR室。該電磁體此時(shí)起作用。使微型泵處于開(kāi)啟狀態(tài)更長(zhǎng)的時(shí)間，使得結(jié)合室內(nèi)的試劑可以穿過(guò)提取/PCR室?guī)状?，以保證幾乎所有珠體被回收到提取/PCR室內(nèi)。當(dāng)閥V3關(guān)閉時(shí)，結(jié)合儲(chǔ)存腔被用于存儲(chǔ)廢棄材料和化學(xué)品。在珠體已經(jīng)被捕獲到提取/PCR室內(nèi)之后，首先打開(kāi)V6，接著打開(kāi)V7，使得洗滌緩沖液A和洗滌緩沖液B可以流到用于mRNA純化的室。在最后的步驟中，打開(kāi)閥V8，而洗脫緩沖液或PCR試劑被泵浦到提取/PCR室以用于mRNA洗脫或PCR擴(kuò)增。從組織加載到mRNA洗脫的工藝時(shí)間將耗費(fèi)約15分鐘(PCR熱循環(huán)不包括在內(nèi))。大部分時(shí)間消耗在mRNA純化過(guò)程。
用于試劑遞送的集成聚合物微型泵生物芯片裝置中使用的微型泵必須產(chǎn)生足夠的壓力，以將流體從一個(gè)位置推進(jìn)穿過(guò)微通道到達(dá)另一特定位置。最有希望的方法是隔膜泵的構(gòu)思，其中通過(guò)兩個(gè)單向閥或者兩個(gè)噴嘴/擴(kuò)散器構(gòu)造連接室。近年來(lái)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)和開(kāi)發(fā)了基于不同致動(dòng)原理以及由不同技術(shù)制造的多種微型泵(Disier Maillefer，et al.，MEMS 1999，Orlando，F(xiàn)lorida；R.Linnemann，et al.，The 11thannual international workshop onMEMS，1998，Heidelberg German，pp.532-5371)。
對(duì)于隔膜泵，重要的是獲得最大的壓縮比以用于高性能的過(guò)程例如自吸和氣泡容差。該壓縮比定義為ε＝(ΔV+V0)/V0這里，ΔV為行程容積(搏出量，stroke volume)，V0為死體積(dead volume)。死體積必須最小化而行程容積必須最大化，以便實(shí)現(xiàn)更高的壓縮比。
壓電致動(dòng)器、形狀記憶合金、靜電致動(dòng)器以及其它的氣動(dòng)致動(dòng)器已經(jīng)被用作致動(dòng)微型泵。這些泵需要復(fù)雜的制造工藝，但是僅產(chǎn)生有限的流速和相對(duì)低的壓力，因?yàn)槲⒅聞?dòng)器能夠產(chǎn)生有限的力。泵的行程容積也是有限的。因此，難以實(shí)現(xiàn)良好的泵性能。此外，對(duì)于類似本發(fā)明的生物芯片裝置的一次性應(yīng)用，這些泵過(guò)于昂貴。
在本發(fā)明的生物芯片的設(shè)計(jì)中，致動(dòng)器隔膜和入口/出口閥隔膜選用具有低的楊氏模量(20Mpa)、高的延展率、生物兼容性以及良好的密封性能的PDMS材料。相對(duì)高的壓縮比能夠使微型泵獲得自吸和氣泡容差。由于PDMS的良好密封性能，不存在回流。聚碳酸酯板具有多種功能，首先，用于構(gòu)造該生物芯片裝置，其次，用于形成泵殼和閥罩。
PDMS隔膜、上泵殼和下泵殼形成了氣密的泵室。施加壓縮空氣和真空以致動(dòng)微型泵。上泵殼和下泵殼中的微型泵室的深度可以為200μm。這限制了PDMS致動(dòng)隔膜的變形；因此可以實(shí)現(xiàn)精確的行程容積。流速對(duì)泵浦介質(zhì)粘度、出口和入口壓力是不敏感的。
外部氣動(dòng)源連接至生物芯片裝置的底部以致動(dòng)泵。入口和出口孔形成于連接層中，且它們與位于儲(chǔ)存腔層內(nèi)的微通道連通。
PDMS無(wú)法由光限定，且不能通過(guò)光刻圖案化。此外，PDMS無(wú)法被旋涂以獲得均勻厚度。因此，本發(fā)明裝置中的PDMS隔膜由微型模具加以模制。使用兩個(gè)部分的PDMS溶液(Sylgardl84 SiliconElastomer，Dow Corning)澆鑄隔膜。以10∶1的比例混合該溶液的A部分和B部分。將其緩慢地灌注到模具內(nèi)，隨后將其置于真空干燥器中約1小時(shí)，以釋放被捕獲在PDMS混合物內(nèi)的氣泡。一旦不存在可見(jiàn)的氣泡，則使用平坦光滑的刀片橫切該模具的上表面，同時(shí)保持與該表面接觸。這是為了保證固化的PDMS隔膜具有與模具深度相同的厚度。整個(gè)裝置隨后在爐內(nèi)于70℃下固化一小時(shí)。最后，獲得均勻厚度的PDMS隔膜，并可以從模具取出PDMS隔膜。
制作并特征化單個(gè)泵，隨后將泵集成到生物芯片裝置內(nèi)。圖13(A，B)示出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)使用水作為泵浦介質(zhì)時(shí)，獲得了2m的最大泵壓頭。流速與致動(dòng)頻率呈線性關(guān)系，且與輸出壓力(泵壓頭)無(wú)關(guān)。
用于引導(dǎo)流體的微型閥生物芯片裝置內(nèi)的另一個(gè)關(guān)鍵部件為微型閥。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了由硅材料和聚合物材料制成的微型單向閥和微型主動(dòng)閥。盡管單向閥設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，其諸如單向流動(dòng)的固有限制制約了其應(yīng)用。此外，內(nèi)置的微型致動(dòng)器主動(dòng)微型閥用于一次性生物芯片應(yīng)用過(guò)于昂貴。
在本發(fā)明的生物芯片中，與本發(fā)明的微型泵結(jié)構(gòu)相似，已經(jīng)設(shè)計(jì)出用于引導(dǎo)流體的簡(jiǎn)單PDMS隔膜微型閥。使用與用于本發(fā)明的微型泵相似的外部氣動(dòng)源致動(dòng)微型閥。
閥被構(gòu)造在生物芯片裝置的連接層內(nèi)，用于容易地連通位于儲(chǔ)存腔層內(nèi)的微通道。PDMS隔膜的柔性使得閥在-0.1atm壓力下可以起作用。當(dāng)閥閉合時(shí)，其呈現(xiàn)非常良好的密封性。圖14示出了其流速與入口壓力的關(guān)系。
用于mRNA提取/PCR/洗脫的多功能室在多種可利用的生物樣品分離技術(shù)中，磁性生物分離技術(shù)已經(jīng)被認(rèn)為是一種非常有希望的技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為，其容易操縱例如DNA、RNA和mRNA的生物分子。在該生物芯片裝置中，在其表面上涂敷有Oligo(dT)的Dynal珠體被用于mRNA提取。珠體直徑約為2.5μm。
mRNA提取、洗滌和PCR過(guò)程在體積為20μl的多功能室內(nèi)完成。將涂敷有10μm聚酰亞胺(獲自MicroChem的P12525)的金屬板置于室的底部。將微型電磁體置于室下方以產(chǎn)生磁場(chǎng)。當(dāng)DC電流(直流電流)驅(qū)動(dòng)電磁體時(shí)，磁場(chǎng)將吸引該珠體并保證它們保留在室內(nèi)。當(dāng)電磁體由頻率為22kHz的交流電流驅(qū)動(dòng)時(shí)，在金屬板中感應(yīng)產(chǎn)生邊緣電流，且該邊緣電流產(chǎn)生熱量用于PCR擴(kuò)增。實(shí)現(xiàn)了16℃/s的加熱速率和9.6℃/s的冷卻速率。這種非接觸加熱方法將加熱部件(電磁體)和傳感器與生物芯片裝置分離，因此使得生物芯片裝置的成本效率更高。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了在芯片卡盒或生物芯片內(nèi)破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法，包括步驟-加載試劑和樣品；-致動(dòng)壓電材料，其中該壓電材料與第二材料接觸；-獲得破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞；以及-回收洗出液。
通過(guò)外部電壓源致動(dòng)而致動(dòng)PZT材料、破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法與上述使用芯片卡盒的方法相同。
該生物芯片裝置包括用于致動(dòng)PZT材料的裝置，例如上述的兩個(gè)電極。當(dāng)存在兩個(gè)PZT材料時(shí)，即一個(gè)位于離解室內(nèi)而一個(gè)位于結(jié)合與混合室內(nèi)，每個(gè)PZT材料具有兩個(gè)電極。
壓電材料的致動(dòng)產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊和空化以引起組織破碎。在離解室內(nèi)發(fā)生破碎和/或細(xì)胞裂解。
加載的樣品通常為0.1mg至100mg。該樣品可以是來(lái)自動(dòng)物、人體、植物、或者細(xì)菌和/或病毒樣品的組織。該樣品可以是新鮮或冷凍的組織樣品。該樣品可以是經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、全血細(xì)胞、血清、尿、唾液或來(lái)自活組織檢查的組織。
離解室可以預(yù)加載有緩沖液(緩沖劑)。
該方法進(jìn)一步包括以下步驟分離、純化和/或擴(kuò)增從破碎的組織和裂解的細(xì)胞獲得的核酸，以及回收該核酸。試劑包括洗滌緩沖液和洗脫/RT PCR試劑。
通過(guò)加入涂敷有至少一種連接子的珠體，并回收連接至珠體的核酸，可以從破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞回收核酸。該珠體可以是磁性珠體。可替換地，可以使用免疫磁性捕獲珠體。通過(guò)致動(dòng)第二壓電材料以增大混合與結(jié)合效率，可以進(jìn)行珠體上的連接子與核酸的結(jié)合或該連接子與免疫磁性捕獲珠體的結(jié)合。
分離、純化和/或擴(kuò)增步驟可以在如圖9和圖10所示的室內(nèi)進(jìn)行。核酸通過(guò)外部電磁體回收。所回收的核酸分子為DNA、RNA和/或mRNA。
現(xiàn)在，已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，通過(guò)參照以下實(shí)施例將可以更容易地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是以舉例說(shuō)明方式提供，而并不為了非限制本發(fā)明。
實(shí)施例在芯片卡盒(不包括圖1、圖2)上進(jìn)行以下實(shí)施例1，然而，實(shí)施例1也適用于本發(fā)明的生物芯片裝置(不包括圖9)。
實(shí)施例1芯片卡盒和/或生物芯片裝置——實(shí)驗(yàn)配置同時(shí)使用重量為1mg至50mg的新鮮和冷凍的大鼠肝臟組織樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在將組織通過(guò)入口端口放入芯片卡盒的室之前，唯一的預(yù)處理過(guò)程為使用水洗滌組織。這是為了除去碎片例如血液。冷凍組織樣品是來(lái)自在液氮(-180℃)中的剛切割的組織。該室證實(shí)能夠破碎其他組織，例如心臟、肌肉和腎臟組織。
將預(yù)處理的組織與100μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)一起置于微型芯片卡盒室內(nèi)。在使用功率放大器驅(qū)動(dòng)壓電盤(pán)片之前，使用固定螺釘密封入口端口。由于芯片卡盒是透明的，因此可以容易地觀察破碎過(guò)程。
新鮮樣品直接從大鼠肝臟組織切割，重量為5mg至50mg。成功地將大鼠肝臟組織、心臟組織、肌肉組織和腎臟組織用于該實(shí)驗(yàn)。
通過(guò)將微型K型熱電偶插入室以測(cè)量溫度，由此研究芯片卡盒室溫度對(duì)核酸的影響。
破碎時(shí)間和組織尺寸圖4(A)和(B)示出了使用100μl PBS溶液在20秒內(nèi)破碎的10mg大鼠新鮮肝臟組織的組織化溶液。組織被完全破碎成直徑小于7.8μm的顆粒。在溶液中未觀察到細(xì)胞。這表明包含在組織內(nèi)的細(xì)胞在破碎步驟已經(jīng)被裂解。
記錄時(shí)間以用于比較組織樣品的破碎時(shí)間和尺寸。所施加的驅(qū)動(dòng)電壓和頻率分別為250Vpp和6.2kHz。每個(gè)樣品重量測(cè)量三次。圖5示出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于重量范圍為25mg至50mg的組織，完全破碎的時(shí)間幾乎相同且該時(shí)間小于13秒。更少量的組織和細(xì)胞樣品需要的處理時(shí)間更少。
冷凍組織樣品給出相似的結(jié)果，但是破碎時(shí)間略微減少。冷凍組織比新鮮組織更硬，因此更容易被室破碎。
致動(dòng)時(shí)間和室溫度壓電盤(pán)片在受到致動(dòng)時(shí)將產(chǎn)生熱量。高溫將影響生物分子的質(zhì)量。這對(duì)于RNA質(zhì)量尤其有害。為了檢驗(yàn)熱量是否容易傳導(dǎo)到容納未破碎的組織的破碎室以及本發(fā)明的芯片卡盒的室內(nèi)組織化組織溶液混合物，通過(guò)插入K型熱電偶測(cè)量并通過(guò)數(shù)字讀出器讀出該破碎溫度上升。破碎室溫度變化示于圖6。未采用任何附加的冷卻，室溫度上升保持在最大值為66℃。
基因質(zhì)量測(cè)試使用傳統(tǒng)的提取方法進(jìn)行全部RNA和mRNA質(zhì)量測(cè)試。大鼠肝臟新鮮組織和冷凍組織均采用。這些測(cè)試獨(dú)立地使用均漿器破碎和微型室破碎。
基因質(zhì)量檢查使用Agilent BioChem Workstation 84X設(shè)備進(jìn)行純化和產(chǎn)率OD測(cè)試。對(duì)于新鮮組織和冷凍組織，A280/A260的平均比率分別為1.98和1.99，非常接近由均漿器破碎的新鮮組織的比例2.00。
如圖7所示，還使用上述設(shè)備進(jìn)行全部RNA產(chǎn)率測(cè)試。破碎室對(duì)新鮮組織和冷凍組織的平均總RNA產(chǎn)率分別為5.50μg和5.45μg，與由均漿器破碎的新鮮組織的產(chǎn)率5.40μg相當(dāng)。
用Dynal Oligo(dT)磁性珠體提取mRNA，并用洗滌緩沖液純化mRNA。對(duì)于選定的乳房腫瘤相關(guān)基因和管家基因例如CD59、角蛋白19、TP53、β-肌動(dòng)蛋白、GAPDH、親環(huán)蛋白和β-微球蛋白，使用MJ Research PTC-200通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增30個(gè)周期。RT-PCR引物來(lái)自Sigmat HSRT-100 DuraScript RT-PCR試劑盒。
圖8(A)示出了從新鮮組織和冷凍組織提取的TP53 mRNA的瓊脂糖凝膠結(jié)果。隨后從RT-PCR獲得cDNA。測(cè)試中最長(zhǎng)的全長(zhǎng)cDNA為1176bps。圖8(B)示出了具有360bps的最短的β-微球蛋白的相同結(jié)果。從圖示，所提取的mRNA是完整無(wú)損的，且位于凝膠照片中的正確位置。mRNA的產(chǎn)率為0.155μg/mg組織。
結(jié)論使用了用于快速和同時(shí)進(jìn)行哺乳動(dòng)物組織破碎和細(xì)胞裂解的本發(fā)明的原型微型芯片卡盒。通過(guò)掃描頻率高壓驅(qū)動(dòng)方法，在30秒內(nèi)進(jìn)行組織破碎。對(duì)于每mg新鮮或冷凍組織，總RNA和mRNA產(chǎn)率分別為約5.45μg和0.155μg/mg。凝膠電泳顯示獲得了完好無(wú)損的RNA和mRNA。因此，如圖1和2所示，本發(fā)明的一次性芯片卡盒證明是用于破碎組織和回收核酸分子的易于使用、高效、且快速的裝置。因此，芯片卡盒可以作為用于檢測(cè)基因的有效裝置。尤其是，其中生物樣品是來(lái)自活組織檢查的組織，本發(fā)明的芯片卡盒代表了用于確定癌癥生物標(biāo)記和基因相關(guān)分析的有效診斷方法。
實(shí)施例2生物芯片裝置(圖9和圖10)在本發(fā)明的生物芯片裝置(圖9、圖10和圖11)中，使用了用于同時(shí)哺乳動(dòng)物組織破碎和細(xì)胞裂解的微型空化室。該室采用PZT盤(pán)片作為致動(dòng)器，以產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊和空化，用于新鮮或冷凍組織離解。在厚為0.2mm、直徑為15mm的黃銅盤(pán)片的一個(gè)表面上涂敷有一層膠(Araldite-Rapid)，以便將硅珠粘附至其表面。在另一個(gè)表面上膠粘有直徑為10mm的壓電盤(pán)片(來(lái)自PHILIPSTM的PXE5)。具有非常鋒利邊緣的硅珠被膠粘到與壓電盤(pán)片側(cè)相對(duì)的盤(pán)表面上。所使用的珠體的直徑變化范圍為100μm至400μm。這種珠體常見(jiàn)于水射流機(jī)器中，其采用來(lái)自噴嘴的高壓水以切割金屬。這種特殊制作的PZT盤(pán)片被用來(lái)獲得最大的離解效率。
組織離解室的尺寸為14.5mm×0.7mm，容積為115μl。通過(guò)位于室側(cè)壁的入口，將組織和試劑加載入該室。
盡管壓電致動(dòng)器具有例如尺寸緊湊且能量密度高的優(yōu)點(diǎn)，但是壓電盤(pán)片需要相對(duì)高的致動(dòng)電壓(Madou，Marc J.，CRC press，1997，416-419)。使用實(shí)驗(yàn)室制造的功率放大器致動(dòng)PZT盤(pán)片，其中該功率放大器輸出峰-峰電壓為280V的正弦波且掃描頻率為3Hz(然而，可以使用5.4kHz至6.6kHz的掃描頻率)。實(shí)驗(yàn)表明，采用掃描頻率，在組織離解室內(nèi)獲得了更強(qiáng)的空化，因此改善了組織離解性能。進(jìn)行了與實(shí)施例1中所述相同的實(shí)驗(yàn)，示出了完全離解不同組織尺寸的大鼠肝臟組織所需的時(shí)間。結(jié)果示于圖4(A)和圖(B)以及圖5。
權(quán)利要求
1.一種用于破碎樣品組織和/或裂解細(xì)胞的裝置，包括壓電材料；以及與所述壓電材料接觸的至少第二材料；且其中所述第二材料在與所述壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述第二材料被膠粘或固定到所述壓電材料上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述粗糙表面由硅珠層形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的裝置，其中，所述硅珠的直徑為100至400μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述第二材料的楊氏模量為50至220GPa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述壓電材料為盤(pán)片、桿或棒的形式，或者為具有至少3個(gè)側(cè)面的平面形狀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述裝置是一次性的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述裝置是芯片卡盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中，所述芯片卡盒進(jìn)一步包括入口端口、出口端口和至少一個(gè)室。
10.根據(jù)權(quán)利要求8至9中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述芯片卡盒被集成到生物芯片。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述裝置為生物芯片裝置并且進(jìn)一步包括-離解室；-試劑和緩沖液儲(chǔ)存腔；-一個(gè)或多個(gè)閥；-一個(gè)或多個(gè)泵；以及-連接所述室、儲(chǔ)存腔和閥的通道。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其中，所述裝置進(jìn)一步包括結(jié)合與混合室和/或提取/洗脫/PCR室。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述結(jié)合與混合室包括壓電材料以及與所述壓電材料接觸的第二材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述閥為微型閥。
15.根據(jù)權(quán)利要求所述14的裝置，其中，所述微型閥包括由包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)的材料制成的隔膜微型閥。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述泵為微型泵并包括隔膜。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，其中，所述隔膜由包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)的材料制成。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述提取/洗脫/PCR室沉積有磁性材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述結(jié)合與混合室包括涂敷有至少一種連接子的珠體，所述連接子用于結(jié)合核酸分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的裝置，其中，所述珠體是磁性珠體。
21.根據(jù)權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述生物芯片裝置由至少三個(gè)層、用于所述閥的一個(gè)或多個(gè)隔膜以及用于所述泵的一個(gè)或多個(gè)隔膜構(gòu)成，且其中第一層至少包括所述離解室、試劑和緩沖液儲(chǔ)存腔，第二層至少包括壓電材料，且其中所述閥和泵位于所述第二層與第三層之間的界面處，而所述通道位于所述第一層與第二層以及所述第二層與第三層的界面處。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，進(jìn)一步包括罩，以置于所述第一層上。
23.一種在裝置內(nèi)破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法，包括以下步驟-加載樣品和試劑；-致動(dòng)壓電材料，其中所述壓電材料與第二材料接觸，且其中所述第二材料在與所述壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面，所述粗糙表面接觸所述樣品；-獲得破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞；以及-回收洗出液。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述粗糙表面由硅珠層形成。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述硅珠的直徑為100至400μm。
26.根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，由外部電壓源致動(dòng)所述壓電材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述外部電壓源供給變頻電壓以致動(dòng)所述壓電材料。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是動(dòng)物、人體、植物、或來(lái)自脂肪的組織和/或細(xì)胞樣品。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的或冷凍的組織和/或細(xì)胞樣品。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至29中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟分離、純化和/或擴(kuò)增從所述破碎的組織和裂解的細(xì)胞獲得的核酸，以及回收所述核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，通過(guò)加入涂敷有至少一種連接子的珠體從所述破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞回收核酸，且其中所述珠體上的連接子與核酸的結(jié)合通過(guò)致動(dòng)第二壓電材料以提高混合與結(jié)合效率而進(jìn)行，以及回收連接至所述珠體的核酸。
32.一種包括壓電材料的壓電裝置，所述壓電材料接觸至少第二材料；且其中所述第二材料在與所述壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的壓電裝置，其中，所述粗糙表面由硅珠層形成。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的壓電裝置，所述，所述硅珠的直徑為100至400μm。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項(xiàng)所述的壓電裝置，其中，所述第二材料的楊氏模量為50至220GPa。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35中任一項(xiàng)所述的壓電裝置，其中，所述壓電材料為盤(pán)片、桿或棒的形式，或者為具有至少3個(gè)側(cè)面的平面形狀。
全文摘要
一種用于破碎樣品組織和/或裂解細(xì)胞的裝置，包括壓電材料；以及與該壓電材料接觸的至少第二材料，且其中該第二材料在與該壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。該裝置可通過(guò)組裝至少三個(gè)層以及用于閥和泵的隔膜而制成。壓電材料由外部電壓源，尤其是調(diào)制交流外部電壓源致動(dòng)以產(chǎn)生空化，該空化破碎組織和/或裂解細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在裝置內(nèi)破碎組織和/或裂解細(xì)胞的方法，包括以下步驟加載樣品和試劑；致動(dòng)壓電材料；獲得破碎的組織和/或裂解的細(xì)胞；以及回收洗出液。本發(fā)明還提供了一種包括壓電材料的壓電裝置，該壓電材料接觸第二材料；且其中該第二材料在與該壓電材料接觸側(cè)的相對(duì)側(cè)上具有粗糙表面。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1993459SQ200580026297
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者徐國(guó)林, 毛佩玲, 余彥宏, 鄭榮福 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局