專利名稱：測定fad合成酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶的活性的方法和鑒定調(diào)節(jié)該酶的活性的方法。
背景FAD合成酶催化輔因子黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的生物合成中的最終步驟，F(xiàn)MN和FAD是很多酶的關(guān)鍵輔因子。
細菌中的FAD合成酶是具有兩種酶活性的雙功能蛋白。一種酶活性，即黃素激酶(FK)活性，是核黃素(rfl)的磷酸化，以產(chǎn)生FMN。另一種酶活性，即FAD合成酶(FADS)活性，是FMN的腺苷酸化，以產(chǎn)生FAD。預測這種生物合成途徑存在于許多致病細菌物種中，并且預測，這兩種酶促步驟，即FK和FADS對細菌存活力都是關(guān)鍵的(Gerdes et al.，J.Bacteriol.，1844555-4572，2002)。
在許多細菌，包括枯草芽孢桿菌(Kearney et al.，J.Biol.Chem.，2549551-9557，1979)和產(chǎn)氨棒桿菌(Spencer et al.，Biochemistry，151043-1053，1976)上進行了調(diào)查FAD合成酶的酶活性的研究。枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌的體外實驗顯示FAD合成酶的FK和FADS都采用ATP。但是，F(xiàn)AD合成酶的酶活性需要其黃素底物處于特定氧化還原狀態(tài)。例如，體外顯示枯草芽孢桿菌需要還原的黃素以得到FK和FADS活性。相反，報道了來自產(chǎn)氨棒桿菌的FAD合成酶在缺乏添加的還原劑的條件下催化由Rfl形成FMN和由FMN形成FAD，因此采用氧化的黃素作為底物。
發(fā)明概述FAD合成酶是一種雙功能蛋白，其具有兩種酶活性(1)黃素激酶(FK)活性，其是核黃素(rfl)的磷酸化，以產(chǎn)生FMN，和(2)FAD合成酶(FADS)活性，其是FMN的腺苷酸化，以產(chǎn)生FAD，或該反應的逆轉(zhuǎn)，即FAD脫腺苷酸為FMN。本發(fā)明部分是基于以下發(fā)現(xiàn)，即來自致病物種葡萄球菌、鏈球菌或沙門氏菌的細菌FAD合成酶的酶活性需要還原的底物。此外，發(fā)現(xiàn)來自沙門氏菌的細菌FK的活性需要還原的核黃素。
本發(fā)明也包括通過在測試化合物存在下確定FMN或FAD形成或消耗而鑒定FAD調(diào)節(jié)劑的活性的方法。此外，可以通過在測試化合物存在下測定FMN形成而確定FK調(diào)節(jié)劑的活性。本發(fā)明特別適合于用高通量篩選(HTS)鑒定感興趣的化合物。
因此，一方面，本發(fā)明包括確定細菌合成酶活性的方法。該方法包括使選自葡萄球菌，鏈球菌、沙門氏菌的細菌FAD合成酶或其功能片段與FAD合成酶的還原的底物接觸；并且確定細菌FAD合成酶的活性。還原的底物可以是核黃素、FMN或FAD。
另一方面，本發(fā)明包括確定特別是FADS或細菌黃素激酶(FK)的活性的方法。例如，該方法包括使選自葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌的細菌FK或其功能片段與還原的核黃素接觸；并且確定細菌FK的活性。
另一方面，本發(fā)明包括鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法。該方法包括使選自葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌的細菌FAD合成酶或其功能片段與細菌FAD合成酶的還原的底物和測試化合物接觸；并且確定細菌FAD合成酶的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FAD合成酶活性。
另一方面，本發(fā)明包括鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌FADS或FK的化合物的方法。例如，該方法包括使沙門氏菌的細菌FK或其功能片段與還原的核黃素和測試化合物接觸；并且確定細菌FK的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FK活性。
在上文描述的篩選方法中，葡萄球菌可以是金黃色葡萄球菌；鏈球菌可以是肺炎鏈球菌，并且沙門氏菌可以是鼠傷寒沙門氏菌。用于本發(fā)明的測試化合物可以是諸如肽、肽模擬物、小分子或其它藥物的化合物。
附圖簡述

圖1描述了表示FAD合成酶的系統(tǒng)發(fā)生距離的系統(tǒng)樹圖。
圖2描述了來自鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的FAD合成酶的蛋白比對。
圖3描述了具有RibF調(diào)節(jié)活性的化合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分提供了鑒定新的抗菌化合物的方法。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，即來自某些病原體的FAD合成酶的酶活性需要還原的底物。本發(fā)明提供了確定FAD合成酶的酶活性和鑒定增加或減少其活性的化合物的方法。目標病原體包括來自腸桿菌科的物種(如鼠傷寒沙門氏菌)、葡萄球菌物種(如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌)和鏈球菌物種(如肺炎鏈球菌、變異鏈球菌和釀膿鏈球菌)。
FAD合成酶編碼來自多種細菌物種的FAD合成酶的核酸是本領(lǐng)域公知的。例如，編碼來自鼠傷寒沙門氏菌的FAD合成酶的核酸序列可以從GenBank以AE008695獲得；編碼來自金黃色葡萄球菌的FAD合成酶的核酸序列可以從GenBank以NC_002758獲得；編碼來自肺炎鏈球菌的FAD合成酶的核酸序列可以從GenBank以AE008474獲得。
來自細菌屬葡萄球菌屬、鏈球菌屬或沙門氏菌屬的FAD合成酶可以用本領(lǐng)域公知的方法容易地獲得。例如，可以用來自鼠傷寒沙門氏菌的FAD合成酶分離編碼來自同一類或其它細菌物種的FAD合成酶同源物的cDNAs和基因。示例的方法包括但不限于核酸雜交法以及DNA和RNA擴增法，所述方法的實例是核酸擴增技術(shù)的各種使用(如聚合酶鏈反應(PCR)或連接酶鏈反應)。
例如，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，用來自鼠傷寒沙門氏菌的核酸的全部或一部分作為DNA雜交探針來篩選來自任何需要的細菌的文庫，從而直接分離FAD合成酶的cDNAs或基因組DNAs?？梢栽O計和合成基于鼠傷寒沙門氏菌的FAD核酸序列的特異性寡核苷酸引物。此外，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，如隨機引物、DNA標記、切口翻譯或末端標記技術(shù)，直接用完整序列合成DNA探針。此外，可以設計特異性引物，并且用于擴增這些序列的一部分或全長?？梢栽跀U增反應期間直接標記得到的擴增產(chǎn)物，或者在擴增反應后進行標記，并且用作探針，以便在合適的嚴格性條件下分離全長cNNA或基因組片段?？梢酝ㄟ^對這些片段測序而獲得cDNA或基因組片段的序列?；谂c已知基因序列的同源性而對未知基因進行測序和表征的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，CSH Press 1989)。
FAD合成酶的變體和功能片段FAD合成醇的變體包括基本保留了FAD合成酶的生物活性(如FK和/或FADS活性)的那些變體。典型的變體保留了野生型FAD合成酶活性的70％以上，例如，野生型FAD合成酶活性的75％，80％，85％，90％，95％或99％?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的方法測定變體的活性。變體包括由于天然等位基因變異或誘變而導致氨基酸序列不同的多肽。在另一實例中，功能變體典型地僅僅包含保守變異或非關(guān)鍵殘基或非關(guān)鍵區(qū)域中的變異?！氨Ｊ匦园被崛〈笔侵赴被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代。本領(lǐng)域定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分枝側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
由于FAD合成酶是具有FK和FADS活性的雙功能分子，可以將具有這些活性的FAD合成酶的功能片段用于本發(fā)明的方法中。功能片段是指具有FK或FADS活性的FAD合成酶的片段或變體。典型地，F(xiàn)K或FADS片段保留了野生型FAD合成酶活性的70％以上，例如，野生型FAD合成酶活性的75％，80％，85％，90％，95％或99％。
通常，F(xiàn)ADS活性存在于FAD合成酶的N-末端結(jié)構(gòu)域，并且FK活性存在于FAD合成酶的C-末端結(jié)構(gòu)域(Krupa et al.，(2001)TrendsBiochem.Sci.，101712-1728)。例如，已經(jīng)證明在大腸桿菌中，蛋白N-末端中的FAD合成酶氨基酸突變顯著減少了FADS活性，而蛋白C-末端中的突變減少了FK活性(參見美國專利No.5514574)。此外，來自細菌海棲熱袍菌的FAD合成酶(GenBank ID AAD35939)的X-線晶體結(jié)構(gòu)揭示了兩個結(jié)構(gòu)域的構(gòu)造，其中N-末端結(jié)構(gòu)域與腺苷酰轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)上同源，C-末端結(jié)構(gòu)域與黃素結(jié)合蛋白在結(jié)構(gòu)上同源(Wanget al.，(2003)Proteins，52633-635)。
可以通過常規(guī)的計算機化同源性檢索程序鑒定FADS或FK結(jié)構(gòu)域。例如，可以用同源性研究預測結(jié)構(gòu)域邊界，用于設計具有FK活性的蛋白片段或具有FADS活性的片段。公開了許多已知的算法，并且可以使用多種可商購的軟件進行檢索方法。軟件的實例包括MacPattern(EMBL)、BLASTN和BLASTX(NCBIA)。例如，可以使用在Sybase系統(tǒng)上實施BLAST(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-410)和BLAZE(Brutlag et al.(1993)Comp.Chem.17203-207)檢索算法的軟件來鑒定與已知FK結(jié)構(gòu)域或FADS結(jié)構(gòu)域同源的FK結(jié)構(gòu)域或FADS結(jié)構(gòu)域。在一個實例中，可以用NBLAST程序，得分＝100，字長＝12來進行BLAST核苷酸檢索，以獲得與FADS或FK結(jié)構(gòu)域同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字長＝3來進行BLAST蛋白檢索，以獲得與FADS或FK結(jié)構(gòu)域同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有空位的比對，可以按照Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中的描述利用Gapped BLAST。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各個程序(如XBLAST和NBLAST)的默認參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
在一個實例中，可以通過與海棲熱袍菌FADS結(jié)構(gòu)進行比較，鑒定金黃色葡萄球菌中的FADS結(jié)構(gòu)域(Wang et al.(2003)Proteins52633-635)。例如，可以用海棲熱袍菌的N-末端結(jié)構(gòu)域，即殘基Val2-Ser136，預測金黃色葡萄球菌酶的FADS結(jié)構(gòu)域邊界。通過比較N-末端結(jié)構(gòu)域和金黃色葡萄球菌酶的序列，預測從氨基酸Met1到大約Ser148的蛋白具有FADS活性，并且預測從金黃色葡萄球菌的氨基酸Ser148到Ile323的蛋白具有FK活性。
然后，可以容易地檢測變體或預測的多肽的活性。簡言之，可以檢測預測具有FADS活性的多肽片段催化從FMN形成FAD的能力，如Efimov et al.(1998)Biochemistry 379716-9723中的描述，在此引入其內(nèi)容作為參考，也可以檢測預測具有FK活性的多肽片段催化從核黃素形成FMN的能力，如Efimov et al.(1998)Biochemistry379716-9723中的描述，在此引入其內(nèi)容作為參考。
FAD合成酶蛋白可以從感興趣的細菌物種分離本發(fā)明的方法中使用的具有FADS活性的FAD合成酶蛋白或片段。分離FAD合成酶的方法是本領(lǐng)域公知的，例如，參見Efimov et al.(1998)Biochemistry 379716-9723，在此引入其內(nèi)容作為參考。或者，可以重組制備FAD合成酶或其功能片段。如果重組制備FADS，可以將FAD合成酶克隆到合適的表達載體中。典型地，重組表達載體包括一個或多個調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列是基于用于表達的宿主細胞而選擇的。調(diào)節(jié)序列與要表達的FAD合成酶核酸序列可操作性連接。“可操作性連接”表示FAD合成酶核酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許FAD合成酶核酸序列表達的方式連接(如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當載體被導入宿主細胞中時在宿主細胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(如聚腺苷酸化信號)。所述調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel(1990)MethodsEnzymol.1 853-7。
然后可以將表達載體導入感興趣的宿主細胞。例如，宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例如，可以在諸如大腸桿菌的細菌細胞、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞中表達具有FADS活性的功能片段。其它合適的宿主細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達載體導入宿主細胞。此處用到的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指多種本領(lǐng)域公知的用于將外來核酸(如DNA)導入宿主細胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-右旋糖苷介導的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法可以參見Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其它實驗室手冊。
還原的底物本發(fā)明的方法要求給FADS提供還原的黃素底物或給FK活性提供還原的核黃素。
為了提供還原的黃素，可以將還原劑加入氧化的黃素的溶液，以將其轉(zhuǎn)化為其還原形式。還原劑可以是酶系統(tǒng)，例如，氧化還原酶蛋白和煙酰胺底物，如來自細菌哈氏孤菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)H依賴性氧化還原酶(Tu，Antiox.Redox.Signal.，3881-897，2001)?；蛘?，還原劑可以是化學物質(zhì)，如連二亞硫酸鈉、硼氫化物，例如但不限于硼氫化鈉，或例如但不限于鈀的催化劑存在下是氫(Ghisla，Methods Enzymol.，66361-373，1980)。合適的還原性化學物質(zhì)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地鑒定。
可以檢測還原劑的效力，測定其產(chǎn)生FADS活性的底物的能力。例如，為了進行所述實驗，在25℃下，在測試的還原劑、25mMTris·HCl pH 7.5、ATP、核黃素和FAD合成酶存在下進行反應。溫育15分鐘后，猝滅反應，進行分析，以便對例如產(chǎn)生的FAD的量進行定量。
測量FAD合成酶或FK活性通過對體外反應或產(chǎn)物形成(例如ADP，F(xiàn)MN，Ppi或FAD)中底物(例如核黃素、ATP或FMN)更新的量進行定量，可以測量FAD合成酶的酶活性，即FADS或FK活性。所述方法是本領(lǐng)域公知的。例如，通過色譜分離和伴隨的對每種單獨的黃素的吸光度或熒光檢測，可以測量底物消耗和/或生成。此外，通過偶聯(lián)于需要FMN或FAD進行更新的酶，可以測量FMN和FAD。
簡言之，在一個實例中，為了確定FADS活性，可以通過分析正向反應而確定消耗的FMN的量或生成的FAD的量。在該實例中，通過添加FMN而起始FADS反應，從而可以進行體外酶促反應。在猝滅反應后，可以通過陰離子交換高效液相色譜對消耗的FMN或生成的FAD的量進行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13401-408，在此引入其內(nèi)容作為參考)。
或者，可以確定反向反應，其中FADS催化從FAD形成FMN。簡言之，在該實例中，通過添加FAD可以起始FADS反應，從而進行體外酶促反應。淬滅反應后，可以通過陰離子交換高效液相色譜對消耗的FAD或生成的FMN的量進行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13401-408)。
在另一實例中，可以通過偶聯(lián)于需要FMN或FAD的酶測量FMN和FAD。FMN偶聯(lián)酶的一個實例費氏弧菌是熒光素酶(Stanley(1971)Anal.Biochem.39441-453)。采用費氏弧菌熒光素酶，通過產(chǎn)生的熒光量對熒光素酶活性進行定量。可以通過陰離子交換高效液相色譜對消耗的FAD或生成的FMN的量進行定量FAD偶聯(lián)酶的一個實例是apo-D-氨基酸氧化酶(Hinkkanen(1983)Anal.Biochem.132202-208)?？梢酝ㄟ^產(chǎn)生的過氧化氫的量對apo-D-氨基酸氧化酶的活性進行定量。
對于FK活性，可以確定消耗的核黃素的量或生成的FMN的量。在該實例中，通過添加核黃素而起始FK反應，從而可以進行體外酶促反應。猝滅反應后，可以通過陰離子交換高效液相色譜對消耗的核黃素或生成的FMN的量進行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13401-408)。
或者，底物ATP消耗的測定值或產(chǎn)物ADP和焦磷酸鹽的生成量可以用于確定FAD合成酶的酶活性。對于FK反應，可以通過陰離子交換高效液相色譜確定消耗的ATP的量或生成的ADP的量。對于FK反應，可以通過偶聯(lián)于需要ADP進行更新的酶系統(tǒng)，如丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶(其中通過消耗的NADH的量對乳酸脫氫酶活性進行定量)而確定生成的ADP量(Jaworek et al.(1985)in Methods ofEnzymatic Analysis(Bergmeyer，H.U.，ed)3rdEd，7365-369)。對于FADS反應，通過添加焦磷酸酶而產(chǎn)生的焦磷酸鹽的量和釋放的磷酸鹽的檢測可以用于確定FADS活性。在一個實例中，通過采用產(chǎn)生比色讀數(shù)的孔雀綠和鉬酸銨，可以對磷酸鹽的量進行定量(Lanzetta et al.(1979)Anal.Biochem.10095-97)。
篩選方法本發(fā)明包括鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法。在一個實例中，該方法包括使選自葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌的細菌FAD合成酶或其功能片段與細菌FAD合成酶的還原的底物和測試化合物接觸；并且確定細菌FAD合成酶的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FAD合成酶活性?？梢园凑丈衔牡拿枋龃_定細菌FAD合成酶的活性。
在另一實例中，本發(fā)明包括鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌FADS或FK的化合物的方法。該方法可以包括使沙門氏菌的細菌FK或其功能片段與還原的核黃素和測試化合物接觸；并且確定細菌FK的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FK活性。
用于上述方法中的測試化合物包括諸如肽、肽模擬物、小分子或其它藥物的化合物。
上文的例子是為了說明本發(fā)明，不應該解釋為以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)包括了各種變化形式。
實施例實施例1金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌ribF基因的分離為了克隆ribF，設計了具有位于基因5’末端側(cè)翼的Nde1位點(加下劃線的)和位于3’末端側(cè)翼的Sal1或EcoR1位點(加下劃線的)的PCR正向和反向引物。按照制造商的描述，用High Fidelity PCR Master聚合酶(Roche，IN)從金黃色葡萄球菌(5’AAACGTGGATCCCATATGAAAGTCATAGAAGTG 3’(SEQ IDNO1))和(5’AAACGTGAATTCCTAAATATTATAAGCTAC3’(SEQID NO2))，肺炎鏈球菌(5’AAACGTCATATGATTATTACTATTCC3’(SEQ ID NO3))和(5’AAACGTGTCGACTTAAGACCAATTCCGAG3’(SEQ ID NO4))，以及鼠傷寒沙門氏菌(5’AGCTCATATGAAGCTGATACGCG3’(SEQ ID NO5))和(5’AGCTGAATTCTTACACCTGCCCGGC3’(SEQ ID NO6))擴增DNA。
用Nde1和Sal1消化PCR產(chǎn)物，并且連接到用這兩種限制酶切割的表達載體中。用連接混合物化學轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞。將細胞鋪板到補加了卡那霉素(25ug/ml)的LB板上，在37℃溫育過夜。通過DNA測序，檢驗從不同細菌菌落制備的質(zhì)粒的正確插入。將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進行蛋白過量表達，以產(chǎn)生得到金黃色葡萄球菌RibF、肺炎鏈球菌RibF和鼠傷寒沙門氏菌RibF的菌株。
(1)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌RibF的純化為了純化金黃色葡萄球菌RibF，37℃下在具有25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長大腸桿菌的細胞，直到OD600為0.5，然后用0.5mM IPTG誘導，在20℃生長4小時。將來自6L該發(fā)酵液的細胞重懸于70mL裂解緩沖液50mM Tris·HCl pH8.0，1mM DTT，10mM EDTA，25mM NaCl。4℃下通過弗氏壓碎器以18,000psi將細胞破碎兩次，然后4℃下以10,000rpm離心60分鐘。將上清液級分加樣到20mL Q-Seph FF(Amersham Biosciences)上，用緩沖液A50mM Tris·HCl pH8.0，1mM DTT，1mM EDTA，25mM NaCl平衡。用6倍柱體積的緩沖液A洗滌柱子，用10倍柱體積的從25mM-350mM NaCl的線性梯度洗脫。合并主要級分，調(diào)節(jié)到1M硫酸銨。將該級分加樣到20mL Ph-Sepharose柱(Amersham Biosciences，NJ)，用緩沖液50mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，1mM EDTA，1M硫酸銨平衡。用從1M-0M硫酸銨的線性梯度洗脫蛋白。合并含有蛋白的級分，在Amicon CentriPrep濃縮器中濃縮，加樣到用25mMTris·HCl pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1mM DTT，1mM EDTA平衡的200mL HiPrep Sephacryl S-200(Amersham Biosciences，NJ)中。等分純蛋白，在-80℃儲存。
采用與上文相同的程序純化肺炎鏈球菌RibF。
為了純化鼠傷寒沙門氏菌RibF，37℃下在含有25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長大腸桿菌細胞，直到OD600為0.5，然后用0.5mM IPTG誘導，在20℃下生長3小時。將來自2L該發(fā)酵液的細胞重懸于75mL裂解緩沖液20mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，10mM EDTA，25mM NaCl。4℃下通過弗氏壓碎器以18,000psi將細胞破碎兩次，然后4℃下以10,000rpm離心30分鐘。將上清液級分加樣到15mL SP-Seph FF(Amersham Biosciences)上，用緩沖液A50mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，1mM EDTA，25mM NaCl平衡。用3倍柱體積的緩沖液A洗滌柱子，用20倍柱體積的從25mM-500mM NaCl的線性梯度洗脫。合并含蛋白的級分，合并含有蛋白的級分，在Amicon CentriPrep濃縮器中濃縮，加樣到用25mM Tris·HClpH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1mM DTT，1mM EDTA平衡的200mL HiPrep Sephacryl S-200(Amersham Biosciences，NJ)中。等分純蛋白，在-80℃儲存。
實施例2金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌RibF蛋白的酶測定為了測定金黃色葡萄球菌RibF，進行了體外時程實驗，并且通過高效液相色譜進行分析。在100μL的50mM磷酸鈉pH 7.0，0.002％Brij-35，1mM氯化鎂和0.5mM ATP中進行反應。在指出的時間，以200nM的終濃度加入金黃色葡萄球菌RibF，其來自按照上文制備的60μM的儲液。在指出的時間，以1mM的終濃度加入連二亞硫酸鈉(Aldrich，WI)，其來自在氮氣吹掃的水中制備的10mM的儲液。在指出的時間，以0.050mM加入核黃素，其來自在水中制備的0.10mM的儲液。在指出的時間，以0.050mM加入FMN，其來自在水中制備的0.10mM的儲液。25℃下溫育反應，在各個時間用100μL 20mMEDTA pH 8.0猝滅反應。通過高效液相色譜(HPLC)分析樣品，這是通過將25μL注射到用磷酸鈉pH 2.8平衡的季胺陰離子交換柱402.IC×250mm(Vydac，CA)上而實現(xiàn)的。通過熒光檢測(442nm激發(fā)波長，520發(fā)射)以及保留時間和面積的比較鑒定各個峰。
表1表1的數(shù)據(jù)顯示了在缺乏連二亞硫酸鈉的條件下，金黃色葡萄球菌RibF表現(xiàn)了可檢測和可測量的FK活性，但沒有表現(xiàn)可檢測和可測量的FADS活性。在存在連二亞硫酸鈉的條件下，金黃色葡萄球菌RibF表現(xiàn)了可檢測和可測量的FK和FADS活性。
為了測定肺炎鏈球菌RibF，按照上文所述進行了體外時程實驗，并且通過高效液相色譜進行分析，不同的是在指出的時間，以200nM的終濃度加入肺炎鏈球菌RibF，其來自按照上文制備的6.0μM的儲液。45分鐘時間點的數(shù)據(jù)示于表2。
表2表2的數(shù)據(jù)顯示了在缺乏連二亞硫酸鈉的條件下，肺炎鏈球菌RibF表現(xiàn)了可檢測和可測量的FK活性，但沒有表現(xiàn)可檢測和可測量的FADS活性。在存在連二亞硫酸鈉的條件下，肺炎鏈球菌RibF表現(xiàn)了可檢測和可測量的FK和FADS活性。
為了測定鼠傷寒沙門氏菌RibF，按照上文所述進行了體外時程實驗，并且通過高效液相色譜進行分析，不同的是在指出的時間，以1.3μM的終濃度加入鼠傷寒沙門氏菌RibF，其來自按照上文制備的26μM的儲液。10分鐘時間點的數(shù)據(jù)示于表3。
表3表3的數(shù)據(jù)顯示了在缺乏連二亞硫酸鈉的條件下，鼠傷寒沙門氏菌RibF沒有表現(xiàn)可檢測和可測量的FK活性，也沒有表現(xiàn)可檢測和可測量的FADS活性。在存在連二亞硫酸鈉的條件下，鼠傷寒沙門氏菌RibF表現(xiàn)了可檢測和可測量的FK和FADS活性。
實施例3制備金黃色葡萄球菌RibF的功能片段通過與海棲熱袍菌結(jié)構(gòu)比較，設計金黃色葡萄球菌黃素激酶結(jié)構(gòu)域蛋白。在Lys146和Ile147之間選擇結(jié)構(gòu)域邊界。由于預測C-末端黃素激酶結(jié)構(gòu)域蛋白開始于α-螺旋結(jié)構(gòu)域基序，改變了構(gòu)建體設計，引入兩個突變，即T150D和S151E，預測它們提供N-末端α-螺旋的穩(wěn)定性(Seale et al.，(1994)Prot.Sci.31741-1745)。
用與上文對全長金黃色葡萄球菌蛋白描述的方法相似的標準分子生物學技術(shù)制備含有編碼金黃色葡萄球菌FK結(jié)構(gòu)域的DNA的質(zhì)粒。在大腸桿菌中過量表達后，用與上文對全長金黃色葡萄球菌蛋白描述的方法相似的標準蛋白純化技術(shù)純化蛋白。
通過用上文對全長金黃色葡萄球菌FAD合成酶描述的HPLC測定檢測FMN形成，測定蛋白的FK結(jié)構(gòu)域。在100μL的50mM HEPESpH 7.5，0.002％Brij-35，10mM氯化鎂，5.0mM ATP，20μM核黃素和50nM酶中進行反應。與全長金黃色葡萄球菌FAD合成酶相比，用FK結(jié)構(gòu)域蛋白觀察到了FK活性的相似比率(表4)。
表4實施例4鑒定調(diào)節(jié)RibF活性的化合物在遞增量的化合物A存在下進行金黃色葡萄球菌RibF的測定，以測量化合物的抑制量。起始與核黃素的反應，檢測焦磷酸鹽產(chǎn)物，從而同時測定FK和FADS活性。室溫下在含有100μL的50mM HEPES pH7.5，0.002％Brij-35，1mM乙二胺四乙酸，0.1mg/mL焦磷酸酶，2％二甲亞砜，2mM氯化鎂，100μM ATP，10μM核黃素，10mM連二亞硫酸鈉，80nM金黃色葡萄球菌RibF和濃度從0.78-400μM的化合物A的96孔微量滴定板中進行反應。20分鐘后，用10μL 200mM的乙二胺四乙酸猝滅反應。2小時后，加入150μL磷酸孔雀綠檢測試劑(Lanzetta et al.(1979)Anal.Biochem.10095-97)。通過與不含化合物A的反應(無抑制)和與20mM乙二胺四乙酸的反應(完全抑制)進行比較，計算抑制百分比。如圖3所示，化合物A顯示出劑量依賴性抑制，產(chǎn)生50％抑制的濃度(IC50)是29μM。
序列表<110>Astrazeneca AB<120>測定FAD合成酶的方法<130>101371 US<150>US 60/600,667<151>2004-08-10<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>33<212>DNA<213>肺炎鏈球菌<400>1aaacgtggat cccatatgaa agtcatagaa gtg 33<210>2<211>30<212>DNA<213>肺炎鏈球菌<400>2aaacgtgaat tcctaaatat tataagctac 30<210>3<211>26<212>DNA<213>鼠傷寒沙門氏菌<400>3aaacgtcata tgattattac tattcc 26<210>4<211>29<212>DNA<213>鼠傷寒沙門氏菌<400>4
aaacgtgtcg acttaagacc aattccgag 29<210>5<211>23<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>5agctcatatg aagctgatac gcg23<210>6<211>25<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>6agctgaattc ttacacctgc ccggc 25<210>7<211>323<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>7Met Lys Val Ile Glu Val Thr His Pro Ile Gln Ser Lys Gln Tyr Ile1 5 10 15Thr Glu Asp Val Ala Met Ala Phe Gly Phe Phe Asp Gly Met His Lys20 25 30Gly His Asp Lys Val Phe Asp Ile Leu Asn Glu Ile Ala Glu Ala Arg35 40 45Ser Leu Lys Lys Ala Val Met Thr Phe Asp Pro His Pro Ser Val Val50 55 60Leu Asn Pro Lys Arg Lys Arg Thr Thr Tyr Leu Thr Pro Leu Ser Asp65 70 75 80
Lys Ile Glu Lys Ile Ser Gln His Asp Ile Asp Tyr Cys Ile Val Val85 90 95Asn Phe Ser Ser Arg Phe Ala Asn Val Ser Val Glu Asp Phe Val Glu100 105 110Asn Tyr Ile Ile Lys Asn Asn Val Lys Glu Val Ile Ala Gly Phe Asp115 120 125Phe Thr Phe Gly Lys Phe Gly Lys Gly Asn Met Thr Val Leu Gln Glu130 135 140Tyr Asp Ala Phe Asn Thr Thr Ile Val Ser Lys Gln Glu Ile Glu Asn145 150 155 160Glu Lys Ile Ser Thr Thr Ser Ile Arg Gln Asp Leu Ile Asn Gly Glu165 170 175Leu Gln Lys Ala Asn Asp Ala Leu Gly Tyr Ile Tyr Ser Ile Lys Gly180 185 190Thr Val Val Gln Gly Glu Lys Arg Gly Arg Thr Ile Gly Phe Pro Thr195 200 205Ala Asn Ile Gln Pro Ser Asp Asp Tyr Leu Leu Pro Arg Lys Gly Val210 215 220Tyr Ala Val Ser Ile Glu Ile Gly Thr Glu Asn Lys Leu Tyr Arg Gly225 230 235 240Val Ala Asn Ile Gly Val Lys Pro Thr Phe His Asp Pro Asn Lys Ala245 250 255Glu Val Val Ile Glu Val Asn Ile Phe Asp Phe Glu Asp Asn Ile Tyr260 265 270
Gly Glu Arg Val Thr Val Asn Trp His His Phe Leu Arg Pro Glu Ile275 280 285Lys Phe Asp Gly Ile Asp Pro Leu Val Lys Gln Met Ash Asp Asp Lys290 295 300Ser Arg Ala Lys Tyr Leu Leu Ala Val Asp Phe Gly Asp Glu Val Ala305 310 315 320Tyr Asn Ile<210>8<211>305<212>PRT<213>肺炎鏈球菌<400>8Met Ile Ile Thr Ile Pro Ile Lys Asn Gln Lys Asp Ile Gly Thr ProI 5 10 15Ser Asp Ser Val Val Val Leu Gly Tyr Phe Asp Gly Ile His Lys Gly20 25 30His Gln Glu Leu Phe Arg Val Ala Asn Lys Ala Ala Arg Lys Asp Leu35 40 45Leu Pro Ile Val Val Met Thr Phe Asn Glu Ser Pro Lys Ile Ala Leu50 55 60Glu Pro Tyr His Pro Asp Leu Phe Leu His Ile Leu Asn Pro Ala Glu65 70 75 80Arg Glu Arg Lys Leu Lys Arg Glu Gly Val Glu Glu Leu Tyr Leu Leu85 90 95Asp Phe Ser Ser Gln Phe Ala Ser Leu Thr Ala Gln Glu Phe Phe Ala
100 105 110Thr Tyr Ile Lys Ala Met Asn Ala Lys Ile Ile Val Ala Gly Phe Asp115 120 125Tyr Thr Phe Gly Ser Asp Lys Lys Thr Ala Glu Asp Leu Lys Asp Tyr130 135 140Phe Asp Gly Glu Val Ile Ile Val Pro Pro Val Glu Asp Glu Lys Gly145 150 155 160Lys Ile Ser Ser Thr Arg Ile Arg Gln Ala Ile Leu Asp Gly Asn Val165 170 175Lys Glu Ala Gly Lys Leu Leu Gly Ala Pro Leu Pro Ser Arg Gly Met180 185 190Val Val His Gly Asn Ala Arg Gly Arg Thr Ile Gly Tyr Pro Thr Ala195 200 205Asn Leu Val Leu Leu Asp Arg Thr Tyr Met Pro Ala Asp Gly Val Tyr210 215 220Val Val Asp Val Glu Ile Gln Arg Gln Lys Tyr Arg Ala Met Ala Ser225 230 235 240Val Gly Lys Asn Val Thr Phe Asp Gly Glu Glu Ala Arg Phe Glu Val245 250 255Asn Ile Phe Asp Phe Asn Gln Asp Ile Tyr Gly Glu Thr Val Met Val260 265 270Tyr Trp Leu Asp Arg Ile Arg Asp Met Thr Lys Phe Asp Ser Val Asp275 280 285Gln Leu Val Asp Gln Leu Lys Ala Asp Glu Glu Val Thr Arg Asn Trp
290 295 300Ser305<210>9<211>312<212>PRT<213>鼠傷寒沙門氏菌<400>9Met Lys Leu Ile Arg Gly Ile His Asn Leu Ser Gln Ala Pro His Gly1 5 10 15Cys Val Leu Thr Ile Gly Asn Phe Asp Gly Val His Arg Gly His Arg20 25 30Ala Leu Leu Gln Gly Leu Gln Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Leu Pro35 40 45Val Val Val Met Ile Phe Glu Pro Gln Pro Leu Glu Leu Phe Ala Thr50 55 60Asp Lys Ala Pro Ala Arg Leu Thr Arg Leu Arg Glu Lys Leu His Tyr65 70 75 80Leu Ala Gln Cys Gly Val Asp Tyr Val Leu Cys Val Lys Phe Asp Arg85 90 95Arg Phe Ala Ala Leu Thr Ala Gln Thr Phe Ile Ser Glu Leu Leu Val100 105 110Glu Arg Leu Gly Val Gln Phe Leu Ala Val Gly Asp Asp Phe Arg Phe115 120 125Gly Ala Ser Arg Ala Gly Asp Phe Leu Leu Leu Gln Lys Ala Gly Ala130 135 140
Glu Tyr Gly Phe Ala Val Ser Ser Thr Gln Thr Phe Cys Glu Gly Gly145 150 155 160Val Arg Ile Ser Ser Thr Ala Val Arg Gln Ala Leu Ala Glu Asp Asn165 170 175Leu Ala Leu Ala Glu Ser Leu Leu Gly His Pro Phe Thr Ile Ser Gly180 185 190Arg Val Val His Gly Asp Glu Leu Gly Arg Thr Ile Gly Phe Pro Thr195 200 205Ala Asn Leu Pro Leu Arg Arg Gln Val Ser Pro Val Lys Gly Val Tyr210 215 220Ala Val Glu Val Thr Gly Leu Gly Asp Lys Pro Leu Pro Gly Val Ala225 230 235 240Asn Ile Gly Thr Arg Pro Thr Val Ala Gly Val Arg Gln Gln Leu Glu245 250 255Val His Leu Leu Asp Val Val Met Asp Leu Tyr Gly Arg His Ile Asp260 265 270Val Ile Leu Arg Lys Lys Ile Arg Asn Glu Gln Arg Phe Ala Ser Leu275 280 285Asp Glu Leu Lys Ala Gln Ile Ala Arg Asp Glu Leu Thr Ala Arg Lys290 295 300Phe Phe Gly Leu Ala Gly Gln Val305 310
權(quán)利要求
1.確定細菌黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的方法，該方法包括使選自葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌的細菌FAD合成酶或其功能片段與細菌FAD合成酶的還原的底物接觸；并且確定細菌FAD合成酶的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述鏈球菌是肺炎鏈球菌。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述還原的底物是FMN或FAD。
6.確定細菌黃素激酶(FK)活性的方法，該方法包括使沙門氏菌的細菌FK或其功能片段與還原的核黃素接觸；并且確定細菌FK的活性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
8.鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法，該方法包括使選自葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌的細菌FAD合成酶或其功能片段與細菌FAD合成酶的還原的底物和測試化合物接觸；并且確定細菌FAD合成酶的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FAD合成酶活性。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述鏈球菌是肺炎鏈球菌。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述還原的底物是FMN或FAD。
13.鑒定能夠調(diào)節(jié)細菌黃素激酶的化合物的方法，該方法包括使沙門氏菌的細菌FK或其功能片段與還原的核黃素和測試化合物接觸；并且確定細菌FK的活性，其中與對照相比，化合物存在下活性的增加或減少表明該化合物調(diào)節(jié)FK活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的方法，和鑒定調(diào)節(jié)該酶活性的化合物的方法。
文檔編號C12N9/12GK1993478SQ200580025630
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月30日
發(fā)明者D·埃曼 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司