專利名稱：用dna文庫轉(zhuǎn)化和表達篩選絲狀真菌細胞的方法
在聯(lián)邦政府資助的研究和開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利的聲明。
本發(fā)明是在能源部門授予NREL轉(zhuǎn)包合同(subcontract)No.ZCO-30017-02，主要合同(prime contract)DE-AC36-98GO10337的條件下通過政府的支持作出的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及表達篩選用DNA文庫轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細胞的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)常依賴于使用重組的表達宿主細胞。在大規(guī)模生產(chǎn)之前，針對選擇和/或改進目的蛋白質(zhì)的研究和開發(fā)也涉及使用這種重組宿主細胞。篩選工程，例如篩選具體基因的突變體編碼的蛋白質(zhì)變體，或從基因組或cDNA文庫中篩選基因庫經(jīng)常局限于絲狀真菌以外的宿主。使用最頻繁的宿主是非常適合于篩選所需要的高通量方法的酵母和細菌。典型地，將幾千到幾十萬多核苷酸片段轉(zhuǎn)化到宿主中，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化體，并篩選培養(yǎng)物以鑒定目的蛋白質(zhì)。其目標經(jīng)常是鑒定或設(shè)計具有改進的特性的蛋白質(zhì)，例如，具有改變的隨溫度而變的活性譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。
但是，利用細菌和酵母宿主進行表達篩選涉及許多限制；在有些情況下，重組蛋白質(zhì)以非活性構(gòu)象存在，而在其它情況下，該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的或者不是簡單地在第一位置合成。來源于哺乳動物來源的目的蛋白質(zhì)在這些宿主中的表達常常很貧乏，因為表達的蛋白質(zhì)以非活性構(gòu)象存在，或者根本不表達該蛋白質(zhì)。通常，來源于真核生物的蛋白質(zhì)在原核生物系統(tǒng)中表達貧乏。在這些生物體中的重組蛋白質(zhì)的二級修飾可能完全不同于發(fā)生在天然宿主中的修飾。在細菌中表達的來自真核生物的蛋白質(zhì)不能被正確糖基化，因為這種修飾發(fā)生在分泌路徑中，而細菌中不存在分泌路徑。最經(jīng)常使用的酵母菌株—釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)常常會過度糖基化蛋白質(zhì)，這會導(dǎo)致非活性蛋白質(zhì)的表達，其中非活性蛋白質(zhì)是與蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)相比較而言的。
使用細菌或酵母宿主進行酶篩選的另一個復(fù)雜因素是篩選宿主通常不同于工業(yè)上最后生產(chǎn)使用的宿主。而轉(zhuǎn)換宿主時會涉及重要的時間和技術(shù)考慮。即使酶在兩種宿主中都能成功表達，當從篩選轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)時，仍然必須再加工設(shè)計表達構(gòu)建體。更重要地，通過影響宿主特異方式中的折疊和/或修飾，可以使那些已經(jīng)經(jīng)受定向進化的蛋白質(zhì)，即經(jīng)受隨機誘變、重組和通過多代篩選選擇出有改進特性的蛋白質(zhì)進化發(fā)展以獲得篩選宿主特異的改進特性。
酶篩選的另一個考慮是表達蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。細菌常常產(chǎn)生很高產(chǎn)量的重組原核生物蛋白質(zhì)，但當真核蛋白質(zhì)在原核生物中表達時，經(jīng)常觀察到產(chǎn)量很低的可溶性活性蛋白質(zhì)。酵母宿主通常不能支持高水平的重組蛋白質(zhì)表達。篩選期間的生物活性測定必須對檢測極低水平的蛋白質(zhì)足夠敏感。檢測常常是不可能的，特別是當目的蛋白質(zhì)具有較弱的比活性(specificactivity)更是如此。而且，以足夠水平表達蛋白質(zhì)常常是有利的，因為這樣對蛋白質(zhì)活性的檢測可以很容易地與宿主菌株內(nèi)的低水平的內(nèi)源競爭性生物活性區(qū)別開。這些分析解釋了經(jīng)常選擇絲狀真菌宿主來生產(chǎn)真核基因的原因，因為這些生物體常常能支持高水平的蛋白質(zhì)的表達。通常使用的酵母和細菌宿主中獲取的產(chǎn)量低經(jīng)常會削弱篩選。
絲狀真菌宿主具有與細菌和酵母宿主相比明顯的優(yōu)點，由于真菌形態(tài)特征而使絲狀真菌培養(yǎng)物的高通量表達篩選復(fù)雜化(complicated)。例如菌絲傾向于阻塞液體處理機(handlers)的移液管尖端，菌絲叢使它難以進入培養(yǎng)物的液相，將單個絲狀真菌轉(zhuǎn)化體自動挑取和接種到瓊脂平板上不象挑取和接種酵母和細菌集落那樣常規(guī)。
當篩選新的或改進的特性時，產(chǎn)生表達單一類型多肽的轉(zhuǎn)化體是合乎需要的。單一類型多肽的表達允許檢測蛋白質(zhì)性能的小變化。與此相反，對共表達一種以上單一類型多肽的轉(zhuǎn)化生物體進行的工作在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，因為篩選的敏感性必須足以檢測存在于具有不同特性的蛋白質(zhì)背景中的蛋白質(zhì)的獨特特性。具有單一類型多核苷酸片段被引入每個單一轉(zhuǎn)化體的表達篩選宿主通常是一個優(yōu)點。
將單一類型多核苷酸引入細菌或酵母的過程為本領(lǐng)域所熟知。在細菌中，質(zhì)粒復(fù)制子可用于防止兩個不同的質(zhì)粒在相同的細菌細胞中共存(Davidson，1984 Gene 281-15)。被篩選的庫經(jīng)常包含異源質(zhì)粒群體，每個群體包含能被轉(zhuǎn)化到細菌或酵母感受態(tài)細胞池(pool)中的相同復(fù)制子。當包含外來基因的質(zhì)粒被引入細菌細胞時，該群體的隨后生長會導(dǎo)致質(zhì)粒分離，因此每個細胞僅包含單一類型質(zhì)粒。在經(jīng)過幾代細菌繁殖過程后，少數(shù)質(zhì)粒被完全消除，原始細胞的后代包含一個質(zhì)?；蛄硪粋€質(zhì)粒，而不是包含兩個質(zhì)粒。因此攜帶相同復(fù)制子的質(zhì)粒據(jù)說屬于相同的不相容組(Datta，1979，in Plasmids of Medical，Environmental，and Commercial Importance，Timmis and Puhler，eds.Elsevier，Amsterdam)。
因此用異源質(zhì)粒群體庫轉(zhuǎn)化細菌導(dǎo)致限制每個轉(zhuǎn)化體包含單一類型質(zhì)粒。另一方面，當用包含質(zhì)粒異源群體的DNA文庫轉(zhuǎn)化時，將單一種類多核苷酸插入到絲狀真菌表達宿主中的過程不是如此簡單。當通過引入外來多核苷酸序列從遺傳上加工設(shè)計絲狀真菌菌株時，通常會使用兩種不同類型的方法。一個方法允許將DNA整合到真菌宿主染色體中。通常引入一個以上的單一多核苷酸片段(Alesenko，1994，Curr Genet 26352-358)。另一個導(dǎo)入外來DNA的方式是使用自主復(fù)制質(zhì)粒。在兩種轉(zhuǎn)化中，單一宿主包含一個以上來自用于轉(zhuǎn)化的庫的不同多核苷酸片段是可能的。絲狀真菌經(jīng)常是多細胞和多核的。為了嘗試分離被引入個體宿主中的獨特的多核苷酸片段而利用孢子純化在本領(lǐng)域是很常見的。但這一過程耗時，而且難以自動化，因為集落挑取自動機不容易挑取接種到液體培養(yǎng)基或再排列進行固相培養(yǎng)的絲狀真菌集落。
限制遺傳物質(zhì)使個體轉(zhuǎn)化體僅包含單一種類多核苷酸片段可能是篩選絲狀真菌表達庫領(lǐng)域的優(yōu)點。特別地，有可利用的高通量轉(zhuǎn)化絲狀真菌的方法可能是有利的，因為這樣表達比較高，可以快速和容易地從篩選鑒定出的那些轉(zhuǎn)化體回收基因。
除來自DNA文庫的個體DNA片段在個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體中表達賦予的優(yōu)點外，具有從篩選鑒定的轉(zhuǎn)化體中回收外來多核苷酸的容易方法也是有利的。典型地，DNA拯救方法用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體(例如包含AMA1和ANS1的載體)，其中從轉(zhuǎn)化體中制備DNA制備物(preparation)，然后用制備物轉(zhuǎn)化大腸桿菌以制備用于序列分析的適量質(zhì)粒。為了回收DNA已經(jīng)整合到宿主染色體中的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體中的轉(zhuǎn)化DNA，利用PCR擴增外源基因和從轉(zhuǎn)化體制備基因組DNA是通常使用的方法?；蛘呖梢栽谥亟M基因被表達的條件下從轉(zhuǎn)化體制備RNA，并從來源于RNA的核酸擴增外來多核苷酸。所有這些核苷酸回收方法的共同特征是他們都是耗時的步驟。具有快速和容易的從分離的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體回收核苷酸材料的步驟將是有利的，其中分離的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體來源于庫表達篩選。
WO 00/24883公開了利用AMA質(zhì)粒在絲狀真菌細胞中構(gòu)建和篩選cDNA文庫的一般方法。
Lamsa and Bloebaum，1990，J.Ind.Microbiol.5229-238描述了高通量篩選絲狀真菌培養(yǎng)物的例子。
提供單孔轉(zhuǎn)化(single-well transformation)和表達篩選的方法是本發(fā)明的目標。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及表達篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)分離被引入大腸桿菌的DNA文庫的單一集落轉(zhuǎn)化體；(b)從每個單一集落的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備DNA；(c)將步驟(b)制備的每一個DNA制備物導(dǎo)入到分離的絲狀真菌原生質(zhì)體懸浮液中以獲取絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，其中每個轉(zhuǎn)化體包含來源于DNA文庫的個體多核苷酸(individual polynucleotide)的一個或多個拷貝；(d)在選擇性生長培養(yǎng)基上生長步驟(c)的個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基允許絲狀真菌轉(zhuǎn)化體生長，同時抑制未轉(zhuǎn)化絲狀真菌的生長；和(e)測量個體多核苷酸編碼的每個多肽的活性或特性。
在優(yōu)選方案中，通過收集在步驟(b)中制備的已經(jīng)存檔和儲存的對應(yīng)DNA可以完成從篩選鑒定的轉(zhuǎn)化體中回收編碼目的多肽的多核苷酸的過程。
在另一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明的方法是手工完成的。在更優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的方法是自動化的高通量表達篩選方法。
在另一個優(yōu)選方案中，DNA文庫是其中突變基因編碼多肽變體的基因突變體庫。
在另一個優(yōu)選方案中，該方法更進一步地包括從一個或多個個體大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分離來源于DNA文庫的多核苷酸，其中多核苷酸編碼目的多肽。
在另一個優(yōu)選方案中，該方法更進一步地包括從一個或多個個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體分離來源于DNA文庫的多核苷酸，其中多核苷酸編碼目的多肽。
本發(fā)明也涉及通過這種方法獲取的編碼目的多肽的分離的多核苷酸、核酸構(gòu)建體、表達載體，包含該分離的多核苷酸的重組宿主細胞、以及產(chǎn)生分離的多核苷酸編碼的多肽的方法。
附圖簡述

圖1顯示pAlLo1的限制性酶切圖譜。
圖2顯示pBANe10的限制性酶切圖譜。
圖3顯示pAlLo2的限制性酶切圖譜。
圖4顯示pCW026的限制性酶切圖譜。
圖5顯示pENI2229的限制性酶切圖譜。
圖6顯示pCW013的限制性酶切圖譜。
定義表達篩選術(shù)語″表達篩選″定義為在選擇的宿主中表達DNA文庫的DNA片段編碼的多肽和測定表達多肽的特性。該方法必然伴有轉(zhuǎn)化適當表達載體中的庫片段到選擇的表達宿主中，以便從開放閱讀框架自己的啟動子或者從克隆載體中的啟動子轉(zhuǎn)錄DNA文庫的開放閱讀框。
突變體術(shù)語″突變體″在這里限定為編碼包含一個或多個改變，例如與親代多肽相比在一個或多個特殊位置存在一個或多個具體氨基酸殘基取代、插入、缺失和/或截斷的多肽的突變的多核苷酸。
變體術(shù)語″變體″在這里限定為包含一個或多個改變，例如在多肽的一個或多個特殊位置存在一個或多個特異的氨基酸殘基取代、插入、缺失、融合和/或截斷的(truncation)多肽。
野生型多肽術(shù)語″野生型多肽″表示天然存在的微生物表達的多肽。
親代多肽這里使用的術(shù)語″親代多肽″指進行一種或多種修飾，例如替換、插入、缺失和/或截斷用來產(chǎn)生多肽變體的多肽。該術(shù)語也指用來比較和排列對比的變體的多肽。親代多肽可以是天然存在(野生型)的多肽，或者親代蛋白質(zhì)可以是通過任何合適的方法制備的氨基酸序列已經(jīng)被修飾或改變的天然存在多肽的變體。親代多肽也可能是占據(jù)相同染色體位點的兩個或更多個可選擇的基因形式中的任何一個編碼的多肽的等位變體。
修飾術(shù)語″修飾″在這里指多肽的任何化學(xué)修飾以及DNA的遺傳操縱。修飾可以是一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側(cè)鏈的替換。
選擇性培養(yǎng)基術(shù)語″選擇性培養(yǎng)基″在這里限定為允許轉(zhuǎn)化的微生物生長，但不允許未轉(zhuǎn)化細胞生長的包含營養(yǎng)素的液體或固體混合物?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)基中包含對未轉(zhuǎn)化生物體有毒的物質(zhì)來實現(xiàn)選擇，這樣當包含選擇性標記的表達載體存在于轉(zhuǎn)化的微生物中時，標記表達會使毒素解毒或者會提供對毒素的抗性。還可以通過利用在缺乏補充營養(yǎng)素時不能生長的微生物來實現(xiàn)選擇。例如讓營養(yǎng)突變體經(jīng)受轉(zhuǎn)化，通過在缺乏需要的代謝物的條件下進行篩選來提供選擇，其中需要的代謝物只能由包含表達載體序列的菌株合成，表達載體序列提供了合成代謝物需要的多核苷酸序列。
改組(shuffling)術(shù)語″改組″指在兩個或多個同源多核苷酸之間重組至少一個核苷酸序列產(chǎn)生與多核苷酸的起始核苷酸序列相比，具有許多被交換的核苷酸的重組核苷酸序列(即已經(jīng)經(jīng)受混合周期的核苷酸序列)。
DNA文庫術(shù)語″DNA文庫″在這里限定為包含來自單一基因組、兩個或更多基因組、突變DNA、改組DNA等等的插入物(DNA片段)的重組表達載體或質(zhì)粒的集合。載體可以是線性質(zhì)粒或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。插入DNA的來源可以是基因組、cDNA、半合成來源，合成來源或他們的任何組合。
隨機化的庫或變體庫術(shù)語″隨機化的庫″或″變體庫″在這里限定突變多核苷酸的庫。通過在DNA三聯(lián)水平誘變編碼變體的基因可以在變體庫中產(chǎn)生多樣性，這樣可以使個體密碼子多樣化，例如通過在PCR反應(yīng)中使用序列部分隨機化的引物可以實現(xiàn)這一點。已經(jīng)描述幾種技術(shù)，利用這些技術(shù)通過使基因中的幾個核苷酸位置多樣化，以及當這些位置分隔太遠以至于不能被單個(spiked或doped)寡核苷酸引物覆蓋時對他們進行重組可以產(chǎn)生變化多的組合庫?！錝piked誘變″是定位誘變的一種形式，其中已經(jīng)在一個或多個位置利用寡核苷酸混合物合成使用的引物。這些技術(shù)包括使用如WO 97/07205中描述的單個多樣化基因片段的體內(nèi)重組。也包括使用DNA改組技術(shù)產(chǎn)生全長基因庫，其中組合幾個基因片段，每個片段可以通過例如spiked誘變多樣化(Stemmer，1994，Nature 370389-391；美國專利No.5,811,238；美國專利5,605,793和美國專利No.5,830,721)?？梢詤⒄誛O98/41623和WO 98/41622中的描述使用編碼蛋白質(zhì)″骨架(野生型親代多肽)″的基因作為模板多核苷酸，并將該基因與一個或多個單鏈或雙鏈寡核苷酸組合。在合成期間可以部分隨機化單鏈寡核苷酸。雙鏈寡核苷酸可以是在特定區(qū)域摻入了多樣性的PCR產(chǎn)物。在兩種情況下，為了限制導(dǎo)入的變化的平均數(shù)，可以用編碼骨架蛋白質(zhì)序列的對應(yīng)片段沖淡多樣性。
重組術(shù)語″重組″在這里限定為將核酸在同源區(qū)彼此聯(lián)合，導(dǎo)致在那些序列之間產(chǎn)生鏈間DNA交換的過程。對本發(fā)明來說，依照Paques and Haber，1999，Microbiology and Molecular Biology Reviews 63349-404概括的方法來確定同源重組。″同源重組″在這里限定為相對于輸入的核苷酸序列，在同源區(qū)內(nèi)核苷酸序列沒有發(fā)生變化的重組。為了進行完全的同源重組，區(qū)域應(yīng)該包含足夠數(shù)量的核苷酸，例如15-10,000個堿基對，優(yōu)選100-10,000個堿基對，更優(yōu)選400-10,000個堿基對，最優(yōu)選800-10,000個堿基對，其中核苷酸與對應(yīng)的核苷酸序列高度同源以增加同源重組的概率。也可以通過非同源重組進行重組?！宸峭粗亟M″在這里限定為DNA修復(fù)摻入的鏈交換的任何方式會導(dǎo)致核苷酸序列不同于任何重組序列的重組。
改進的特性術(shù)語″改進的特性″在這里限定為與親代多肽，例如酶相比，與變體多肽相關(guān)聯(lián)的被改進的特性。這種改進的特性包括，但不限于改變的隨溫度而變的活性譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性。
改進的熱活性術(shù)語″改進的熱活性″在這里限定為相對于親代多肽的隨溫度而變的活性譜，具有生物活性的變體多肽，例如，酶在特定溫度顯示出改變的隨溫度而變的活性譜。例如對于酶，在超過一定的溫度范圍內(nèi)實施催化反應(yīng)，例如水解時，熱活性值提供了對酶效力的測量。酶具有特定的溫度范圍，在該溫度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，而且保留了酶活性，但是增加溫度酶的穩(wěn)定性和活性都會降低。而且，通過增加溫度可以加快酶催化反應(yīng)的初始速率，其中通過確定變體的熱活性來測定溫度。熱活性更高的變體將導(dǎo)致反應(yīng)速度增加，會降低需要的時間和/或需要的酶濃度。換句話說，具有降低的熱活性的變體催化反應(yīng)的溫度低于親代酶的最適溫度，其中最適溫度是通過親代酶的隨溫度依賴性的活性譜來定義的。
改進的熱穩(wěn)定性術(shù)語″改進的熱穩(wěn)定性″在這里限定為相對于親代多肽，在升高的溫度下孵育一段間之后，具有生物活性的變體多肽顯示出保留的生物活性。相對于親代，這種變體可能顯示或不顯示改變的熱活性譜，例如相對于親代，在高溫孵育后它可能具有改進的再折疊能力。
改進的產(chǎn)物特異性術(shù)語″改進的產(chǎn)物特異性″在這里限定為相對于親代多肽，具有生物活性的變體多肽顯示出改變的產(chǎn)物譜，其中相對于親代，改變的產(chǎn)物譜改進了變體在某個應(yīng)用中的性能。術(shù)語″產(chǎn)物譜″在這里限定為由生物活性，例如酶活性產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)成分(composition)。
改進的化學(xué)穩(wěn)定性術(shù)語″改進的化學(xué)穩(wěn)定性″在這里限定為存在化學(xué)制劑時，天然發(fā)生的或合成的變體多肽孵育一段時間之后仍顯示保留生物活性，其中化學(xué)制劑會降低親代多肽的生物活性。在存在這種化學(xué)制劑時，改進的化學(xué)穩(wěn)定性也可以產(chǎn)生能更好地完成他們的生物活性，例如催化酶反應(yīng)的變體。
分離的多肽這里使用的術(shù)語″分離的多肽″指通過SDS-PAGE確定時，純度為至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，甚至更加優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％的多肽。
基本上純的多肽術(shù)語″基本上純的多肽″在這里表示多肽制備物，其按重量計算包含最多10％、優(yōu)選最多8％、更優(yōu)選最多6％、更優(yōu)選最多5％、更優(yōu)選最多4％、更優(yōu)選最多3％、更加優(yōu)選最多2％、最優(yōu)選最多1％，甚至最優(yōu)選最多0.5％的與多肽天然聯(lián)合的(associated)其他多肽原料。因此基本上純的多肽優(yōu)選是按照制備物中存在的總多肽物質(zhì)重量計，純度為至少92％，優(yōu)選至少94％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少97％，更優(yōu)選至少98％、甚至更加優(yōu)選至少99％，最優(yōu)選至少99.5％，甚至最優(yōu)選100％的多肽。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。特別優(yōu)選″基本上純的形式″(essentially pure form)的多肽，即基本上不含與多肽天然聯(lián)合的其他多肽原料的多肽標本。例如，通過利用眾所周知的重組方法或典型的提純法制備多肽可以實現(xiàn)這一目的。
在這里，術(shù)語″基本上純的多肽″與術(shù)語″分離的多肽″和″分離形式的多肽″同義。
多肽片段術(shù)語″多肽片段″在這里限定為具有一個或多個從多肽的氨基和/或羧基末端被缺失的氨基酸的多肽，其中該片段保留有生物活性。
分離的多核苷酸這里使用的術(shù)語″分離的多核苷酸″指通過瓊脂糖電泳確定時，純度為至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，甚至更加優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％的多核苷酸。
基本上純的多核苷酸在這里使用的術(shù)語″基本上純的多核苷酸″指不含其他外來核苷酸或不需要的核苷酸，以適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式存在的多核苷酸制備物。因此，基本上純的多核苷酸按重量計算包含最多10％、優(yōu)選最多8％、更優(yōu)選最多6％、更優(yōu)選最多5％、更優(yōu)選最多4％、更優(yōu)選最多3％、更加優(yōu)選最多2％、最優(yōu)選表最多1％，甚至最優(yōu)選最多0.5％的與多核苷酸天然聯(lián)合的其他多核苷酸原料。但是，基本上純的多核苷酸可以包括天然發(fā)生的5′和3′非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子?；旧霞兊亩嗪塑账醿?yōu)選是按重量計純度為至少90％，優(yōu)選為至少92％，更優(yōu)選至少94％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少97％，更加優(yōu)選至少98％、最優(yōu)選至少99％，甚至最優(yōu)選至少99.5％的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是基本上純的形式。特別優(yōu)選在這里公開的多核苷酸是″基本上純的形式″，即基本上不含與多核苷酸天然聯(lián)合的其他多核苷酸原料的多核苷酸制備物。在這里，術(shù)語″基本上純的多核苷酸″與術(shù)語″分離的多核苷酸″和″分離形式的多核苷酸″同義。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成來源，合成來源或他們的任何組合。
子序列術(shù)語″子序列″在這里限定為具有一個或多個從分離的多核苷酸的5′和/或3′末端被缺失的核苷酸的核苷酸序列，其中子序列編碼具有生物活性的多肽片段。
cDNA術(shù)語″cDNA″在這里限定為可以從獲自真核細胞的成熟的經(jīng)過拼接的mRNA分子反轉(zhuǎn)錄制備的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。初始的基本RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是在表現(xiàn)為成熟的拼接mRNA之前經(jīng)過一系列步驟處理的mRNA前體。這些步驟包括通過稱為拼接的過程除去內(nèi)含子序列。因此來源于mRNA的cDNA缺乏任何內(nèi)含子序列。
核酸構(gòu)建體這里使用的術(shù)語″核酸構(gòu)建體″指分離自天然發(fā)生基因或以不存在于自然界的方式修飾的包含核酸片段的單鏈或雙鏈核酸分子。當核酸構(gòu)建體包含表達本發(fā)明的編碼序列需要的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語″表達盒″同義。
控制序列術(shù)語″控制序列″在這里限定為包括表達編碼目的多肽的多核苷酸必需的或?qū)Ρ磉_有利的所有組件。每個控制序列可能是編碼多肽的核苷酸序列與生俱來的或與編碼多肽的核苷酸序列異源，或者每個控制序列彼此之間是與生俱來的或異源的。這種控制序列包括，但不局限于前導(dǎo)序列，多腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。控制序列至少包括啟動子，轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢杂媒宇^來提供控制序列，這樣可以導(dǎo)入有助于將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)連接的特異的限制性內(nèi)切位點。
操作性連接術(shù)語″操作性連接″在這里表示控制序列位于多核苷酸序列的編碼序列的相對適當?shù)奈恢檬箍刂菩蛄兄笇?dǎo)多肽編碼序列表達的構(gòu)型。
編碼序列在這里使用的術(shù)語″編碼序列″指直接規(guī)定它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。通常通過開放閱讀框確定編碼序列的界線，通常開始于ATG起始密碼子或選擇的起始密碼子，例如GTG和TTG，終止于終止密碼子，例如TAA、TAG和TGA。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。
表達術(shù)語″表達″包括涉及多肽生產(chǎn)的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
表達載體/質(zhì)粒術(shù)語″表達載體″或″表達質(zhì)?！逶谶@里限定為包含編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的線性或環(huán)狀DNA分子，其中多核苷酸操作性地與供其表達的附加核苷酸連接。
宿主細胞這里使用的術(shù)語″宿主細胞″包括對包含編碼目的多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等等敏感的任何細胞類型。
轉(zhuǎn)化體在這里使用的″轉(zhuǎn)化體″指通過引入多核苷酸片段，已經(jīng)被遺傳修飾的微生物。導(dǎo)入DNA的過程，例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等等產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體可以伴有來源于宿主以外的不同生物體的DNA，或者可以伴有使用來源于相同物種的DNA。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及表達篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)分離被引入大腸桿菌的DNA文庫的單一集落轉(zhuǎn)化體；(b)從每個單一集落的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備DNA；(c)將步驟(b)制備的每一個DNA樣品導(dǎo)入到分離的絲狀真菌原生質(zhì)體懸浮液中以獲取絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，其中每個轉(zhuǎn)化體包含來源于DNA文庫的個體多核苷酸的一個或多個拷貝；(d)在選擇性生長培養(yǎng)基上生長步驟(c)的個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基允許絲狀真菌轉(zhuǎn)化體生長，同時抑制未轉(zhuǎn)化絲狀真菌的生長；和(e)測量個體多核苷酸編碼的每個多肽的活性或特性。
本發(fā)明允許回收在篩選中鑒定的那些表達具有想要的活性或特性的多肽的轉(zhuǎn)化體中的DNA原料?；蛘咭部梢岳脕碜圆襟E(b)的存檔DNA樣品來代替設(shè)法從大腸桿菌或絲狀真菌轉(zhuǎn)化體回收、擴增或拯救外源基因。一個人可以簡單地確定哪一個個體DNA制備物被用來產(chǎn)生特定的轉(zhuǎn)化體，而且可以取回在原有轉(zhuǎn)化中使用的已經(jīng)儲存存檔的DNA的一部分。
可以手動或通過自動化來實施本發(fā)明的方法中的步驟。為了進行高通量表達篩選，優(yōu)選將本發(fā)明的方法自動化。在一個優(yōu)選方案中，一個或多個步驟被自動化。在更優(yōu)選的方案中，每個步驟都被自動化。
在實驗室中使用自動機及其他自動化裝置在本領(lǐng)域中很常見，而且經(jīng)常用他們來操作細菌和酵母培養(yǎng)物(Reichman et al.，1996，Lab.Robot.andAutomat.8267-276；Olsen et al.，2000，Curr.Opin.Biotech.11；331-337；Zhao and Arnold，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7480-485；Berg et al.，2000，J.of Biomolecular Screening，571-76；Evans et al.，2002，J.of BiomolecularScreening，7359-366；Cherry et al.，1999，Nature Biotechnol.17379-384)。但是使用自動機操作活的絲狀真菌是很少見(Arhoun，et al.，1999，Lab Robotand Automat 11121-126)。本發(fā)明優(yōu)選使用多孔板(也稱為微量滴定板)來操作微生物、DNA、多肽及其他分子。但是，商業(yè)系統(tǒng)通?？梢杂糜诓僮髋c標準96孔板具有相同足跡的任何孔板結(jié)構(gòu)；12.8厘米×8.6厘米。大多數(shù)系統(tǒng)允許用戶在這些尺寸內(nèi)裝配定制的板。幾乎可以使用在特殊自動機上能夠固定在支架的一些入口中的任何風(fēng)格的標準塑料管或玻璃管。多數(shù)情況下，管支架是標準的微量滴定板足跡。實際上，一些系統(tǒng)具有他們自己的支架以適合寬的試管陣列。通常使用的自動機包括三個基本類型。一種自動機用來從固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物中挑取微生物，并將這些具體的生物體轉(zhuǎn)移到液相生長培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中。另一種自動機是液體操作自動機，可以將液體從一處移動到另一處，例如從試管移動到多孔板。第三種自動機移動消耗物品，例如試劑容器、多孔板或移液管尖端。其他的自動化裝置可以適合這些類別中的一種以上類別，或者可以超出這些一般分類法的范圍。
DNA文庫用于DNA文庫的載體/質(zhì)粒DNA文庫為包含來自單一基因組、兩個或更多基因組、突變DNA、改組DNA等等的插入物(DNA片段)的重組表達載體的集合。插入DNA的來源可以是基因組、cDNA、半合成來源，合成來源或他們的任何組合。
每個插入物包含編碼具有生物活性的目的多肽或其保留生物活性的片段的核苷酸序列。
多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。多肽可以是篩選中使用的絲狀真菌細胞與生俱來的多肽，或者是與絲狀真菌細胞異源的多肽。而且，多肽可以是親代多肽的變體。術(shù)語″多肽″在這里并不涉及編碼產(chǎn)物的具體長度，因此它包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語″多肽″也包括多肽的天然發(fā)生的等位基因變體或經(jīng)過設(shè)計的變體。
在優(yōu)選方案中，多肽是抗體、抗原、抗菌肽、酶、生長因子、激素、免疫增強劑(immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)運蛋白體(transporter)。
在更優(yōu)選的方案中，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。在更優(yōu)選的方案中，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果膠分解酶(pectinolyticenzyme)、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶(xylanase)。
在另一個更優(yōu)選的方式中，多肽是膠原或明膠。
使用的載體可以是能經(jīng)受連接或?qū)氩迦胛锏闹亟MDNA過程的任何質(zhì)粒(或載體)。質(zhì)粒應(yīng)該是在大腸桿菌中能夠維持和復(fù)制，因此能夠用來轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主的穿梭質(zhì)粒。
在優(yōu)選方案中，質(zhì)粒庫優(yōu)選包含允許質(zhì)粒在細胞中不依賴基因組自主復(fù)制或者允許將載體整合到宿主細胞基因組中的元件。
為了自主復(fù)制，質(zhì)?？梢愿M一步地包含使質(zhì)粒能夠在正研究的宿主細胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細胞中起作用，調(diào)節(jié)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制基因(replicator)。術(shù)語″復(fù)制起點″或″質(zhì)粒復(fù)制基因″在這里限定為使質(zhì)粒能夠在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。
質(zhì)粒復(fù)制基因可以是在細胞中起作用，調(diào)節(jié)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制基因。細菌復(fù)制起點的例子有允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點。在絲狀真菌細胞有用的質(zhì)粒復(fù)制基因的例子有AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 9861-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 159163-9175；WO 00/24883)。依照WO 00/24883中公開的方法可以實現(xiàn)分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體。
為了整合到宿主細胞基因組中，質(zhì)?？梢砸揽烤幋a多肽的多核苷酸序列或質(zhì)粒的任何其他元件通過同源重組或非同源重組整合到基因組中。換句話說，質(zhì)?？梢园笇?dǎo)通過同源重組在染色體的精確位置整合到宿主細胞的基因組中的附加核苷酸序列。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選包含足夠數(shù)量的核酸，例如100-10,000個堿基對，優(yōu)選400-10,000個堿基對，最優(yōu)選800-10,000個堿基對，其中核酸與對應(yīng)的目標序列具有高度的同一性以增加同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的目標序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將質(zhì)粒整合到宿主細胞的基因組中。因為可以將基因的多個拷貝整合到染色體中，因此通過提高基因拷貝數(shù)可以促進高水平表達。本發(fā)明的一個優(yōu)點是將外來插入物整合到細絲狀宿主中時，可以確信只有單一類型的插入物被插入。
在一些情況下，質(zhì)粒的線性化可以提高整合到真菌染色體中的頻率。質(zhì)粒的線性化可以針對質(zhì)粒內(nèi)的任何位點。通過本領(lǐng)域已知的任何適當?shù)姆椒ǎ缬靡环N或多種限制性內(nèi)切酶消化可以使質(zhì)粒線性化。
為了促進篩選過程，優(yōu)選其中插入物操作性地與一個或多個控制序列連接的質(zhì)粒表達載體，其中控制序列指導(dǎo)插入物中的編碼序列在控制序列相容的條件下在適當?shù)慕z狀真菌宿主細胞中表達。在這里描述了細菌和真菌的控制序列。
質(zhì)粒優(yōu)選包含這里描述的一個或多個允許容易選擇轉(zhuǎn)化細胞的可選擇標記。
通常，表達載體源自于質(zhì)粒、粘?；蚴删w，或者可以包含這些元件中的任何元件或全部元件。對本發(fā)明來說，術(shù)語″質(zhì)粒″和″載體″可交換使用。
庫的DNA片段來源可以通過許多方法制備包含在庫質(zhì)粒內(nèi)的DNA片段(或插入物)。例如，可以依照美國專利No.4,683,202或Saiki et al.，1988，Science 239487-491中的描述，利用具體的引物通過PCR擴增制備DNA片段?；蛘呖梢酝ㄟ^已經(jīng)確定的標準方法，例如Beaucage and Caruthers，1981，TetrahedronLetters 221859-1869描述的亞磷酰胺法(phosphoamidite)，或者Matthes et al.，(1984)，EMBO Journal 3801-805描述的方法來合成制備庫DNA片段。
DNA片段也可以是依照標準技術(shù)，通過連接合成的片段、基因組來源的片段或者cDNA來源的片段、相當于全部核苷酸序列的各個部分的片段而制備的合成片段和基因組來源片段的混合物、合成片段和cDNA來源片段的混合物或基因組來源片段和cDNA來源片段的混合物。而且，通過PCR擴增包括DNA、cDNA和RNA的核酸并利用本領(lǐng)域已知的標準方法分離可以制備DNA片段。例如利用標準方法，可以從分離自生物體細胞的總多腺苷酸化mRNA獲取cDNA探針，并將他們反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。
可以從任何生物體中獲取DNA文庫，包括但不限于微生物、植物和哺乳動物。對本發(fā)明來說，這里使用的與約定的來源有關(guān)的術(shù)語″從…處獲得″(obtained from)指通過該來源或已經(jīng)插入該來源的多核苷酸序列的菌株產(chǎn)生的多核苷酸序列。
在優(yōu)選方案中，DNA文庫是從細菌，例如革蘭氏陽性細菌中獲得的。
在更優(yōu)選方案中，DNA文庫是從芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)或大腸桿菌菌株中獲得的。
在最優(yōu)選的方案中，DNA文庫是從嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽胞桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、Streptomyces lividans或Streptomyces murinus中獲得的。
在另一個優(yōu)選方案中，DNA文庫是從酵母，例如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Saccharomyces)或Yarrowia菌株；或者絲狀真菌，例如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、Talaromyces、嗜熱子囊菌(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)菌株中獲得的；在更優(yōu)選的的方案中，DNA文庫是從卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis中獲得的。
在另一個更優(yōu)選的的方案中，DNA文庫從棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、桿孢狀鏈孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、Fusarium graminum、異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)、Fusarium negundi、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)中獲得的。
應(yīng)理解無論物種已知的種類名稱是什么，本發(fā)明都既包括上述物種的完美狀態(tài)，也包括他們的不完美狀態(tài)，而且包括其他的分類同等物，例如，無性型。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能很容易識別適當同等物的同一性。
公眾很容易從許多的菌種保藏單位，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)，真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Regional Research Center)(NRRL)獲得這些種的菌株。
也可以從取自給定環(huán)境位置的沒有經(jīng)過培養(yǎng)的生物體集合中獲得DNA文庫(Liles et al.，2003，Appl.Environ.Microbiol.692684-2691；Beja et al.，2000，Science 2891902-1906；Tyson et al.，2004，Nature 42837-43；Venter etal.，2004，Science 30466-74，美國專利No.6,723,504)。
在另一個方案中，DNA庫是從直接純化自環(huán)境樣品或由環(huán)境樣品擴增的核苷酸原料中分離得到的，環(huán)境樣品包括未經(jīng)過培養(yǎng)的生物體的集合，例如來自土樣、淡水樣品、海水樣品、昆蟲腸(gut)、動物胃、廢水、淤泥或沉積物的未經(jīng)過培養(yǎng)的生物體的集合。
編碼變體多肽的突變基因庫本發(fā)明的方法還可以用于表達篩選親代多肽的變體。這種變體可以包含修飾親代多肽，例如在親代多肽的一個或多個位置出現(xiàn)取代、插入和/或缺失，或者還可以包含雜交多肽或蛋白質(zhì)融合。
可以通過本領(lǐng)域已知的操作，例如PCR或易出錯PCR導(dǎo)入突變。PCR擴增可以與利用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變處理劑，例如，導(dǎo)致轉(zhuǎn)換(transition)、顛換(transversion)、倒位(inversion)、顛倒(scrambling)、替換、缺失和/或插入的誘變處理劑的誘變步驟結(jié)合。本發(fā)明的優(yōu)選方案在產(chǎn)生低、中等或高隨機誘變頻率的條件下制備DNA片段。為了獲取低誘變頻率，可以通過標準的PCR擴增方法制備核苷酸序列(包含DNA片段)(美國專利No.4,683,202或Saiki et al.，1988，Science 239487-491)。通過在降低熱穩(wěn)定聚合酶的復(fù)制保真度和增加核苷酸錯誤參入的條件下進行PCR擴增可以獲得中等或高的誘變頻率，例如Deshler，1992，GATA 9103-106；Leung et al.，1989，BioTechniques 111-15中已描述這一點。
產(chǎn)生突變基因庫的其他方法，例如寡核苷酸定向誘變、組合PCR(assembly PCR)、體內(nèi)誘變、定點誘變、區(qū)指導(dǎo)誘變(region-directedmutagenesis)和寡核苷酸盒誘變(Reidhaar-Olson and Sauer，1988，Science 24153-57；Bowie and Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862152-2156；WO95/17413；WO 95/22625；Lowman et al.，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利No.5,223,409；WO 92/06204；Derbyshire et al.，1986，Gene 46145；Ner et al.，1988，DNA 7127)本領(lǐng)域已經(jīng)已知。
也可以通過如體內(nèi)和體外改組的過程插入和重組突變。在線性化的質(zhì)粒中通過體內(nèi)重組(Cherry et al.，Nat.Biotechnol.17379-384)或通過隨機片段化和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)重新組合的體外改組(Stemmer et al.，1994，Nature 370389-91；美國專利申請No.20030054390)，可以將DNA片段庫與同源區(qū)隨機組合(或″shuffled″)?？梢栽谝粋€轉(zhuǎn)化中組合許多突變體或同源基因，這樣可以從同源基因中高效地產(chǎn)生基因嵌合體。編碼改進的變體或野生型基因的這些基因的改組產(chǎn)生可以表達的嵌合體，隨后通過篩選鑒定那些具有有益突變最優(yōu)組合的嵌合體。與僅僅使用隨機誘變(參見綜述，Kuchner and Arnold，1997，TIBTech 15523-530)的過程相比，該過程可以使獲得的更進一步地改進變體的數(shù)目增加多倍。
隨機誘變將突變插入到靶核苷酸序列中，產(chǎn)生有害突變的機會比產(chǎn)生有益突變更加頻繁。在這種誘變的迭代循回中，有害突變的累積比有益突變更快，這樣能有效掩蔽篩選期間對有益突變的鑒定。在核苷酸序列中包含多樣單核苷酸變化的兩個或更多個同源核苷酸序列之間的隨機重組可能允許彼此分離包含在一個突變體中的所有核苷酸變化，并改為與存在于其他突變體上的任何突變進行隨機組合。突變的改組提供了一種將來自不同親代序列的突變彼此隨機組合以增加在單一核苷酸序列中組合核苷酸變化的概率的方式。至少一個改組循環(huán)是與最初使用的DNA片段的回交循環(huán)是優(yōu)選的，其中DNA片段可能是野生型DNA片段。這樣就消除了不需要的突變。也可以通過使用野生型DNA片段作為最初使用的輸入DNA原料來消除不需要的突變(non-essential)。
使用體內(nèi)重組的方法高效重組多個重疊片段是從突變體或同源基因產(chǎn)生嵌合體的方式。小至15bp的重疊足夠進行重組，而且甚至可以用于非常容易地對相距遠的有關(guān)基因進行域改組。在域改組中，通過在大塊非同源DNA的末端延伸同源性的方式使他們隨機組合。使用重疊片段是有用的通過在來自不同域的DNA片段之間產(chǎn)生小的重疊并篩選最好的組合來進行域改組的方法。
誘變/改組方法可以與本發(fā)明的高通量自動篩選方法組合以檢測宿主細胞表達的誘變處理克隆多肽的活性?？梢詮拇鏅n的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體或者從真菌細胞回收編碼活性變體多肽的誘變處理的DNA分子，并使用本領(lǐng)域的標準方法進行快速測序。這些方法允許快速確定單個氨基酸殘基在目的多肽中的重要性，并且可以用于結(jié)構(gòu)未知的多肽。
大腸桿菌宿主在本發(fā)明的方法中，可以使用任何大腸桿菌菌株來分離被引入該大腸桿菌菌株中的DNA文庫的單個集落轉(zhuǎn)化體。對實施本發(fā)明有用的大腸桿菌菌株的例子包括，但不局限于DH5αTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)[F-80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-，mk+)phoAsupE44λ-thi-1 gyrA96 relA1]；One ShotINValphaF′(Invitrogen，Carlsbad，CA)[F-endA1 recA1 hsdR17(rk-，mk+)supE44 thi-1 gyrA96 relA180lacZ.M15.(lacZYA-argF)U169λ-]；Top10(InVitrogen，Carlsbad，CA)F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)δ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endA1 nupG。
通過使用化學(xué)感受態(tài)或電穿孔感受態(tài)大腸桿菌細胞可以實現(xiàn)將DNA文庫導(dǎo)入大腸桿菌。例如用SURE電穿孔感受態(tài)細胞(SUREElectroporation-Competent Cells)(Stratagene，La Jolla，CA，美國專利Nos.6,338,965，6,040,184，6,017,748和5,552,314和同等的國外專利)、XL1-藍電穿孔感受態(tài)細胞(XL1-Blue Electroporation-Competent Cells)(Stratagene，La Jolla，CA，美國專利6,338,965和6,040,184)、XL10-金超感受態(tài)細胞(XL10-GoldUltracompetent Cells)(Stratagene，La Jolla，CA，美國專利Nos.5,512,468和5,707,841)，和SURE感受態(tài)細胞(SURE Competent Cells)(Stratagene，La Jolla，CA，美國專利Nos.6,017,748、5,707,841、5,552,314和5,512,468；美國專利Nos.6,017,748和5,552,314；美國專利Nos.6,338,965、6,040,184、6,017,748和5,552,314)可以實現(xiàn)導(dǎo)入DNA文庫。
可以手動或使用集落挑取設(shè)備(colony-picking device)完成DNA文庫的單個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體集落的分離?？梢允褂萌魏问袌錾峡少I到的裝置。這種裝置包括，但不限于Genetix QPix(Genetix Limited，Hampshire，UK)；VersArray Colony Picker and Arrayer System(BioRad，Hercules，CA，USA)。
步驟(a)的單個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體集落可以轉(zhuǎn)移到多孔板的單個孔中，可以如上所述手動或使用集落挑取設(shè)備完成這一步驟。
來自大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的DNA的分離在本發(fā)明的方法中，可以以本領(lǐng)域已知的任何形式完成從來自每個單獨的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體集落中制備DNA的步驟。優(yōu)選在多孔板的單個孔中完成制備DNA的步驟。使用本領(lǐng)域已知的任何方法可以完成DNA的制備。例如參見Sambrook，et al.，1989，Molecular Cloninga Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press，2ndEd.，pp 1.21-1.49中的煮沸，SDS和堿溶解，用如氯化銫梯度的方法進行純化的方法。可以使用Utterback等(1995，Genome Sci.Technol.11-8)修飾的進步基因技術(shù)公司(AdvancedGenetic Technologies Corporation)(Gaithersburg，MD)的96孔小量制備試劑盒(Miniprep Kit)操作規(guī)程分離DNA。另外，可以用滾環(huán)擴增從單個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體集落制備DNA(Nelson et al.，2002，Biotechniques，June，Suppl44-47)。
在優(yōu)選方案中，制備DNA的步驟是自動化的。例如可以利用機器人裝置，例如仿生自動機9600(BioRobot 9600)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)從大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。還可以遵循廠家的說明，利用QIAGENQiabot Miniprep Station(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。另一個裝置是AutoGenprep 960工具(AutoGen，Inc.，Holliston，MA)，該裝置是以96孔模式進行DNA提取的完全自動化的高通量工具。
在另一個優(yōu)選方案中，將從單個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體集落制備的總DNA的部分或等分用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌，并將剩余部分儲存起來。用于轉(zhuǎn)化的DNA文庫的存檔允許很容易地回收通過表達篩選繼續(xù)鑒定的那些轉(zhuǎn)化體中的核苷酸材料。
絲狀真菌宿主的轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的方法中，利用本領(lǐng)域已知的任何形式可以將步驟(b)的每一種DNA制備物引入絲狀真菌細胞的原生質(zhì)體分離懸浮液中以獲取其轉(zhuǎn)化體。每個轉(zhuǎn)化體包含來自DNA文庫的個體多核苷酸的一個或多個拷貝。優(yōu)選在多孔板的單個孔中進行絲狀真菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體的制備不必自動化，但可以大批量進行，這樣可以在機器人轉(zhuǎn)化方法中自動化吸移該試劑。
絲狀真菌細胞可以是適合表達目的多肽的任何絲狀真菌細胞?！褰z狀真菌″包括真菌亞門和Oomycota(如Hawksworth et al.，1995在上文中的定義)的所有絲狀體。絲狀真菌通常以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖及其他復(fù)合多糖組成的菌絲壁為特征。通過菌絲延伸進行生長，而且碳分解代謝是專性耗氧型的。與此相反，酵母，例如釀酒酵母是通過單細胞菌體出芽進行生長，而且碳分解代謝可能是發(fā)酵性的。
在優(yōu)選方案中，絲狀真菌細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、Bjerkandera、Ceriporiopsis、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、Talaromyces、嗜熱子囊菌、梭孢殼屬、Tolypocladium、Trametes或木霉屬細胞。
在更優(yōu)選方案中，絲狀真菌細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個更優(yōu)選的方案中，絲狀真菌細胞是桿孢狀鏈孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢菌、Fusarium graminum、異孢鐮孢、Fusarium negundi、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum細胞。在另一個更優(yōu)選的方案中，絲狀真菌細胞是Trichoderma harzianum、康寧木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細胞。在另一個更優(yōu)選的方案中，絲狀真菌細胞是無煙管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、Humicola insolensHumicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Phanerochaete chrysosporium、射脈菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、Trametes villosa或Trametes versicolor細胞。
在最優(yōu)選方案中，絲狀真菌細胞是米曲霉或Trichoderma reesei真菌細胞。
通常以本身已知的方式通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的過程來轉(zhuǎn)化絲狀真菌細胞。在EP238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適當方法。Malardier et al.，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢屬的適當方法。
在本發(fā)明的方法中，每個包含來自單一大腸桿菌集落的DNA的孔中含有同源的質(zhì)粒群體。因此，單個孔中DNA轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的每個真菌轉(zhuǎn)化體包含來自DNA文庫的單個多核苷酸。本領(lǐng)域已經(jīng)已知，將DNA文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌里會導(dǎo)致經(jīng)過幾代細菌生長后，獨特質(zhì)粒在復(fù)制和細胞通過隨機過程分裂到子細胞期間分隔開。
絲狀真菌轉(zhuǎn)化體的生長和表達或特性測量在本發(fā)明的方法中，步驟(c)的個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體生長在選擇性培養(yǎng)基上?？梢詫⑦x擇性生長培養(yǎng)基添加給包含在多孔板的單個孔中的每個轉(zhuǎn)化體?；蛘呖梢詫⒉襟E(c)的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)入包含選擇性生長培養(yǎng)基的另一個多孔板中。而且，步驟(c)的轉(zhuǎn)化體可以轉(zhuǎn)入到包含在多孔板的單個孔中的固相選擇性培養(yǎng)基中。但是，可以使用本領(lǐng)域已知的任何形式。選擇性培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素和/或有毒成分能保證轉(zhuǎn)化的真菌細胞與未轉(zhuǎn)化的細胞相比，生長更優(yōu)先。生長培養(yǎng)基優(yōu)選由誘導(dǎo)目的多肽表達的成分組成?？梢詮氖袌龉?yīng)商獲得適當?shù)呐囵B(yǎng)基，或者可以依照公開的組成制備適當?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，美國典型菌種保藏的目錄)。
可以手動完成選擇性培養(yǎng)基的添加，或者轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)移，但優(yōu)選通過自動化方式完成?？梢詮纳虡I(yè)上獲得自動化裝置，例如Beckman BiomekFxRobot的Span-8移液工具(Beckman Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)，液體操作機器人的96孔移液頭，或再排列工具，如在QBot上發(fā)現(xiàn)的那些再排列工具。
在本發(fā)明的方法中利用本領(lǐng)域已知的特異性針對目的多肽的方法來完成測量個體多核苷酸編碼的每個多肽的活性或特性的步驟。這些檢測方法包括，但不限于使用具體的抗體、形成酶產(chǎn)物或酶底物消失。特性包括，但不局限于改變的溫度依賴性的活性譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性?？梢允謩踊蜃詣油瓿蓪蝹€多核苷酸編碼的多肽表達或多肽特性的測量。
在優(yōu)選方案中，活性或特性的測量被自動化?？梢允褂迷试S自動化的任何裝置，例如，機器人裝置。市場上可買到的裝置包括，但是不局限于BiomekFx液體操作機器人(Beckman Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)，BeckmanSagian ORCA板操作機器臂(Beckman Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)，CaliperSciClone ALH300工作站(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)和QBot(Genetix Limited，Hampshire，UK)。為了增加在給定時間內(nèi)完成的個體活性測定的數(shù)量，可以在高通量篩選系統(tǒng)中使用多孔板方便地測定活性。多孔板包括，但不局限于96孔MJ Research Hard-Shell微板(96-well MJ ResearchHard-Shellmicroplates)(MJ Research，Waltham，MA)，Costar-3370 96孔澄清的聚苯乙烯板(Costar-3370 96-well clear polystyrene plate)(Corning，Acton，MA)，聚丙烯超硬深孔板(Polypropylene Ultra Rigid Deep-Well Plate)(ABgene，Rochester，NY)，Costar-3950 1536孔測定板(Costar-3950 1536-wellassay plates)(Corning，Acton，MA)，Costar-3706 384孔底板澄清的聚苯乙烯板(Costar-3706 384-well clear bottom polystyrene plates)(Corning，Acton，MA)和Costar 24孔細胞培養(yǎng)群集器(Costar 24-well cell culture cluste)(Corning，Acton，MA)。這種篩選技術(shù)在本領(lǐng)域為大家所熟知，例如，參見Taylor et al.，2002，J.Biomolec.Screening 7554-569；Decker et al.，2003，Appl.Biochem.Biotech.105-108689-703；Dove，1999，Nature Biotech.17859-863和Kell，1999，Trends in Biotechnology 1789-91。
多核苷酸本發(fā)明的方法更進一步地包括從一個或多個個體轉(zhuǎn)化體中分離來源于DNA文庫的多核苷酸，其中多核苷酸編碼目的多肽?；蛘呖梢詮拇鏅n的DNA文庫中重新得到多核苷酸。
用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域已經(jīng)已知，該技術(shù)包括從基因組DNA分離、從cDNA制備或他們的組合。例如，通過利用眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或檢測具有共用結(jié)構(gòu)特點的克隆的DNA片段的表達庫的抗體篩選可以實現(xiàn)從這種基因組DNA中克隆多核苷酸。例如參見Innis et al.，1990，PCRA Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可以使用其他核酸擴增方法，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和核苷酸序列依賴的擴增(NASBA)。
多核苷酸也可以是一個或多個核苷酸從分離的多核苷酸的5′和/或3′末端被缺失的子序列，其中子序列編碼具有生物活性的多肽片段。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明也涉及包含插入物或操作性地與一個或多個控制序列相連的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中控制序列指導(dǎo)編碼序列在控制序列相容的條件下在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_。
可以用多種方式操作編碼目的多肽的分離的多核苷酸(或插入物)，為多肽表達作準備。將多核苷酸序列插入到載體之前操縱多核苷酸序列可能是合乎需要的或必需的，這取決于表達載體。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。
控制序列可以是被表達多核苷酸的絲狀真菌宿主細胞辨別的適當?shù)膯幼有蛄?，其中多核苷酸編碼本發(fā)明的多肽。啟動子序列包含介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜種啟動子，從編碼宿主細胞同源或異源的編碼細胞外或細胞內(nèi)多肽的基因中可以獲得啟動子。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的適當啟動子的實例，有從大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核生物的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 753727-3731)中獲得的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。還有“Useful proteins from recombinant bacteria”，Scientific American，1980，24274-94及Sambrook等人，1989，同上中描述的其它啟動子。
用于在絲狀真菌宿主細胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當啟動子的實例有從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶，F(xiàn)usarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO 00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)、Trichoderma reeseiβ-葡糖苷酶、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)I、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)II、Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶I、Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶II、Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶III、Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶IV、Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶(xylanase)I、Trichoderma reesei木聚糖酶II、Trichoderma reeseiβ-木糖苷酶基因中獲得的啟動子和NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；以及突變的、截短的和他們的雜合啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母metallothionine(CUP1)和釀酒酵母3磷酸甘油酸激酶基因中獲得的。Romanos et al.，1992，Yeast 8423-488中描述了適合于酵母宿主細胞的其他有用的啟動子。
控制序列也可以是適當?shù)谋唤z狀真菌宿主細胞辨別后能終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列。終止序列操作性地與編碼多肽的核苷酸序列的3′末端相連。在選擇的宿主細胞中有功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
適合于絲狀真菌宿主細胞的終止子優(yōu)選是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因中獲得的。
適合于酵母宿主細胞的終止子優(yōu)選是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中獲得的。上文的Romanos et al.，1992中描述了適合于酵母宿主細胞的其他有用的終止子。
控制序列也可以是適當?shù)那皩?dǎo)序列，前導(dǎo)序列是對絲狀真菌宿主細胞進行的翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列操作性地與編碼多肽的核苷酸序列的5′末端相連。在選擇的宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列都可以用于本發(fā)明。
適合于絲狀真菌宿主細胞的前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因中獲得的。
適合于酵母宿主細胞的適當?shù)那皩?dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因中獲得的。
控制序列也可以是操作性地與核苷酸序列的3′末端相連的多腺苷酸化序列，轉(zhuǎn)錄時，該序列會作為添加多聚腺苷殘基到轉(zhuǎn)錄的mRNA上的信號被宿主細胞識別。在選擇的宿主細胞中有功能的任何多腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。
適合于絲狀真菌宿主細胞的多腺苷酸化序列優(yōu)選是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因中獲得的。
Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990中描述了適合于酵母宿主細胞的有用的多腺苷酸化序列。
控制序列也可以是編碼與多肽的氨基末端有連接的氨基酸序列和指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞分泌路徑的信號肽編碼區(qū)。核苷酸序列的編碼序列的5′端可以固有地包含在翻譯閱讀框中天然地與編碼分泌多肽的編碼區(qū)的片段連接的信號肽編碼區(qū)。或者，編碼序列的5′末端可以包含與編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。當編碼序列天然地不包含信號肽編碼區(qū)時，可能需要外來的信號肽編碼區(qū)?；蛘?，外來的信號肽編碼區(qū)可以簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增加多肽的分泌。但是，在本發(fā)明中可以使用指導(dǎo)表達的多肽進入選擇的宿主細胞的分泌路徑的任何信號肽編碼區(qū)。
適合于細菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區(qū)是從芽胞桿菌屬NCIB11837生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因中獲得的信號肽編碼區(qū)。Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137中描述了更進一步的信號肽。
適合于絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶、Humicola insolens內(nèi)切葡聚糖酶V和Humicola lanuginosa脂肪酶基因中獲得的信號肽編碼區(qū)。
適合于酵母宿主細胞的有用的信號肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因中獲得的。上文的Romanos et al.，1992中描述了其他有用的信號肽編碼區(qū)。
控制序列也可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。得到的多肽被稱為前酶或前肽(或有時稱為酶原)。前肽通常是非活性的，通過從前多肽上催化切割或自身催化切割除去前肽，可以將前多肽轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓挠谢钚缘亩嚯?。前肽編碼區(qū)可以是從米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila漆酶(WO95/33836)基因中獲得的。
當信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)相鄰著多肽的氨基末端，信號肽區(qū)相鄰著前肽的氨基末端。
添加允許相對于宿主細胞的生長調(diào)節(jié)多肽表達的調(diào)節(jié)序列也可能是合乎需要的。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是那些使基因響應(yīng)化學(xué)或物理刺激開始或停止表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括存在調(diào)節(jié)化合物。原核生物系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可以用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其他實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在存在甲氨蝶呤的情況下被擴增的二氫葉酸還原酶基因和用重金屬進行擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列操作性地與調(diào)節(jié)序列連接。
表達載體本發(fā)明也涉及包含分離的多核苷酸或插入物、啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⑷缟纤龅母鞣N核酸和控制序列連接在一起產(chǎn)生包含一個或多個方便的限制性內(nèi)切位點的重組表達載體，其中限制性內(nèi)切位點允許在該位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?；蛘撸ㄟ^將核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入到適當?shù)谋磉_載體中可以表達該核苷酸序列。構(gòu)建表達載體時，編碼序列位于載體中以便使編碼序列操作性地與適當?shù)谋磉_控制序列連接。
重組表達載體可以是能方便地經(jīng)受重組DNA過程和使核苷酸序列表達的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。典型地，載體的選擇取決于載體與載體被導(dǎo)入其中的宿主細胞的相容性。載體可以是線性質(zhì)?；蜷]合環(huán)狀質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體，例如質(zhì)粒，染色體外元件，微型染色體或人工染色體存在的載體，它的復(fù)制不依賴染色體復(fù)制。載體可以包含任何保證自我復(fù)制的工具?；蛘咻d體可以是被引入宿主細胞時，能被整合到基因組中，并和已經(jīng)整合它的染色體一起復(fù)制的載體。而且，可以使用單個載體或質(zhì)粒，或者使用共同包含被引入宿主細胞基因組的總DNA的兩個或更多個載體或質(zhì)粒。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個或多個允許容易選擇轉(zhuǎn)化細胞的可選擇標記?？蛇x擇標記是其產(chǎn)物提供生物殺傷劑(biocide)抗性或病毒抗性，重金屬抗性和營養(yǎng)缺陷型到原養(yǎng)型等等的基因。
細菌的可選擇標記的實例有來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者是賦予抗生素抗性，例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標記。適合于酵母宿主細胞的合適的標記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。供絲狀真菌宿主細胞用的可選擇標記包括，但是不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)化酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(sulfate adenyltransferase)和trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及他們的等同物。供曲霉屬細胞用的標記優(yōu)選是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
在這里描述的載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細胞基因組中或者允許載體在細胞中不依賴基因組自主復(fù)制的元件。
在這里描述了對細菌或絲狀真菌細胞有用的復(fù)制起點的實例。供酵母宿主細胞用的復(fù)制起點的實例有復(fù)制的2微米起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。
可以將一個拷貝以上的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。通過將序列的至少一個附加拷貝整合到宿主細胞基因組中，或者通過用包含擴增拷貝的可選擇標記基因的細胞中的多核苷酸包括可擴增的可選擇標記基因可以實現(xiàn)多核苷酸復(fù)制數(shù)的增加，這樣通過在存在適當?shù)目蛇x擇試劑的情況下培養(yǎng)細胞可以選擇出多核苷酸的附加拷貝。
用來連接如上所述的元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的過程為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知(例如，參見Sambrook et al.，1989，上文)。
宿主細胞本發(fā)明也涉及包含依照本發(fā)明分離的多核苷酸或插入物的重組宿主細胞，在重組生產(chǎn)目的多肽時可以方便地使用這些重組宿主細胞。包含分離的多核苷酸或插入物的載體被引入宿主細胞，這樣就可以按照以前的描述將載體作為染色體的組成部分或自我復(fù)制的染色體外載體來維持。術(shù)語″宿主細胞″包括親代細胞的任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而不同于親代細胞的子代。宿主細胞的選擇很大程度上取決于編碼該多肽的基因和它的來源。
宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。
有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如包括，但不限于芽胞桿菌屬細胞，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽胞桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和蘇云金芽孢桿菌細胞(Bacillus thuringiensis)；或者鏈霉菌屬細胞，例如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)的革蘭氏陽性細菌；或革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas sp.)。在個優(yōu)選方式中，細菌宿主細胞是遲緩芽胞桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在另一個優(yōu)選方式中，芽胞桿菌細胞是嗜堿(alkalophilic)芽胞桿菌。
例如，可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，參見Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、使用感受態(tài)細胞(例如，參見Young and Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81823-829或Dubnau andDavidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(例如，參見Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或接合作用(例如，參見Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)將載體導(dǎo)入細菌宿主細胞中。
宿主細胞也可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。
在優(yōu)選方案中，宿主細胞是真菌細胞。在這里使用的″真菌″包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(正如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby′sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的那樣)，以及卵菌門(Oomycota)(在上文Hawksworth等，1995的171頁引用)和所有的有絲分裂孢子真菌類(mitosporic fungi)(上文Hawksworth et al.，1995)。
在更優(yōu)選的方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。在這里使用的″酵母″包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(Endomycetales)(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)的酵母(芽生菌綱)(Blastomycetes)。因為酵母的分類在將來可能發(fā)生變化，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，應(yīng)該按照Biology and Activities ofYeast中的描述(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)定義酵母。
在一個更加優(yōu)選的方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜(氏)酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細胞在最優(yōu)選的方案中，酵母宿主細胞是卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方案中，酵母宿主細胞是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)。在另一個最優(yōu)選的方案中，酵母宿主細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個更優(yōu)選的方案中，真菌宿主細胞是這里描述的絲狀真菌細胞。
以本身已知的方式通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的過程可以轉(zhuǎn)化真菌細胞。在EP238 023和Yelton et al.，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適當方法。Malardier et al.，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢屬的適當方法?？梢杂肂ecker and Guarente，InAbelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153163和Hinnen et al.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920中描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
生產(chǎn)方法本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)這里描述的宿主細胞；和(b)回收多肽。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的生產(chǎn)方法在適合于生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞。例如可以通過搖瓶培養(yǎng)，以及在允許表達多肽和/或分離多肽的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中完成的在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(連續(xù)不斷的發(fā)酵、分批發(fā)酵、分級-分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法，在包含碳源，氮源和無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中可以進行培養(yǎng)?？梢詮氖袌龉?yīng)商獲得適當?shù)呐囵B(yǎng)基，或者可以依照公開的組成制備適當?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，美國典型菌種保藏的目錄)。如果多肽被分泌到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，就可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽沒有被分泌，可以從細胞溶解產(chǎn)物中回收多肽。
可以利用本領(lǐng)域已知的特異性針對多肽的方法檢測多肽。這些檢測方法可以包括使用具體的抗體、形成酶產(chǎn)物或酶底物消失。例如可以用酶測定來確定這里描述的多肽的活性。
可以利用本領(lǐng)域已知的方法回收產(chǎn)生的多肽。例如，通過包括但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀的常規(guī)程序可以從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。
然后通過本領(lǐng)域已知的多種方法，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親合、疏水性、色譜聚焦和大小排阻層析)、電泳方法(例如，制備性的等電聚焦)、差別可溶性(differential solubility)(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(例如，參見Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)可以更進一步地純化本發(fā)明的多肽。
下列實施例更進一步地描述了本發(fā)明，不應(yīng)認為實施例是限制本發(fā)明的范圍。
實施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)制劑至少是試劑等級的商品。
菌株利用Trichoderma reesei菌株RutC30菌株(ATCC56765)作為纖維二糖水解酶I(cellobiohydrolase I)(Cel7a)基因的來源。
利用米曲霉Jal250(WO99/61651)來表達Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I(cellobiohydrolase I)(cel7a)。
培養(yǎng)基和溶液YT培養(yǎng)基由每升5g NaCl、8g胰蛋白胨和5g酵母抽提物和組成。
YT瓊脂平板由每升10g瓊脂、5g NaCl、8g胰蛋白胨和5g酵母抽提物組成。
2XYT培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨，10g酵母抽提物和5g氯化鈉組成。
2XYT瓊脂培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨、10g酵母抽提物、5g氯化鈉和15g Bacto瓊脂組成。
YP培養(yǎng)基由每升10g酵母抽提物和20g Bacto蛋白胨組成。
STC由0.8M山梨糖醇、25mM pH 8的Tris和25mM CaCl2組成。
M400培養(yǎng)基由每升50g麥芽糖糊精、2g MgSO4·7H2O、2gKH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母抽提物、2g尿素、0.5g CaCl2和0.5ml AMG微量金屬溶液組成。
AMG微量金屬溶液由每升14.3g ZnSO4·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.5g NiCl2·6H2O、13.8g FeSO4·7H2O、8.5g MnSO2·H2O和3g檸檬酸組成。
LB培養(yǎng)基由每升10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物和5g NaCl組成。
STC由1M山梨糖醇、10mM CaCl2和10mM Tris-Cl組成。
TAE緩沖液由每升4.84g Tris Base、1.14ml冰醋酸和2ml 0.5M pH 8.0的EDTA組成。
實施例1發(fā)酵和菌絲組織依照現(xiàn)有技術(shù)的描述(Mandels and Weber，1969，Adv.Chem.Ser.95391-413)在纖維素誘導(dǎo)的標準條件下生長Trichoderma reesei RutC30。通過過濾通過瓦特曼紙(Whatman paper)和在液氮中速凍收獲菌絲樣品。將樣品儲存在-80℃，直到破壞他們用于提取RNA。
實施例2已表達序列標簽(EST)cDNA文庫構(gòu)建依照Timberlake和Barnard(1981，Cell 2629-37)的方法從實施例1描述的菌絲樣品中提取總細胞RNA，在從1％的甲醛瓊脂糖凝膠獲得印跡之后通過Northern雜交來分析RNA樣品(Davis et al.，1986，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，New York)。依照廠家的說明用mRNA分離試劑盒(mRNA Separator KitTM)(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)從總RNA中分離多(聚)腺苷酸化的mRNA部分。除NotI-(dT)18引物(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)被用來啟動第一鏈合成外，依照Gubler和Hoffman(1983，Gene 25263-269)的方法利用大約5μg多聚(A)+mRNA合成雙鏈cDNA。用綠豆核酸酶(Boehringer MannheimCorporation，Indianapolis，IN)處理cDNA，用T4DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)使末端變鈍。
Bam HI/Eco RI接頭被連接到cDNA/變鈍的末端。在用Not I消化后，利用TAE緩沖液通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳選擇cDNA大小(大約0.7-4.5kb)，并與被Not I加Bam HI切割和小牛腸堿性磷酸酶脫去磷酸的pYES2(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)連接。連接的混合物用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。在補充有最終濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的2YT瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體(Miller，1992，A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor.New York)。
實施例3模板制備和cDNA克隆的核苷酸測序?qū)嵤├?描述的cDNA文庫進行的實驗中大約有7000個轉(zhuǎn)化體集落被直接從轉(zhuǎn)化板挑取到96孔微量滴定板中，其中微量滴定板的每個孔包含100ul的每毫升補充有50ug氨芐青霉素的2YT肉湯。在37℃以200rpm的速度搖振，孵育孔板過夜。在孵育以后，每孔加入100ul的50％的無菌甘油。將轉(zhuǎn)化體復(fù)制到每孔包含1ml豐富肉湯(broth)(Magnificent BrothTM)(MacConnell Research，San Diego，CA)的次級深孔(secondary deep well)96孔板中(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg MD)，其中每毫升肉湯補充有50ug氨芐青霉素。初級微量滴定板儲存在-80℃。37℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上，劇烈攪動(300rpm)孵育次級深孔板過夜。為了防止溢出和交叉污染，同時允許充分通風(fēng)，用聚丙烯襯墊(Advanced GeneticTechnologies Corporation，Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定板蓋蓋住每個次級培養(yǎng)平板。
可以使用Utterback等(1995，Genome Sci.Technol.11-8)修飾的進步基因技術(shù)公司(Advanced Genetic Technologies Corporation)(Gaithersburg，MD)的96孔小量制備試劑盒(Miniprep Kit)操作規(guī)程從每個孔分離DNA。利用染料終止化學(xué)作用(Giesecke et al.，1992，Journal of Virology Methods 3847-60)和T7測序引物，用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XLAutomated DNA Sequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)完成一次通過(single-pass)的DNA測序T75′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO1)實施例4cDNA克隆的DNA序列數(shù)據(jù)分析為了控制質(zhì)量，對核苷酸序列數(shù)據(jù)進行了細檢，整理了載體序列和DNA序列末端不明確的堿基，借助于PHRED/PHRAP軟件(University ofWashington，Seattle，WA)的幫助將所有序列進行了相互比較。在六個框架中翻譯了得到的毗連(序列)群(contig)和單獨序列(singletons)，并利用GeneMatcheTMr軟件(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)用修飾的Smith Waterman算術(shù)，利用BLOSUM 62矩陣在公眾可獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對他們進行檢索。
實施例5編碼家族7纖維二糖水解酶I(Family 7 cellobiohydrolaseI)(Cel7A)的cDNA克隆的鑒定通過將推斷的組合ESTs的氨基酸序列與存放在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫，例如Swissprot、Genpept和PIR中的蛋白質(zhì)序列進行比較，來鑒定編碼家族7纖維二糖水解酶I(Family 7 cellobiohydrolase I)(Cel7A)的公認的cDNA克隆。選擇出一個克隆--Trichoderma reesei EST Tr0221進行核苷酸序列分析，分析顯示1821bp的pYES2插入物包含SEQ ID NO2所示的1452bp的開放閱讀框和SEQ ID NO3所示的推斷的氨基酸序列。包含Trichodermareesei Cel7A纖維二糖水解酶I基因的質(zhì)粒被命名為pTr0221。包含在大腸桿菌NRRL B-30683中的質(zhì)粒pAJO52也可以用作該基因的來源。
實施例6pAlLo2表達載體的構(gòu)建表達載體pAlLo1是通過修飾pBANe6(美國專利No.6,461,837)構(gòu)建的，其中pBANe6包含來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動子的雜種(NA2-tpi啟動子)、黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶終止序列(AMG終止子)和構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。利用描述的Big染料TM終止劑的化學(xué)作用，通過測序來證實所有誘變步驟。通過定位誘變首先從amdS選擇標記上的位置2051、2722和3397bp處消除三個Nco I限制性內(nèi)切位點完成對pBANe6的修飾。全部變化被設(shè)計成不改變amdS基因產(chǎn)物的實際蛋白質(zhì)序列的″沉默型″。依照廠家的說明，利用下列引物(加下劃線的核苷酸代表變化的堿基)，用GeneEditorTM體外定位誘變試劑盒(GeneEditorTMinvitro Site-Directed Mutagenesis)(Promega，Madison，WI)同時除去這三個位點AMDS3NcoMut(2050)5′-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3′(SEQID NO4)AMDS2NcoMut(2721)5′-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3′(SEQ ID NO5)AMDS1NcoMut(3396)6′-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3′(SEQ ID NO6)然后利用QuickChangeTM定位誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)讓包含全部三個預(yù)期序列變化的質(zhì)粒經(jīng)受定位誘變，以消除在AMG終止子末端位置1643處的Nco I限制性內(nèi)切位點。下列引物(加下劃線的核苷酸代表變化的堿基)用于誘變誘變處理AMG終止序列的上游引物5′-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3′(SEQ ID NO7)誘變處理AMG終止序列的下游引物5′-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3′(SEQ ID NO8)修飾pBANe6的最后步驟是利用QuickChangeTM定位誘變試劑盒和下列引物(加下劃線的核苷酸代表變化的堿基)，在聚合接頭起始處添加新的Nco I限制性內(nèi)切位點得到pAlLo1(圖1)。
誘變處理NA2-tpi啟動子的上游引物5′-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3′(SEQ ID NO9)誘變處理NA2-tpi啟動子的下游引物5′-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3′(SEQID NO10)pAlLo1的amdS基因同構(gòu)巢曲霉pyrG基因交換。質(zhì)粒pBANe10(圖2)被用作選擇標記pyrG基因的來源。pBANe10的序列分析顯示pyrG標記包含在Nsi I限制性片斷中，它既不包含Nco I限制性內(nèi)切位點，也不包含PacI限制性內(nèi)切位點。因為amdS也與Nsi I限制性內(nèi)切位點側(cè)接，因此切換選擇標記的策略是單純替換Nsi I限制性片斷。用限制性內(nèi)切酶Nsi I消化來自pAlLo1和pBANe10的質(zhì)粒DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳純化產(chǎn)物。包含pyrG基因的pBANe10的Nsi I片段連接到pAlLo1的骨架上以替換原有的包含amdS基因的NsiI DNA片段。通過限制性內(nèi)切酶消化分析重組克隆以決定他們具有正確的插入物，以及正確的插入方向。具有逆時針方向轉(zhuǎn)錄的pyrG基因的克隆被選中。新的質(zhì)粒被命名為pAlLo2(圖3)。
實施例7pCW026的構(gòu)建通過設(shè)計允許克隆到Nco I和Pac I位點的兩個顯示如下的引物可以實現(xiàn)將Cel7A纖維二糖水解酶基因亞克隆到pAlLo2中。引物cTR0221.7將與pAlLo2中的Nco I位點相容的BspLU II位點整合到了Cel7A纖維二糖水解酶I基因的5′端。引物cTR0221.7a在Cel7A纖維二糖水解酶I基因的3′端整合了Bsp LUII位點。
引物cTR0221.75′-gcaacatgtatcggaagttggc-3′(SEQ ID NO11)引物cTR0221.7a5′-aattaattttacaggcactgag-3′(SEQ ID NO12)利用1X Tgo聚合酶反應(yīng)緩沖液(Boehringer Mannheim Co，Indianapolis，IN)、25ng pTR0221、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.2mM、每個引物(cTR0221.7和cTR0221.7a)各50pmole和1單位Tgo聚合酶(BoehringerMannheim Co，Indianapolis，IN)完成Cel7A纖維二糖水解酶I基因的擴增。利用MJ Research Thermocycler(MJ Research，Inc.，Boston，MA)孵育反應(yīng)物，MJ Research Thermocycler的程序設(shè)計為95℃5分鐘一個循環(huán)，接下來94℃60秒，55℃45秒和72℃2分鐘，35個循環(huán)。然后在72℃孵育反應(yīng)物，延伸5分鐘。利用TAE緩沖液在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳等分的每個PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生大約1545bp的預(yù)期條帶。
利用Zero BluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)亞克隆1545bp的PCR產(chǎn)物。用Bsp LUII和Pac I消化產(chǎn)生的質(zhì)粒，并利用TAE緩沖液在瓊脂糖凝膠上分級，產(chǎn)生預(yù)期1.5kb的編碼序列，然后切下該序列，并利用AmiconUltra-free DA柱(Millipore，Billerica，MA)從凝膠中純化該序列。產(chǎn)生的片段隨后被連接到被類似消化的pAlLo2中，產(chǎn)生包含Trichoderma reesei Cel7A纖維二糖水解酶I基因的被命名為pCW026(圖4)的表達載體。
實施例8質(zhì)粒pENi2229的構(gòu)建為了改進目的基因在表達質(zhì)粒上的表達，降低用于選擇的基因標記的表達是合乎需要的，在這里用pyrG基因來例示基因標記。通過在正常的選擇壓力下，培養(yǎng)含有包含表達已經(jīng)降低的選擇基因的表達質(zhì)粒的宿主細胞會導(dǎo)致選擇出具有增加的質(zhì)?？截悢?shù)的宿主細胞，因此能實現(xiàn)存活必需的選擇基因的總的表達水平。但是，更高的質(zhì)粒拷貝數(shù)也會導(dǎo)致目的基因表達增加。
降低選擇基因表達水平的一種方式是通過使用差的轉(zhuǎn)錄啟動子或降低mRNA的功能半衰期來降低mRNA水平。另一個方法是降低mRNA的翻譯效率。這樣做的一種方法是使Kozak區(qū)發(fā)生突變(Kozak，1999，Gene 234187-208)。這是正好位于起始密碼子(ATG)上游的區(qū)，起始密碼子對翻譯起始很重要。下面的部分描述包含現(xiàn)有技術(shù)啟動子和終止子元件，以及選擇基因上游的破壞的Kozak區(qū)的表達載體的構(gòu)建過程。
pMT2188。質(zhì)粒pMT2188以曲霉表達質(zhì)粒pCaHj483(WO 98/00529)為基礎(chǔ)，pCaHj483由以融合到構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序(NA2-tpi)的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子和黑曲霉淀粉糖苷酶終止子(AMG)為基礎(chǔ)的表達盒組成。pCaHj483上也存在來自構(gòu)巢曲霉的使曲霉能夠在以乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長的曲霉選擇性標記amdS。這些元件被克隆到大腸桿菌載體pUC19中(New England Biolabs，Beverly，MA)。用在大腸桿菌中能補助pyrF突變的釀酒酵母的URA3標記替換在大腸桿菌的pUC19中允許進行選擇的氨芐青霉素抗性標記；依照如下所述完成替換。
用顯示如下的引物從pCaHj483 PCR擴增pUC19復(fù)制的起點1427795′-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3′(SEQ ID NO13)1427805′-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3′(SEQ ID NO14)引物142780在PCR片段中引入Bbu I位點。用ExpandTMPCR系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)進行擴增，遵循廠家的說明進行該擴增和隨后的PCR擴增。使用引物從一般的釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen corporation，Carlsbad，CA，USA)中擴增URA3基因1402885′-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3′(SEQ ID NO15)1427785′-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3′(SEQ ID NO16)引物140288在PCR片段中引入Eco RI位點。通過混合這兩個PCR片段和使用引物142780和140288(SEQ ID NO15)擴增他們使他們通過重疊法在拼接中發(fā)生融合。
用Eco RI和Bbu I消化產(chǎn)生的片段，并將他們連接到用相同的酶消化的pCaHj483的最大片段上。用連接的混合物轉(zhuǎn)化通過Mandel和Higa的方法(1970 J.Mol.Biol.45154)使其處于感受態(tài)的pyrF-大腸桿菌菌株DB6507(ATCC 35673)。在補充有1g/l酪蛋白氨基酸、500ug/l硫胺和10mg/l卡那霉素的固體M9培養(yǎng)基(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)上選擇轉(zhuǎn)化體。
來自選擇出的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒被稱為pCaHj527。通過單純的PCR方法使存在于pCaHj527上的NA2-tpi啟動子經(jīng)受定位誘變。使用誘變引物141223(SEQ ID NO17)將核苷酸134-144從GTACTAAAACC變成CCGTTAAATTT。使用誘變引物141222(SEQ ID NO17)將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT變成CGGCAATTTAACGG。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為pMT2188。
1412235′-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3′(SEQ ID NO17)1412225′-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3′(SEQID NO18)pENI1849。制備了質(zhì)粒pENI1849，其目的是為了截短pyrG基因消除pyrG表達不需要的序列以降低質(zhì)粒的大小，為實現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)化頻率作準備。使用pENI1299(WO 00/24883)作為模板和下面的引物制備了PCR片段(大約1800bp)。遵循廠家的說明用Expand PCR系統(tǒng)進行擴增。
270999J85′-TCTGTGAGGCCTATGGATCTCAGAAC-3′(SEQ ID NO19)270999J95′-GATGCTGCATGCACAACTGCACCTCAG-3′(SEQ IDNO20)用限制性內(nèi)切酶Stu I和Sph I消化PCR片段，并將其克隆到也用Stu I和Sph I消化的pENI1298(公開在WO 00/24883)中。通過測序來驗證克隆。
pENI1861。構(gòu)建包括現(xiàn)有技術(shù)的曲霉屬啟動子和許多供克隆的獨特的限制性內(nèi)切位點的質(zhì)粒pENI1861。用下面的引物，使用質(zhì)粒pMT2188作為模板擴增PCR片段(大約620bp)。遵循廠家的說明用ExpandTMPCR系統(tǒng)進行擴增。
051199J15′-CCTCTAGATCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCCTCCGCGGCCGCTGGATCCCCAGTTGTG-3′(SEQ ID NO21)1298-TAKA5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT-3′(SEQ ID NO22)用BssH II和Bgl II消化片段，并將其克隆到也用BssH II和Bgl II消化的pENI1849中。通過測序驗證克隆。
pENI2151。用Hind III分別消化質(zhì)粒pENI1902(描述在WO2002/059331中)和pENI1861。使用TAE緩沖液，從凝膠中切除和遵循廠家的說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGel Extraction Kit)進行純化，從1.0％的瓊脂糖凝膠中純化來自pENI1861的2408bp的片段和消化載體pENI1902。
遵循廠家的說明，使用T4DNA連接酶(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)連接該片段和載體，并將他們轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH10BTM中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用QiaprepMiniprep試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pENI2151。
pENI21555。構(gòu)建質(zhì)粒pENI2155破壞pyrG基因上游的Kozak區(qū)。使用pENI1861作為模板，進行兩個PCR反應(yīng)。在一個PCR反應(yīng)中使用引物141200J1和270999J9，在另一個PCR反應(yīng)中使用引物141200J2和290999J8。
141200J15′-ATCGGTTTTATGTCTTCCAAGTCGCAATTG-3′(SEQ ID NO23)141200J25′-CTTGGAAGACATAAAACCGATGGAGGGGTAGCG-3′(SEQ ID NO24)遵循廠家的說明用ExpandTMPCR系統(tǒng)進行擴增。使用TAE緩沖液，從凝膠中切除和遵循包括在試劑盒中的說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGel Extraction Kit)進行純化，在1.0％的瓊脂糖凝膠中分辨產(chǎn)生的片段。
使用上述的片段作為模板，連同引物270999J8和270999J9一起進行另一個PCR反應(yīng)。遵循廠家的說明用ExpandPCR系統(tǒng)進行擴增。使用TAE緩沖液，從凝膠中切除和遵循廠家的說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGel Extraction Kit)進行純化，在1.0％的瓊脂糖凝膠中分辨從此反應(yīng)產(chǎn)生的PCR片段。
用Stu I和Sph I消化片段和pENI1849。按照如上所述從1.0％的瓊脂糖凝膠中純化產(chǎn)生的片段。使用T4 DNA連接酶連接純化的片段，并依照廠家的說明將他們轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH10BTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用QiaprepMiniprep試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，測序證實該質(zhì)粒引入了顯示如下的突變的Kozak區(qū)5′-GGTTTTATG-3′(SEQ ID NO25)已經(jīng)被替換的野生型Kokak顯示如下5′-GCCAACATG-3′(SEQ ID NO26)該質(zhì)粒被命名為pENI2155。
pENI2207。用Stu I和Sph I消化質(zhì)粒pENI2151和pENI2155。使用TAE緩沖液，從凝膠中切除和遵循廠家的說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGel Extraction Kit)進行純化，從1.0％的瓊脂糖凝膠中純化來自pENI2155的2004bp的片段和消化的載體pENI2151。
連接片段和載體，并依照廠家的說明將他們轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH10BTM中。使用Qiaprep Miniprep試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pENI2207。
pENI2229。遵循廠家的說明使用pENI2151作為模板和PWO聚合酶(Roche Applied Science，Indianapolis)，用引物2120201J1和1298-TAKA完成PCR反應(yīng)。
1298-TAKA5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT-3′(SEQ ID NO27)2120201J15′-GCCTCTAGATCTCCCGGGCGCCGGCACATGTACCAGGTCTTAAGCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCC-3′(SEQ ID NO28)從凝膠中切除產(chǎn)生的650bp的PCR片段并遵循廠家的說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAquickGel Extraction Kit)進行純化，從1.0％的瓊脂糖凝膠中純化出產(chǎn)生的650bp的PCR片段。
用Bss HII和Bgl II消化PCR片段(650bp)和pENI2207。遵循廠家的說明使用QIAGENTM離心柱從1.0％的瓊脂糖凝膠中純化載體和PCR片段。使用T4DNA連接酶連接PCR片段和消化的載體，并依照廠家的說明將他們轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH10BTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用QiaprepMiniprep試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒，通過DNA測序驗證對該質(zhì)粒進行驗證，并將該質(zhì)粒命名為pENI2229(圖5)。
實施例9pCW013的構(gòu)建根據(jù)pENi2229構(gòu)建質(zhì)粒pCW013以獲得在米曲霉中表達Humicolainsolens纖維二糖水解酶I。按照Dalboge and Heldt-Hansen，1994，Mol.Gen.Gene 243253-260中的描述通過PCR從pHD459b擴增Humicola insolens纖維二糖水解酶I的編碼序列。
包含全長纖維二糖水解酶I基因的PCR片段被亞克隆到pENi2229中作為Bam HI Xma I片段。按照如下所述完成pCW013的構(gòu)建。
使用下列引物用纖維二糖水解酶I基因5′末端的Bam HI位點和3′末端的Xma I位點延長PCR片段。
引物15′-CGCGGATCCACCATGCGTACCGCCAAGTTCGCC-3′(SEQID NO29)引物25′-GCCCCGGGTTACAGGCACTGAGAGTACCAG-3′(SEQ IDNO30)擴增反應(yīng)(50ul)包含下列成分0.3ug pHD459b、1單位PWO聚合酶、1xPWO聚合酶緩沖液、0.2mM dNTPs、50pmol的引物1和50pmol的引物2。在Eppendorf Mastercycler(Eppendorf，Westbury，New York)中孵育反應(yīng)物，反應(yīng)程序設(shè)計為95℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘，共30個循環(huán)。
然后使用TAE緩沖液在0.8％的瓊脂糖凝膠上分辨反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠中切除1605bp產(chǎn)物的條帶，并依照制造商的說明使用Amicon UltrafreeDACentrifugal Unit(Millipore，Bedford，MA)進行純化。然后連接純化的產(chǎn)物，并遵循廠家的說明用Zero BluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化物鋪在每升補充有100μg氨芐青霉素的2XYT瓊脂培養(yǎng)板上，在37℃生長過夜。
將白色集落挑到每升補充有100ug氨芐青霉素的3ml的2XYT培養(yǎng)基中，在37℃生長過夜。還可以遵循廠家的說明，利用QIAGENQiabotMiniprep Station(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。通過用Bam HI和Xma I進行的限制性內(nèi)切酶圖譜分析質(zhì)粒DNA以鑒定插入了纖維二糖水解酶基因的陽性克隆。一旦確認成功插入了纖維二糖水解酶基因的克隆，就利用BigDye Terminator Version 3對克隆進行測序以保證精確度，并依照廠家的說明利用ABI PRISM3700DNA分析器(Foster City，CA)進行分析。
用Bam HI和Xma I消化包含纖維二糖水解酶I基因的大腸桿菌TOPO克隆，然后利用TAE緩沖液在0.8％的瓊脂糖凝膠上分辨片段，切除1605bp的片段并遵循廠家的說明利用Amicon Ultrafree DA Centrifugal Unit(Amicon，Beverly，MA)進行純化。
用Bam HI和Xma I以相同的方式消化質(zhì)粒pENi2229以產(chǎn)生與1605bp的纖維二糖水解酶I片段相匹配的末端。利用TAE緩沖液在0.8％的瓊脂糖凝膠上分辨pENi2229消化產(chǎn)物，切除8810bp的片段并遵循廠家的說明利用Amicon UltrafreeDA Centrifugal Unit進行純化。
遵循廠家的說明利用快速DNA連接試劑盒(Rapid DNA Ligation Kit)(Roche，Indianapolis，IN)將Bam HI/Xma I纖維二糖水解酶I基因片段連接到Bam HI/Xma I消化的pENi2229中。然后遵循廠家的說明用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Sure細胞(Stratagene，La Jolla，CA)。選擇和培養(yǎng)集落，按照如上所述制備質(zhì)粒。通過利用Bam HI和Xma I進行的限制性內(nèi)切酶圖譜分析質(zhì)粒DNA以鑒定插入了纖維二糖水解酶I基因的陽性克隆。從陽性集落分離的一個質(zhì)粒被命名為pCW013(圖6)。
實施例10伴有在相同的管中選擇轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的小量轉(zhuǎn)化通過將大約2-5×107個孢子第一次接種到100ml補充有2％葡萄糖的YP培養(yǎng)基中來制備米曲霉Jal250的原生質(zhì)體。通過34℃在補充有2％葡萄糖和10mM尿嘧啶核苷的YP培養(yǎng)基上以140rpm生長米曲霉Jal250 16-18小時來制備孢子。利用無菌的真空過濾器除去培養(yǎng)基收集菌絲體。通過用100ml的0.7M的KCl再懸浮菌絲叢和真空過濾洗滌菌絲叢3次。最后，將菌絲叢再懸浮在20ml原生質(zhì)體溶液中，并將其轉(zhuǎn)入125ml的細頸瓶中，在34℃以80rpm孵育細頸瓶。原生質(zhì)體溶液由5mg/ml Glucanex(NovozymesA/S，Bagsvrd，Denmark)、0.5mg/ml殼多糖酶(Sigma，St.Louis，MO)和0.7MKCl組成。原生質(zhì)體在30和90分鐘之間開始釋放。讓原生質(zhì)體過濾通過襯砌有微孔布(MiraclothTM)(Calbiochem，La Jolla，CA)到50ml聚丙烯管中的無菌漏斗，然后在室溫下利用Sorvall RT 6000D離心機(E.I.DuPont DeNemours and Co.，Wilmington，DE)以600xg離心10分鐘。然后將沉淀小丸再懸浮在STC中，用20ml STC洗滌兩次，并依照上面的描述以2000rpm離心10分鐘使原生質(zhì)體成球狀。利用血球計對原生質(zhì)體進行計數(shù)，并將其再懸浮在STC中使最后濃度為2×107原生質(zhì)體/毫升。在Nalgene5100 Cryo1℃冷凍箱″Mr.Frosty″(Nalgene5100 Cryo 1 Freezing Container，″Mr.Frosty″)(VWR Scientific，Inc.，San Francisco，CA)中進行控速冷凍之后將原生質(zhì)體儲存在-80℃。
使用下列方法，用原生質(zhì)體進行單孔轉(zhuǎn)化。首先，15微升的米曲霉Jal250原生質(zhì)體和1ug的環(huán)狀pCW026DNA被等分分配到96孔深孔板(QIAGENInc.，Valencia，CA)的48個孔中。在該實驗中也使用了兩個對照。八個包含原生質(zhì)體但不包含DNA的孔作為對照以確定未轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體不能該M400培養(yǎng)基中生長，而且該對照也允許檢測來自成功轉(zhuǎn)化體的可能的交叉污染。另外，八個包含pCW013的孔作為轉(zhuǎn)化的陽性對照。已經(jīng)已知AMA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率比整合質(zhì)粒高大約100倍(Osheroy and May，2000，Genetics155647-656)。添加DNA到原生質(zhì)體中之后，將50ul 60％的PEG、10mMTris和10mM CaCl2添加到每個孔中，用QIAGEN氣孔帶層(QIAGENAirpore Tape Sheet)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)密封孔板，將孔板放入拉鏈小包中，在37℃孵育25分鐘。在孵育后，向每孔中加入400ulM400培養(yǎng)基。再一次用QIAGEN氣孔帶層(QIAGENAirpore Tape Sheet)(QIAGENInc.，Valencia，CA)密封孔板，將孔板放入拉鏈小包中，在34℃孵育6天。
在孵育后，以轉(zhuǎn)化體在作為轉(zhuǎn)化體的選擇性培養(yǎng)基的M400培養(yǎng)基上生長的能力為基礎(chǔ)選擇陽性轉(zhuǎn)化體。陽性轉(zhuǎn)化體具有生產(chǎn)尿嘧啶核苷的能力，尿嘧啶核苷允許他們在選擇性培養(yǎng)基上生長。如上所述，將400μl M400培養(yǎng)基直接添加到進行轉(zhuǎn)化的每個孔中。通過形成菌絲叢來檢測陽性轉(zhuǎn)化體。然后除去那些生長呈陽性的孔中的液體培養(yǎng)基，并測定纖維二糖水解酶I的表達。
實施例11高通量測定纖維二糖水解酶I轉(zhuǎn)基因的表達從實施例10的96孔深孔板的96個轉(zhuǎn)化孔中直接抽取液體培養(yǎng)基樣品到標準的96孔板中。測定來自每個孔的液體培養(yǎng)基對纖維二糖水解酶I的底物4-甲基-β-D-傘形乳糖苷(umbelliferyl lactoside)(MUL)的活性。當乳糖部分被纖維二糖水解酶切去時，甲基傘形基團會發(fā)熒光。使用了來自用空克隆載體產(chǎn)生的米曲霉轉(zhuǎn)化體的液體培養(yǎng)基作為對照。另外，從纖維二糖水解酶I的轉(zhuǎn)化體的搖瓶培養(yǎng)物中獲得的包含纖維二糖水解酶I的液體培養(yǎng)基作為附加的陽性對照。
通過添加存在于100mM，pH 5.0的琥珀酸鹽和0.01％Tween-20中的30μl的0.25mg/ml的MUL測定三十微升的米曲霉液體培養(yǎng)基。在50℃測定重復(fù)的反應(yīng)。反應(yīng)進行45分鐘，然后通過添加pH 9.5的1.5M Tris-Cl進行淬滅。利用BMG FLUOStar Galaxy熒光計(Offenburg，Germany)測量熒光(激發(fā)光360nm，發(fā)射光460nm)。從測試孔的活性中減去來自僅有載體的轉(zhuǎn)化體的液體培養(yǎng)基的活性。
在第6天，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中包含整合質(zhì)粒pCW026的65％(48個孔中有31個孔)的孔包含真菌叢。在這31個轉(zhuǎn)化體中，只有四個到第6天產(chǎn)生了看得見的孢子。沒有添加DNA的八個控制孔到第6天沒有真菌叢。具有AMA質(zhì)粒的八個轉(zhuǎn)化到第6天全部出現(xiàn)了真菌叢。
當用MUL測定時，用整合質(zhì)粒進行單孔轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的31個轉(zhuǎn)化體中有四個顯示出纖維二糖水解酶I活性。表達纖維二糖水解酶I的四個轉(zhuǎn)化體是到第6天已經(jīng)生長充分的產(chǎn)生孢子的四個相同的集落。
實施例12來自生長在96孔V形底滴定板中的真菌培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基的自動化取樣為了進行小量測定，可以在具有V形底板的96孔滴定板(例如，CostarThermowellseries titer plates，Corning，Acton，MA或MJ Research Hard-Shell？microplates，MJ Research，Waltham，MA)中生長培養(yǎng)物(120ml液體培養(yǎng)基)。34℃在M400培養(yǎng)基中生長米曲霉JaL250培養(yǎng)物5-10天。利用BiomekFx自動機的96孔移液工具(Beckman Coulter，Inc，F(xiàn)ullerton，CA)可以在孔中壓低(depresss)菌絲孔(well)?？椎腣形形狀導(dǎo)致菌絲體粘在板的底部。液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到孔的頂端。然后可以在菌絲不阻塞移液管尖端的情況下從這些孔中除去液體培養(yǎng)基。
實施例13來自96孔板中的孢子在24孔板中的自動化接種利用BiomekFx自動機Span-8移液管工具(Beckman Coulter，Inc，F(xiàn)ullerton，CA)完成從96孔多孔板接種24孔多孔板的孔(Costar 24 well cellculture cluster，Corning，Acton，MA)。將一百和二十微升無菌水儲存在如實施例10描寫的生長在96孔多孔板(100μl體積，在34℃生長5-14天)中的米曲霉JaL250菌絲叢表面。通過移液管分散存在于生長的菌絲叢頂端的孢子完成混合。來自每個孔的一百微升孢子被轉(zhuǎn)入包含1.5ml新鮮M400培養(yǎng)基的24孔板的孔中。在34℃孵育24孔板4-10天。
實施例14來自生長在24孔模式中的真菌培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基的自動取樣利用BiomekFx自動機(Beckman Coulter，Inc，F(xiàn)ullerton，CA)從實施例13的24孔培養(yǎng)平板的每個孔中除去200ml液體培養(yǎng)基，200ml樣品被轉(zhuǎn)入96孔板中(Hard-Shell96-well multiwell plates，MJ Research，Waltham，MA)。利用BeckmanBiomek Fx自動機的Span-8移液工具將生長在液體培養(yǎng)基表面上的真菌叢移到旁邊。簡單來說就是移液管的尖端將菌絲叢拖到孔的一邊以便除去液體培養(yǎng)基。
發(fā)現(xiàn)該方法能夠安全地轉(zhuǎn)移菌絲叢，這樣可以準確地從孔中移出液體培養(yǎng)基而不會發(fā)生菌絲叢阻塞移液管尖端的情況?？梢詤策@些培養(yǎng)物中除去合計達1ml的液體培養(yǎng)基。
生物材料的保藏下列生物材料已經(jīng)按照布達佩斯條約保藏在61604伊利諾斯州的Peoria的大學(xué)街1815號的農(nóng)業(yè)科研局專利菌種保藏北方區(qū)域研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center)并給出了下列登錄號保藏物登錄號 保藏日期大腸桿菌pAJO52NRRL B-30683 2003年7月29日菌株已經(jīng)在保證該專利申請在待審期間，專利商標委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122確定的人能夠獲得培養(yǎng)物的條件下保藏。保藏代表基本上純的保藏菌株培養(yǎng)物。按照國外專利法律規(guī)定保藏在提出本主題申請的副本或其子代申請的國度是有效的。但是，應(yīng)理解保藏物的可獲得性不構(gòu)成實踐本發(fā)明主題的許可而破壞政府行為授與專利權(quán)證。
本發(fā)明在這里描述和要求保護的內(nèi)容并不限于這里公開的特定方案，因為這些方案只是用于解釋說明本發(fā)明的幾個方案。規(guī)定任何等價方案都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，這里顯示和描述的方案之外的各種修飾對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說是很明顯的。這種修飾也在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在發(fā)生沖突的情況下，本發(fā)明中包含定義的公開內(nèi)容將起控制作用。
這里引用的各種參考文獻的公開內(nèi)容全部引入作為參考。
序列表<110>諾維信股份有限公司(NOVOZYMES，INC.)<120>用DNA文庫轉(zhuǎn)化和表達篩選絲狀真菌細胞的方法<130>10636.204-WO<150>60/575,600<151>2004-05-27<160>30<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1taatacgact cactataggg 20<210>2<211>1545<212>DNA<213>Trichoderma reesei<220>
<221>CDS<222>(1)..(1539)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(51)<220>
<221>mat_peptide<222>(52)..()<400>2atg tat cgg aag ttg gcc gtc atc tcg gcc ttc ttg gcc aca gct cgt 48Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg-15 -10 -5gct cag tcg gcc tgc act ctc caa tcg gag act cac ccg cct ctg aca 96Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr-1 1 5 10 15tgg cag aaa tgc tcg tct ggt ggc acg tgc act caa cag aca ggc tcc 144Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser20 25 30gtg gtc atc gac gcc aac tgg cgc tgg act cac gct acg aac agc agc 192Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser35 40 45
acg aac tgc tac gat ggc aac act tgg agc tcg acc cta tgt cct gac240Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp50 55 60aac gag acc tgc gcg aag aac tgc tgt ctg gac ggt gcc gcc tac gcg288Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala65 70 75tcc acg tac gga gtt acc acg agc ggt aac agc ctc tcc att ggc ttt336Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe80 85 90 95gtc acc cag tct gcg cag aag aac gtt ggc gct cgc ctt tac ctt atg384Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met100 105 110gcg agc gac acg acc tac cag gaa ttc acc ctg ctt ggc aac gag ttc432Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe115 120 125tct ttc gat gtt gat gtt tcg cag ctg ccg tgc ggc ttg aac gga gct480Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala130 135 140ctc tac ttc gtg tcc atg gac gcg gat ggt ggc gtg agc aag tat ccc528Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro145 150 155acc aac acc gct ggc gcc aag tac ggc acg ggg tac tgt gac agc cag576Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln160 165 170 175tgt ccc cgc gat ctg aag ttc atc aat ggc cag gcc aac gtt gag ggc624Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly180 185 190tgg gag ccg tca tcc aac aac gcg aac acg ggc att gga gga cac gga672Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly195 200 205agc tgc tgc tct gag atg gat atc tgg gag gcc aac tcc atc tcc gag720Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu210 215 220gct ctt acc ccc cac cct tgc acg act gtc ggc cag gag atc tgc gag768Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu225 230 235ggt gat ggg tgc ggc gga act tac tcc gat aac aga tat ggc ggc act816Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr240 245 250 255tgc gat ccc gat ggc tgc gac tgg aac cca tac cgc ctg ggc aac acc864Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr260 265 270agc ttc tac ggc cct ggc tca agc ttt acc ctc gat acc acc aag aaa912Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys275 280 285
ttg acc gtt gtc acc cag ttc gag acg tcg ggt gcc atc aac cga tac960Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr290 295 300tat gtc cag aat ggc gtc act ttc cag cag ccc aac gcc gag ctt ggt1008Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly305 310 315agt tac tct ggc aac gag ctc aac gat gat tac tgc aca gct gag gag1056Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu320 325 330 335gca gaa ttc ggc gga tcc tct ttc tca gac aag ggc ggc ctg act cag1104Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln340 345 350ttc aag aag gct acc tct ggc ggc atg gtt ctg gtc atg agt ctg tgg1152Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp355 360 365gat gat tac tac gcc aac atg ctg tgg ctg gac tcc acc tac ccg aca1200Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr370 375 380aac gag acc tcc tcc aca ccc ggt gcc gtg cgc gga agc tgc tcc acc1248Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr385 390 395agc tcc ggt gtc cct gct cag gtc gaa tct cag tct ccc aac gcc aag1296Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys400 405 410 415gtc acc ttc tcc aac atc aag ttc gga ccc att ggc agc acc ggc aac1344Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn420 425 430cct agc ggc ggc aac cct ccc ggc gga aac ccg cct ggc acc acc acc1392Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr435 440 445acc cgc cgc cca gcc act acc act gga agc tct ccc gga cct acc cag1440Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln450 455 460tct cac tac ggc cag tgc ggc ggt att ggc tac agc ggc ccc acg gtc1488Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val465 470 475tgc gcc agc ggc aca act tgc cag gtc ctg aac cct tac tac tct cag1536Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln480 485 490 495tgc ctgtaa 1545Cys<210>3
<211>513<212>PRT<213>Trichoderma reesei<400>3Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg-15 -10 -5Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr-1 1 5 10 15Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser20 25 30Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser35 40 45Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp50 55 60Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala65 70 75Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe80 85 90 95Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met100 105 110Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe115 120 125Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala130 135 140Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro145 150 155Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln160 165 170 175Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly180 185 190Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
195 200 205Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu210 215 220Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu225 230 235Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr240 245 250 255Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr260 265 270Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys275 280 285Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr290 295 300Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly305 310 315Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu320 325 330 335Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln340 345 350Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp355 360 365Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr370 375 380Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr385 390 395Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys400 405 410 415Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn420 425 430
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr435 440 445Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln450 455 460Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val465 470 475Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln480 485 490 495Cys<210>4<211>22<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>4gtgccccatg atacgcctcc gg22<210>5<211>26<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>5gagtcgtatt tccaaggctcct gacc26<210>6<211>24<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>6ggaggccatg aagtggacca acgg 24<210>7<211>45<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>7caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag 45<210>8<211>45<212>DNA
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>8ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg 45<210>9<211>44<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>9ctatatacac aactggattt accatgggcc cgcggccgca gatc44<210>10<211>44<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>10gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag44<210>11<211>22<212>DNA<213>Trichoderma reesei<400>11gcaacatgtat cggaagttg gc22<210>12<211>22<212>DNA<213>Trichoderma reesei<400>12aattaatttt acaggcactg ag22<210>13<211>31<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>13ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c 31<210>14<211>25<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>14ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 25
<210>15<211>26<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>15ttgaattcat gggtaataac tgatat26<210>16<211>32<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>16aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 32<210>17<211>45<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>17ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 45<210>18<211>44<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>18ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc44<210>19<211>26<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>19tctgtgaggc ctatggatct cagaac26<210>20<211>27<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>20gatgctgcat gcacaactgc acctcag 27<210>21<211>59<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400>21cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctggatcc ccagttgtg59<210>22<211>33<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>22gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat33<210>23<211>30<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>23atcggtttta tgtcttccaa gtcgcaattg30<210>24<211>33<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>24cttggaagac ataaaaccga tggaggggta gcg33<210>25<211>9<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>25ggttttatg 9<210>26<211>9<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>26gccaacatg 9<210>27<211>33<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>27gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat33
<210>28<211>67<212>DNA<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>28gcctctagat ctcccgggcg ccggcacatg taccaggtct taagctcgag ctcggtcacc 60ggtggcc 67<210>29<211>33<212>DNA<213>Humicola insolens<400>29cgcggatcca ccatgcgtac cgccaagttc gcc33<210>30<211>30<212>DNA<213>Humicola insolens<400>30gccccgggtt acaggcactg agagtaccag30
權(quán)利要求
1.表達篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)分離被引入大腸桿菌的DNA文庫的單一集落轉(zhuǎn)化體；(b)從每個單一集落的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備DNA；(c)將步驟(b)每一個DNA制備物的樣品導(dǎo)入到分離的絲狀真菌原生質(zhì)體懸浮液中以獲取絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，其中每個轉(zhuǎn)化體包含來源于DNA文庫的個體多核苷酸的一個或多個拷貝；(d)在選擇性生長培養(yǎng)基上生長步驟(c)的個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，從而允許絲狀真菌轉(zhuǎn)化體生長，同時抑制未轉(zhuǎn)化絲狀真菌的生長；和(e)測量由個體多核苷酸編碼的每個多肽的活性或特性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中DNA文庫是基因突變體文庫。
3.權(quán)利要求1的方法，其中突變基因編碼多肽變體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中由多核苷酸編碼的多肽是抗體、抗原、酶、激素或報告分子。
5.權(quán)利要求4的方法，其中酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中多肽是變體。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中絲狀真菌選自枝頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬。
8.權(quán)利要求1所述的方法，更進一步地包含(g)分離來源于DNA文庫的多核苷酸，其中多核苷酸編碼目的多肽。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中一個或多個步驟被自動化。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中每個步驟都被自動化。
11.通過權(quán)利要求8的方法獲得的編碼目的多肽的分離的多核苷酸。
12.包含權(quán)利要求11的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
13.包含權(quán)利要求11的多核苷酸的重組表達載體。
14.包含權(quán)利要求11的多核苷酸的重組宿主細胞。
15.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求14的重組宿主細胞；和(b)從培養(yǎng)基回收多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中多肽是抗體、抗原、酶、激素或報告分子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
18.權(quán)利要求15的方法，其中多肽是變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)分離被引入大腸桿菌的DNA文庫的單一集落轉(zhuǎn)化體；(b)從每個單一集落的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備DNA；(c)將步驟(b)制備的每一個DNA樣品插入到分離的絲狀真菌原生質(zhì)體懸浮液中以獲取絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，其中每個轉(zhuǎn)化體包含來源于DNA文庫的個體多核苷酸的一個或多個拷貝；(d)在選擇性生長培養(yǎng)基上生長步驟(c)的個體絲狀真菌轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基允許絲狀真菌轉(zhuǎn)化體生長，同時抑制未轉(zhuǎn)化絲狀真菌的生長；和(e)測量個體多核苷酸編碼的每個多肽的活性或特性。
文檔編號C12P21/06GK1993475SQ200580025551
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日
發(fā)明者薩拉·泰特, 邁克爾·拉姆薩, 喬爾·切里, 康尼·沃德 申請人:諾維信股份有限公司