專利名稱：：結合黑皮質素受體的擬抗體、組合物、方法和用途的制作方法結合黑皮質素受體的擬抗體、組合物、方法和用途發(fā)明領域本發(fā)明涉及結合黑皮質素受體的擬抗體、編碼這些擬抗體的多核普酸、包含所述多核苷酸或者表達所述擬抗體的細胞，和它們的制備和使用方法。
背景技術：
：肥胖癥是一種慢性疾病，表現(xiàn)為與身體大小成比例的過量脂肪量.當今，認為每三個美國人就有一個超重(體重指數(shù)(BMI)>25kg/m2)，從而促^吏美國疾病控制和預防中心(UnitedStatesCentersforDiseaseControlandPrevention)(CDC)宣布肥胖癥正達到該"餘的比例(Cummings和Schwartz,Annu,Rev.Med.54:453-471((2003))。肥胖癥是發(fā)生諸如2型糖尿病、充血性心力衰竭、骨關節(jié)炎和睡眠性呼吸暫停等疾病的潛在病因或者危險因素這一事實強調了治療肥胖癥的重要性。此外，肥胖癥與"代謝綜合征"有關，代謝綜合征是特征為肥胖、致動脈粥樣化的血脂異常、血壓升高和胰島素抗性的一種醫(yī)學狀況.代謝綜合征影響越來越多的美國人。重要的是，已經(jīng)表明即使體重的適度降低(最初體重的5-10%)也可以顯著改善代謝綜合征并且降低發(fā)生肥胖癥相關的疾病的危險因子(Wing等人，Arch.Intern.Med.147:1749-1753(1987);Tuomilehto等人，NewEngl.J.Med.344:1343-1350(2001);Knowler等人，NewEngl.JMed.346:393-403(2002);Franz等人，DiabetesCare25:148-198(2002))。此外，由于在某些文化中，社會恥辱通常與肥胖個體有關，從精神健康角度看，肥胖癥的治療也是重要的。黑皮質素受體在調節(jié)人和嚙齒動物中的總體能量平衡和肥胖癥中起重要作用。a-促黑素細胞激素(a-MSH)是13個氨基酸的肽激素，是黑皮質素系統(tǒng)的重要組分。a-MSH是由腦垂體釋放的阿黑皮素原(POMC)的蛋白酶解加工產(chǎn)生的。a-MSH以高親和力結合黑皮質素4受體(MC4R)，也以較低的親和力結合黑皮質素3受體(MC3R)4和黑皮質素5受體(MC5R)。MC4R是在腦中發(fā)現(xiàn)的G-偶聯(lián)蛋白受體，其當受a-MSH結合的刺激時，導致食物攝入減少和脂肪氧化增加。最終，刺激黑皮質素受體如MC4R引起體重減輕。在人和嚙齒類動物中，黑皮質素系統(tǒng)的不同組分中功能突變的喪失與肥胖癥和相關狀況密切相關。在小鼠中，在POMC或MC4R和MC3R內的突變產(chǎn)生肥胖癥、胰烏素抗性和飲食過多(Goodfellow和Saunders，Curr.TopicsMed.Chem.3:855-883(2003);Huszar等人，Cell88:131-141(1997);Yaswen等人，Nat.Med.5:1066-1070(1999))。在人類中，POMC或MC4R內的突變導致發(fā)生與食物攝入增加有關的肥胖癥(Krude等人，Nat.Genet.19:155-157(1998);Yeo等人，NatureGenetics20:111-112(1998);Branson等人，NewEngl.J.Med.348:1096-1103(2003);Vaisse等人，J.Clin.Invest.1(^6):253-262(2000);Ho和MacKenzie，J.Biol.Chem.275:35816-3，82(1999))。體重減輕可以由黑皮質素系統(tǒng)活性的藥理學刺激引起.在嚙齒動物中，黑皮質素受體如MC4R的藥理學刺激引起食物^t入減少、能量消耗增加和體重減輕(Pierroz等人，Diabetes51:1337-1345(2002))。在人類中，養(yǎng)內施用a-MSH以刺激非肥胖人中的MC4R導致由于脂肪減少而不是瘦體重引起的體重減輕(Fehm等人，J.Clin.gndo.Metabol.86:1144-1148(2001))。當前通過幾種不同的策略治療肥胖癥僅僅取得了有限的成功.這些策略主要包括"生活方式"改變(例如，飲食和鍛煉)、基于小分子的藥物治療或者手術除去一部分胃(胃分流術)。此外，刺激體重減輕的黑皮質素受體結合肽如a-MSH由于此類肽的極短的血清半壽期而作為藥物的用途受限，從而，需要額外的肥胖癥治療法，尤其克服黑皮質素受體結合肽如a-MSH的短的血清半壽期的黑皮質素受體結合分子.附圖簡述圖l顯示了結合黑皮質素受體的擬抗體多肽的組成部分。圖2顯示了結合黑皮質素受體的擬抗體的示意圖。圖3顯示了結合黑皮質素受體的a-MSH擬抗體的氨基酸(SEQIDNO:62)和cDNA(SEQIDNO:61)序列。各擬抗體組成部分的氨基末端部分用下劃線標出。圖4顯示了在竟爭性結合測定中，a-MSH擬抗體與MC4R的結合。圖5顯示了在表達高水平MC4R的細胞中MC4R的a-MSH擬抗體激活。圖6顯示了在表達低水平MC4R的細胞中MC4R的a-MSH擬抗體激活。圖7顯示了動物食物攝入的a-MSH擬抗體介導的降低。圖8顯示了動物體重的a-MSH擬抗體介導的降低。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面是式(I)的多肽(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮質素受體結合分子，Lk是多肽或者化學鍵，V2是免疫球蛋白可變區(qū)的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可變鉸鏈g的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，CH3是免疫球蛋白重鏈Ch3恒定區(qū)，t獨立地是l到IO的整數(shù)。本發(fā)明的另一方面是包含SEQIDNO:60或62的多肽。本發(fā)明的另一方面是包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61的多核苷酸或者與SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互補的多核苷酸。本發(fā)明的另一方面是一種多核苷酸，包含編碼SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一方面是改變細胞、組織或者器官中黑皮質素受體的生物活性的方法，其包括將本發(fā)明的擬抗體組合物與細胞、組織或者器官接觸。本發(fā)明的另一方面是調節(jié)至少一種黑皮質素受體介導的狀況的方法，其包括對需要其的患者施用本發(fā)明的擬抗體組合物。發(fā)明詳述本文中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請都完整引入本文作為參考。本發(fā)明提供了具有結合黑皮質素受體和模擬抗體免疫球蛋白分子的不同同種型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，和其任何亞類如IgAi、IgA2、IgGbIgG2、IgG3或IgG4或者其組合的性質的多肽，其在本文中一般稱作"擬抗體(mimetibody)"。在一些實施方案中，本發(fā)明的擬抗體多肽含有a促黑素細胞激素肽(a-MSH)序列并且稱作結合黑皮質素受體的a-MSH擬抗體。此類a-MSH擬抗體多肽可以結合黑皮質素受體4(MC4R)，并且以相等或者較低的親和力分別結合MC3R和MC5R。這種黑皮質素受體結合的一種結果可以是刺激或者抑制黑皮質素受體活性。刺激可以導致體重減輕而抑制可以導致體重增加。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽具有通式(I):(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮質素受體結合分子，Lk是多肽或者化學鍵，V2是免疫球蛋白可變區(qū)的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，CR3是免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)，t獨立地是l到10的整數(shù)。本文使用的"黑皮質素受體結合分子"指可以結合至少一種黑皮質素受體如人MC4R(SEQIDNO:77)的分子。其他人黑皮質素受體的實例包括MCR1(SEQIDNO:71)、MCR2(SEQIDNO:73)、MCR3(SEQIDNO:75)和MCR5(SEQIDNO:79)。給定的肽鏈是"黑皮質素受體"的條件是它與已知的黑皮質素受體序列或者已知的黑皮質素受體的成熟形式具有至少85%氨基酸序列同一性并且可以作為G-蛋白偶聯(lián)的受體。^f吏用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp"Carslbad，CA)的AlignX模塊的默認設置，通過逐對比對可以確定兩條肽鏈之間的同一性百分數(shù)。示例性黑皮質素受體結合分子是具有(SEQIDNO:2)中所示的氨基酸序列的13個氨基酸的a-MSH肽。其他黑皮質素受體結合分子包括SEQIDNO:2的生物活性片段和可以結合黑皮質素受體的其他氨基酸序列。本文使用的術語"生物活性片段"指a-MSH肽的可以結合黑皮質素受體如MC4R的部分。肽序列HFRW(SEQ.ID.NO.81)是a-MSH狀序列SYSMEHERB^GKPV(SEQIDNO:2)的示例性"生物活性片段"。已經(jīng)將HFRW片段摻入合成的黑皮質素受體激活分子melanotanII(MTII)中(Fan等人，Nature385:165-168(1997))。黑皮質素受體結合分子在本發(fā)明的擬抗體多肽中的摻入提供了以寬范圍的親和力結合黑皮質素受體。本發(fā)明的擬抗體多肽可以以小于或者等于約107、10-8、10-9、101()、10"或10-"M的Ka結合黑皮質素受體。對aMHS肽、MTII肽和aMSHMMB得到的IC50值的范圍分別為260-400nM、5-30nM和200-300nM。使用任何合適的方法，可以通過實驗測定擬抗體多肽對黑皮質素受體的親和力。此類方法可以利用Biacore或KinExA儀器操作、ELISA或者竟爭性結合測定法.通過本領域技術人員已知的技術可以從變體或者片段文庫選擇以所希望的親和力結合特定黑皮質素受體的擬抗體多肽?？梢詫哂蠸EQIDNO:2中所示氨基酸序列的a-MSH肽進行修飾以得到其他黑皮質素受體結合分子。此類修飾可以包括向肽中摻入C-Xn-C基序以通過形成二硫鍵在構象上限制肽。在C-Xn-C基序中，C是半胱氨酸殘基，X是一種氨基酸殘基并且n是實現(xiàn)構象限制必需的整數(shù)。在該情況中，n可以小至l個殘基和高至50.示例性C-[Xn-C修飾的肽序列在SEQIDNOs:4、6、8和10中顯示。修飾還可以包括向肽中摻入Wa-[Xn-Wa基序以通過形成色氨酸拉鏈在構象上限制肽.在Wa-Xn-Wa基序中，W是色氨酸殘基，X是一種氨基酸，a是整數(shù)，通常為2，但是可以為1到10,n是實現(xiàn)所需的構象限制必需的整數(shù)，在該情況中，n可以小至l個殘基和高至50,示例性Wa-Xn-Wa肽在SEQIDNOs:12、14、16和18中顯示。此外，在a-MSH肽中存在的序列HFRW(SEQIDNO:81)還可以通過用F、H、W和M的任一個替代該序列中的任一個殘基進行修飾；例如，HFRW(SEQIDNO:81)可以替代成FHWM(SEQIDNO:83)。在本發(fā)明的多肽中，接頭部分(Lk)通過允許擬抗體具有備選的取向和結合性質而提供了結構柔性。示例性接頭包括非肽化學鍵或者通過肽鍵連接的1到20個氨基酸，其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸或者其他氨基酸(例如，D-氨基酸、非天然存在的氨基酸，或者罕見的天然存在的氨基酸)。接頭部分可以包括多數(shù)不受立體位阻的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸并且可以包括GS、聚GS(例如GSGS(SEQIDNO:20))、GGSG(SEQIDNO:22)、GSGGGS(SEQIDNO:24)、GSGGGSG(SEQIDNO:26)、GSSG(SEQIDNO:28),或GSGGGS(SEQIDNO:30)或GGGS(SEQIDNO:85)或者其任一組合或者聚合物。在本發(fā)明范圍內的其他示例性接頭可以長于20個殘基并且可以包括甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸之外的殘基。在本發(fā)明的多肽中，V2是免疫球蛋白可變區(qū)如重鏈可變區(qū)的羧基末端結構域的一部分。示例性V2氨基酸序列是GTLVTVSS(SEQIDNO:32)和TLVAVSS(SEQIDNO:34)。在本發(fā)明的多肽中，Hg是免疫球蛋白可變區(qū)如重鏈可變區(qū)的鉸鏈結構域的一部分。示例性Hg氨基酸序列包括EPKSCDKTHTCPPCP(SEQIDNO:36)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQIDNO:38)、ESKYGPPCPSCP(SEQIDNO:40)、ESKYGPPCPPCP(SEQIDNO:42)、CPPCP(SEQIDNO:44)和CPSC(SEQIDNO:46)。在本發(fā)明的多肽中，CH2是免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)。示例性Ch2氨基酸序列包括APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:48)，APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:50),KCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:52)和YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:54)。在本發(fā)明的多肽中，CH3是免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。示例性Ch3氨基酸序列包括EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:56)和ALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:58)。本領域技術人員將認識到，當在某些重組系統(tǒng)中表達本發(fā)明多肽的CH3區(qū)時，可以切除其C-末端氨基酸。在本發(fā)明的擬抗體多肽中，Hg、CH2或CH3可以是IgGi或IgG4亞類的。序列是lg&或IgG4亞類的序列的條件是它分別從yl或y4重鏈形成或者發(fā)育而來。給定的肽鏈如果與給定種類的已知yl或y4重鏈序列至少80%同一，那么該肽鏈是yl或y4重鏈。使用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp.,Carslbad，CA)的AlignX模塊的默認設置，通過逐對比對可以確定兩條肽鏈之間的同一性百分數(shù).在本發(fā)明的擬抗體多肽中，Hg、Cu2或CH3可以分別是Ig&或IgG4亞類的.本發(fā)明的擬抗體還可以包含來自每個亞類的Hg、Ch2或Ch3組成部分的組合。例如，Hg可以是IgG4亞類的，而CH2和CH3是IgGi亞類的，備選地，Hg、CH2和Cu3可以都是IgGi或IgG4亞類的。多肽EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCKSLSLSPGK(SEQIDNO:65)是示例性多肽，其中Hg(SEQIDNO:65的殘基1-15)，CH2(SEQIDNO:65的殘基16-125)，和Ch3(SEQIDNO:65的殘基126-232)都是IgGi亞類的。IgGi和IgG4亞類的差別在于鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目。多數(shù)IgG類型抗體如IgGi是由兩個相同的重(H)鏈和兩個相同的輕(L)鏈組成的同型二聚體分子，通?？s寫為H2L2。從而，由于形成重鏈間二硫鍵并且IgG分子的兩個抗原結合(Fab)臂具有相同的結合特異性，這些分子對于抗原結合通常是二價的。相反，IgG4同種型重鏈在它們的鉸鏈區(qū)含有CPSC(SEQIDNO:46)基序，其能夠形成重鏈間或者重鏈內二硫鍵，即，CPSC基序中的兩個Cys殘基可以與其他H鏈(鏈間)中的對應Cys殘基形成二硫鍵，或者給定CPSC基序內的兩個Cys殘基可以相互形成二硫鍵(鏈內)。因為在鉸鏈區(qū)中具有重鏈內鍵的那些IgG4分子中HL對不相互共價結合，所以它們可以解離成HL單體，其然后與來自其他IgG4分子的HL單體重新締合，形成雙特異性異二聚體IgG4分子。體內異構酶可以促進該過程。在雙特異性IgG抗體中，抗體分子的兩個Fab"臂"差別在于它們結合的表位。將lgG4的鉸鏈區(qū)中的Ser殘基用Pro替代，導致"lgG4樣行為"，即，分子在重鏈之間形成穩(wěn)定的二硫鍵并且因此，對于與其他IgG4分子的HL交換不敏感。通過修飾參與二硫鍵形成并且存在于擬抗體多肽的Hg-CH2-CH3部分中的位點，可以使本發(fā)明的擬抗體多肽更像IgG4或更像IgGh通過除去、缺失、插入或者用其他氨基酸替代可以修飾此類位點。通常，除去或者替代二硫鍵締合的基序中存在的半胱氨酸殘基。這些位點的除去可以避免與產(chǎn)生擬抗體的宿主細胞中存在的其他含有半胱氨酸蛋白質的共價二硫鍵生成或者基于IgG4的構建體中重鏈內二硫鍵生成，而允許擬抗體Hg-CH2-CH3結構域的非共價二聚化。此類位點的修飾可以允許形成具有兩個不同的M部分的雙特異性擬抗體多肽或者防止形成此類雙特異性種類.IgGt和IgG4亞類的差別還在于它們介導補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)的能力。CDC是在補體存在下把細胞的裂解。補體激活途徑通過補體系統(tǒng)的第一種組分(Clq)與和相關抗原復合的分子的結合引起。Ig&是補體級聯(lián)和隨后的CDC活性的強的誘導劑，而lgG4幾乎沒有補體誘導活性。ADCC是細胞介導的過程，其中參與ADCC的表達Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體并隨后導致靶細胞的裂解。IgGi亞類以高親和力結合參與ADCC的Fc受體并且促進ADCC，而lgG4僅微弱地結合此類受體并且具有很小的ADCC誘導活性。IgG4激活效應物功能如ADCC的相對無能是所希望的，因為向細胞遞送擬抗體多肽而無細胞殺傷是可能的。通過改變擬抗體多肽的Hg-CH2-CH3部分中存在的參與CDC和ADCC的位點，可以修飾本發(fā)明的擬抗體多肽的CDC和ADCC活性。通過除去、缺失、插入或者用其他氨基酸替代可以修飾此類位點。在本發(fā)明的擬抗體中，參與CDC的位點，如Clq結合位點通常被除去或者修飾以減小CDC活性。此外，可以類似地修飾本發(fā)明的擬抗體中參與ADCC的Fc受體結合位點。通常，此類修飾將從本發(fā)明的擬抗體除去參與ADCC活性的Fc受體結合位點。用Ala殘基替代本發(fā)明的多肽的CH2部分中的Leu殘基是一種修飾的實例，其可以減小本發(fā)明的多肽中的ADCC活性。CH2氨基酸序列APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:52)是在殘基4和5(上面序列中)上這種Leu到Ala替代的實例。此外，可以除去VI結構域，從而切除信號肽后，肽的N-末端是游離的并且可以接近并且被酶如乙酰基轉移酶修飾。IgG4和IgGi同種型的抗體含有FcRn補救受體結合位點。FcRn補救受體通過再循環(huán)或者轉運IgG型抗體穿過內皮細胞層如體腔和血管內襯的內皮細胞層而幫助保持身體中的IgG抗體水平。FcRn補救受體通過已經(jīng)通過非特異胞飲作用進入內皮細胞的IgG并且阻止這些IgG抗體分子在細胞的溶酶體中降解來實現(xiàn)保持身體中的IgG抗體水平。這種FcRn受體活性的結果是具有FcRn結合位點的分子的血清半壽期相對于缺少這種位點的其他方面相同的分子延長了。希望本發(fā)明的擬抗體的Hg-CH2-CH3部分在CH2和CH3區(qū)的接合處含有FcRn結合位點。預期這種FcRn位點將增加本發(fā)明的擬抗體的血清半壽期以及相對于黑皮質素受體結合分子如單獨a-MSH改進其他藥物代謝動力學性質。在本發(fā)明的擬抗體中，通過氨基酸的除去、缺失、插入或者替代可以修飾或者添加FcRn位點。通常，此類修飾用于改善給定位點與FcRn的結合。人FcRn結合位點的一個實例是在Ig^和lgG4抗體中都發(fā)現(xiàn)的序列MISRTPTVLHQHNHY(SEQ.ID.NO.:69)。其他FcRn結合位點是本領域技術人員公知的。具有不同的同種型如IgG4和IgGi的抗體可以含有糖基化位點。這些位點的糖基化可以改變抗體分子的性質和活性。抗體分子可以是N-糖基化的或者O-糖基化的。含有氮原子的抗體氨基酸殘基側鏈(例如，Asn)的N-糖基化可以通過對N-糖基化的抗體分子賦予細胞溶解活性而調節(jié)抗體Fc效應物功能，如ADCC。這種與細胞溶解活性有關的ADCC導致此類N-糖基化的抗體實現(xiàn)的細胞的裂解。備選地，通過修飾含有氧原子的氨基酸殘基側鏈(例如，Ser或Thr)可以O-糖基化抗體分子。O-糖基化可以通過增加O-糖基化的抗體分子從血清的凝集素介導的清除而縮短抗體分子的血清半壽期。此外，O-糖基化可以由于不同抗體分子之間O-糖基化的不同程度而導致抗體異質性的不希望的增加。最后，O-糖基化和N-糖基化都可以改變抗體分子的依賴結構的性質，如結合親和力和免疫原性。像它們模擬的抗體分子一樣，本發(fā)明的擬抗體多肽還可以通過N-糖基化和O-糖基化在翻譯后修飾。在多數(shù)情況下，希望限制本發(fā)明的擬抗體的N-糖基化以減小細胞溶解活性。通過除去或者替代通常N-糖基化的氨基酸殘基如Asn，可以限制N-糖基化.還希望限制擬抗體O-糖基化以降低凝集素介導的清除、擬抗體異質性和依賴結構的擬抗體性質如結合親和力和免疫原性的改變。減小本發(fā)明的擬抗體中O-連接的糖基化的一種途徑是將本發(fā)明多肽的V2部分中的Thr殘基用Ala殘基替代.V2氨基酸序列TLVAVSS(SEQIDNO:34)是這種Thr替代為Ala的例子；該具體的V2替代還可以通過在SEQIDNO:62的47位上Thr替代為Ala得到。本領域技術人員將認識到控制N-連接的和O-連接的糖基化包括調節(jié)糖基化酵活性的其他方法。本發(fā)明的擬抗體多肽的單體結構Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3可以連接到"t"個其他單體，其中t是l到10的整數(shù)。此類連接可以通過非共價相互作用或者共價連接如Cys-Cys二硫鍵發(fā)生.以這種方式，可以形成本發(fā)明多肽的多聚體結構如二聚體和更高級的多聚體.預期本發(fā)明的多肽的二聚化將增加這些多肽對黑皮質素受體如MC4R的親和力.本文使用的術語"多聚體"指具有四級結構并且通過兩個或多個亞單位締合形成的分子.本發(fā)明的多肽可以任選在氨基末端包含免疫球蛋白可變區(qū)的氨基末端部分，稱作V1，如式II所示(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)示例性VI氨基酸序列包括QIQ和QVQ。本發(fā)明的多肽還可以包含促進蛋白質分泌所需的分泌信號或者細胞中蛋白質運輸所需的其他信號。示例性分泌信號序列是MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQIDNO:69)。本領域技術人員將認識到其他分泌信號。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:60或62。SEQIDNO:62代表通式(II)的結合(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)黑皮質素受體的a-MSH多肽，其具有融合到它的氨基末端的分泌信號MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQIDNO:69)。SEQIDNO:60代表通式(I)的結^(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3h)黑皮質素受體的a-MSH多肽。在SEQIDNO:60中不存在分泌信號。本發(fā)明的另一方面是多核苷酸，其包含與編碼至少一種結合黑皮質素受體的擬抗體互補或者具有顯著同一性的多核苷酸.本發(fā)明的其他方面包括載體，其包含編碼結合黑皮質素受體的擬抗體的至少一種多核香酸分子。在不同的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的載體的細胞或者表達本發(fā)明的擬抗體多肽的細胞。所述多核苷酸、載體和細胞可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的擬抗體多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61或者與SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互補的多核苷酸。SEQIDNO:59是編碼通式(I)的結合(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)w黑皮質素受體的a-MSH多肽的cDNA，其缺少信號序列。SEQIDNO:61是通式(II)的編碼結合(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)的黑皮質素受體的a-MSH多肽的cDNA，其具有融合在它的氨基末端的分泌信號。在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含編碼SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。編碼SEQIDNO:60或SEQIDNO:62中顯示的多肽序列的示例性核酸序列分別在SEQIDN059或SEQIDNO:61中顯示。還提供了與上述多核苷酸基本同一的多核苷酸。在多核苷酸的上下文中術語"基本同一"指給定多核苷酸序列與本發(fā)明的多核苷酸序列或者其部分在至少60%或者至少70%或者至少約80%或者至少約90%或者至少約95-98%的核苷酸同一。使用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp"Carslbad，CA)的AlignX模塊的默認設置，通過逐對比對可以確定兩條多核苷酸序列之間的同一性百分數(shù)。通常，本發(fā)明的多核苷酸用于表達載體中用來制備本發(fā)明的擬抗體多肽。在本發(fā)明范圍內的載體提供了真核生物表達的必要元件并且包括病毒啟動子驅動的載體，如CMV啟動子驅動的載體，例如，pcDNA3.1、pCEP4，和它們的衍生物、桿狀病毒表達載體、果蠅表達載體，和哺乳動物基因啟動子如人Ig基因啟動子驅動的表達載體。其他實例包括原核生物表達載體，如T7啟動子驅動的載體，例如，pET41、乳糖啟動子驅動的載體和阿拉伯糖基因啟動子驅動的載體。本發(fā)明還涉及表達本發(fā)明的擬抗體或者包含本發(fā)明的載體的細胞。此類細胞可以是原核細胞或真核細胞。示例性真核細胞是哺乳動物細胞，如但不限于，COS-l、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC誦1、HepG2、653、SP2/0、NSO、293、HeLa、骨髄瘤、淋巴瘤細胞或者其任何衍生物。最優(yōu)選地，真核細胞是HEK293、NSO、SP2/0或CHO細胞。大腸桿菌是示例性原核細胞。根據(jù)本發(fā)明的細胞可以通過轉染、細胞融合、永生化或者本領域公知的其他方法產(chǎn)生.轉染到細胞中的多核苷酸可以是染色體外的或者穩(wěn)定整合到細胞的染色體中。通過修飾多肽的Hg-CH2-CH3部分，可以使本發(fā)明的擬抗體與給定宿主細胞更相容。例如，當本發(fā)明的擬抗體在細菌細胞如大腸桿菌中重組表達時，通過大腸桿菌酶脯氨酸亞氨基肽酶可以除去Hg元件中的Pro-Ala序列以防止消化。類似地，可以缺失Hg元件的部分或者用本發(fā)明的擬抗體中的其他氨基酸替代以防止所選的宿主細胞中表達的產(chǎn)物中的異質性。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生擬抗體多肽的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的細胞并純化所表達的本發(fā)明的擬抗體多肽的步驟。細胞組分，如體外轉錄和翻譯必需的那些組分也可以用于表達本發(fā)明的多肽。本發(fā)明包括通過兩種方法產(chǎn)生的擬抗體。通過本領域公知的方法可以從基于細胞或者細胞組分的系統(tǒng)回收并純化所表達的擬抗體多肽，所述方法包括但不限于，蛋白A純化、硫酸銨或者乙醇沉淀、酸提取、陰離子或者陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。高效液相層析(HPLC)也可以用于純化。通常的純化將需要幾種不同方法的組合。本發(fā)明的另一方面是藥物組合物，其包含有效量的至少一種擬抗體多肽和可藥用載體或者稀釋劑。術語"有效量"通常指有效治療，即治療所針對的癥狀或者病癥的部分或者完全緩解所必需的擬抗體的量。組合物可以任選包含用于治療肥胖癥和下文描述的其他狀況的至少一種其他化合物、蛋白質或者組合物。組合物中的可藥用載體或者稀釋劑可以是溶液劑、混懸劑、乳劑、膠體或者粉劑。本領域技術人員將認識到其他可藥用載體和稀釋劑。本發(fā)明的另一方面是改變細胞、組織或者器官中黑皮質素受體的生物活性的方法，其包括將本發(fā)明的藥物組合物與所述細胞、組織或者器官接觸。該方法可以用于改變腦、腦組織或者腦細胞中的黑皮質素受體活性。備選地，本發(fā)明的方法可以用于改變其他外周細胞或者組織如肌肉或者其他器官如胃中的黑皮質素受體活性。本領域技術人員將認識到可以使用的其他細胞、組織或者器官。本發(fā)明的另一方面是調節(jié)至少一種黑皮質素受體介導的狀況的方法，其包括對有需要的患者施用本發(fā)明的藥物組合物?？梢砸匀我缓线m的途徑施用本發(fā)明的藥物組合物，此類途徑可以是鞘內的、鼻內的、外周(例如，皮下、肌內、皮內、靜脈內)或者通過本領域中已知的任何其他方法.如前面描述，異常的黑皮質素受體活性與許多病理狀況，如肥胖癥和2型糖尿病有關。本發(fā)明的擬抗體多肽還可以用于調節(jié)其他黑皮質素受體介導的狀況，如男性和女性勃起機能障礙、炎癥、充血性心力衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥、神經(jīng)損傷、感染性疾病、肺部疾病、皮膚疾病、發(fā)熱和疼痛.本發(fā)明還參考下面的實施例進一步描述。這些實施例僅僅說明本發(fā)明的方法并且不意在作為本發(fā)明的限制.實施例1oc-MSH擬抗體和表達載體構建設計了a-MSH擬抗體蛋白質，其包含分泌信號序列、a-MSH肽序列、接頭序列、Vh序列、鉸鏈序列、人IgGiCH2序列和人Ig^CH3序列(圖3和SEQIDNO,62)。分析數(shù)據(jù)，例如質譜法證實產(chǎn)生了成熟多肽(對于G1/G1形式，61,344.6)。使用標準分子生物學技術產(chǎn)生了編碼該a-MSH擬抗體蛋白質的核酸序列(圖3;SEQIDNO:61)。將編碼a-MSH擬抗體序列的核酸序列亞克隆到p2389表達載體中以產(chǎn)生a-MSH擬抗體表達載體(SEQIDNO:63)。實施例2oc-MSH擬抗體表達a-MSH擬抗體在HEK293E細胞中瞬時表達。使用標準條件培養(yǎng)細胞并l吏用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)如生產(chǎn)商教導的用a-MSH擬抗體表達栽體瞬時轉染。轉染后24h，將細胞轉移到無血清的培養(yǎng)基制劑中并培養(yǎng)5天。然后除去培養(yǎng)基并離心除去殘渣。將澄清的培養(yǎng)基與蛋白A-Sq>haroseTM(HiTraprProteinAFF，AmershamBiosciencies，Piscataway，NJ)溫育并如生產(chǎn)商教導的從蛋白A-SepharoseTM綴合物洗脫蛋白質，然后通過SuperoseTM12大小排阻層析(Superose1210/300GL，AmershamBiosciencies,Piscataway,NJ)使用標準方法進一步純化洗脫的蛋白質溶液。然后將柱洗脫液進行SDS-PAGE并通過銀染和考馬斯藍染色顯色。然后制備蛋白質印跡并將印跡用Fc特異性一級抗體或者a-MSH特異性一級抗體檢測?？傊?，蛋白質印跡和SDS-PAGE染色結果表明已經(jīng)從瞬時轉染的HEK293細胞得到了由兩條多肽鏈組成的純化的a-MSH擬抗體。實施例3a-MSH擬抗體結合MC4Ra-MSH擬抗體結合MC4R并且可以與放射標記的[Nle(4)，D-Phe(7)-a-MSH(NDP-a-MSH)激動劑分子竟爭MC4R結合(圖4)。MC4R是a-MSH的受體。通過竟爭結合測定法檢查結合到HEK293細胞膜(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA)中重組表達的MC4R的a-MSH，在該測定法中，將增加量的未標記的MC4R激動劑(陽性對照)和人抗體的Fc結構域(陰性對照)加入到含有[^1-NDP-a-MSH的測定混合物中，如圖4所示，未標記的MC4R激動劑是melanotanII(MTII;—種aMSH類似物)、a-MSH和NDP-a-MSH。在PBS(磷酸緩沖鹽水)中41C、-20TC,和-80TC保存兩周后結合MC4R的a-MSH擬抗體是穩(wěn)定的，如通過竟爭結合測定法評定。4吏用ScintillationProximityAssays斷閃爍親近測定'法XAmershamBiosciencesCorp,Piscataway,NJ)如測定法生產(chǎn)商所教導的進行竟爭結合測定法。測定混合物含有EC80即約0.5nM的[^I-NDP-a-MSH，0.1jigMC4R膜，lmMMgS04，1.5mMCaCl2，25mMH印es，0.2%BSA，1mMl，lO-phenthroline，測定法生產(chǎn)商推薦量的蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnosticsCorp"Indianapolis,IN)和SPA珠，用PackardTopCountNXTInstrument(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA)測量從ScintillationProximityAssay(閃爍親近測定法)珠的光發(fā)射5分鐘。實施例4a-MSH擬抗體激活MC4Ra-MSH擬抗體可以激活MC4R信號傳遞以增加表達MC4R的CHOKl細胞中的cAMP產(chǎn)生(圖5和圖6)。MC4R是7次跨膜(7TM)G蛋白偶聯(lián)的受體。配體或者激動劑對MC4R的激活導致環(huán)狀AMP水平(cAMP)的升高。使用用MC4R表達栽體穩(wěn)定轉染并且表達MC4R的兩種不同的克隆CHOKl細胞系進行MC4R受體激活測定.克隆l(圖5)相對于克隆2(圖6)以高水平表達MC4R。使用標準培養(yǎng)條件，克隆1和克隆2細胞作為單層生長到約100，000細胞/孔的密度，然后與增加量(0-100pM)的a-MSH、MTII或者a-MSH擬抗體溫育15分鐘，如圖5和圖6中指出。然后裂解細胞并使用cAMP-ScreenDirectTM化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(ChemiluminescentImmunoassaySystem)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)如生產(chǎn)商的教導進行cAMP測定。使用克隆l(圖5)和克隆2(圖6)，來自cAMP測定的ECso值在下表l中列出。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例5oc-MSH擬抗體施用減少動物食物攝入和體重對褐家鼠(Rattusnorvegicus)腦室施用a-MSH擬抗體以減少動物食物攝入(圖7)和體重(圖8)。經(jīng)由手術插入左側腦室的導管通過腦室內注射(ICV)對腦室施用a-MSH擬抗體。將導管手術插入體重為250g到350g的雄性Sprague-Dawley或Wistar大鼠。導管放置坐標如下距離前囟點-0.8mm，-4.5mm腹側和-1.5后側-前側。手術后動物恢復7到10天。通過每日處理或者偽注射使動物習慣實驗步驟，以便減小應激。此外，對動物進行反復的暗-光周期。通過血管緊張肽II測試證實正確的導管放置。如果通過導管ICV施用10ng血管緊張肽II導致大鼠在30分鐘內飲水5-10ml，那么該測試證實正確的導管放置。僅通過該血管緊張肽II測試的動物用于食物攝入實驗中。動物禁食18-24小時，然后通過導管以9lul/min的注射速率對腦室施用a-MSH擬抗體、a-MSH(陽性對照)或者PBS(陰性對照)。每個治療組具有最少7只動物。治療和劑量如圖7和圖8中指出。注射后對動物給予食物和水。注射后0h、4h、24h、48h和72h測量消耗的食物和水的量(圖7)。如圖6中所示在注射后72小時測量體重.現(xiàn)在完整描述了本發(fā)明，本領域技術人員將理解可以對其做出許多修改和修飾而不背離所附權利要求的精神或范圍。權利要求1.根據(jù)式(I)的多肽(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮質素受體結合分子，Lk是多肽或者化學鍵，V2是免疫球蛋白可變區(qū)的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，CH3是免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)，t獨立地是1到10的整數(shù)。2.權利要求l的多肽，其中M是SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16或18的生物活性片段。3.權利要求l的多肽，其中M具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16或18中顯示的氨基酸序列.4.權利要求l的多肽，其中該多肽結合至少一種黑皮質素受體。5.權利要求4的多肽，其中所述黑皮質素受體是黑皮質素4受體。6.包含SEQIDNO:60或62的多肽。7.編碼根據(jù)權利要求l到6任一項的多肽的多核苷酸.8.包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61的多核苷酸或與SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互補的多核苷酸。9.多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。10.包含權利要求8或9的多核苷酸的載體。11.權利要求10的載體，其包含SEQIDNO:63。12.細胞，其表達權利要求l到6任一項的多肽。13.包含權利要求10的載體的細胞。14.權利要求13的細胞，其中該細胞是HEK293衍生的細胞。15.產(chǎn)生多肽的方法，其包括培養(yǎng)權利要求12的細胞并純化所表達的多肽的步驟。16.藥物組合物，其包含有效量的至少一種根據(jù)權利要求1到6任一項的多肽和可藥用栽體或者稀釋劑。17.改變細胞、組織或者器官中黑皮質素受體的生物活性的方法，其包括將權利要求16的藥物組合物與所述細胞、組織或器官接觸。18.調節(jié)至少一種黑皮質素受體介導的狀況的方法，其包括對有需要的患者施用權利要求16的藥物組合物。19.權利要求18的方法，其中黑皮質素受體介導的狀況是肥胖癥。全文摘要公開了結合黑皮質素受體的擬抗體多肽。還公開了編碼這些多肽的多核苷酸、包含這些多核苷酸或者表達所述擬抗體的細胞，和制備和使用它們的方法。文檔編號C12N15/62GK101437540SQ200580044790公開日2009年5月20日申請日期2005年10月25日優(yōu)先權日2004年10月25日發(fā)明者J·羅,K·奧奈爾,M·坎寧安,V·斯托亞諾維克-蘇蘇利克,沖黃申請人:森托科爾公司