專利名稱：：用于在原代免疫細(xì)胞中表征糖皮質(zhì)激素受體配體的反式激活和反式阻抑活性的方法用于在原代免疫細(xì)胞中表征糖皮質(zhì)激素受體配體的反式激活和反式阻抑活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于通過原代免疫細(xì)胞中的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析表征糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體的反式激活和反式阻抑活性的方法。在臨床實(shí)踐中最常用的藥物包括糖皮質(zhì)激素。它們對(duì)炎癥和免疫系統(tǒng)以及對(duì)代謝具有重要作用。各種作用通過經(jīng)糖皮質(zhì)激素受體(GR)的不同機(jī)制介導(dǎo)。選擇性糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體代表新一類GR配體，其選擇性地激動(dòng)或拮抗地影響基因調(diào)節(jié)的GR機(jī)制、基因的反式激活和反式阻抑。GR配體的反式激活活性與反式阻抑活性的分離或者GR配體的激動(dòng)作用與拮抗作用的分離是可能的。在這方面，GR配體的治療譜將會(huì)選擇性地受到影響。為了就反式激活和反式阻抑活性而言體外表征GR配體，目前使用人和動(dòng)物細(xì)胞系，在某些情況下它們是經(jīng)啟動(dòng)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的。在這些細(xì)胞系中研究GR作用的選擇的個(gè)別方面。此外，為了檢測(cè)GR配體的相應(yīng)活性，常常需要刺激細(xì)胞。從細(xì)胞系中的這些測(cè)定的結(jié)果得出關(guān)于原代細(xì)胞中GR配體的作用以及特別是關(guān)于人系統(tǒng)的結(jié)論的可能性只是非常有限的。一方面，為了就分子機(jī)制而言在體內(nèi)表征GR配體，使用功能測(cè)試。這方面的實(shí)例是當(dāng)炎癥被觸發(fā)時(shí)施用GR配體或者在喚醒代謝性應(yīng)激時(shí)或在施用代謝調(diào)節(jié)激素之后檢測(cè)GR配體的作用。在人體研究中，這種方法與較多問題相關(guān)或者是不可行的。另一方面，在試驗(yàn)條件下，在提取的靶器官或器官樣品中直接檢測(cè)GR配體介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)。這種方法對(duì)于人體研究一般是不可能的?；诂F(xiàn)有測(cè)定法的以上提及的、明顯的局限，期望開發(fā)下述測(cè)定法，其l)對(duì)于表征原代細(xì)胞中的GR配體作用具有更大的相關(guān)性和2)可以被用于在人體研究中表征GR配體的分子機(jī)制而不產(chǎn)生明顯應(yīng)激。想法是確定原代免疫細(xì)胞中的反映GR配體在它們的調(diào)節(jié)中的反式激活和反式阻抑活性的基因。為此，在用選擇性GR配體的篩選中選擇基因，所述選擇性GR配體在未受刺激的人外周血原代免疫細(xì)胞中具有確定的反式激活和反式阻抑活性，所述基因以快速、可重復(fù)和一致的方式反映該物質(zhì)在抑制或誘導(dǎo)基因表達(dá)方面的反式激活或反式阻抑活性。在劑量/作用和動(dòng)力學(xué)研究中進(jìn)一步表征所述選擇性GR配體對(duì)所選基因的調(diào)節(jié)。動(dòng)物模型中的動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)在體內(nèi)條件下基因調(diào)節(jié)的重復(fù)性。已經(jīng)證實(shí)IL-1(3、IL-8、Rantes以及特別是TNF-a基因表達(dá)的抑制特別適用于在未受刺激的原代免疫細(xì)胞中檢測(cè)GR配體的反式阻抑活性。已經(jīng)證實(shí)谷氨酰胺合成酶和GILZ表達(dá)的誘導(dǎo)以及非常特別是CD163和FKBP51表達(dá)的誘導(dǎo)特別適用于檢測(cè)反式激活活性。利用所述參數(shù)，可能表征選擇性GR配體或標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素在體外和在體內(nèi)施用后對(duì)GR的反式激活或反式阻抑活性的激動(dòng)和拮抗效應(yīng)。這些參數(shù)用于表征GR配體的分子機(jī)制的用途是新的。可以從使用未受刺激的原代免疫細(xì)胞中的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析來檢測(cè)GR配體的分子機(jī)制預(yù)期以下優(yōu)點(diǎn)1)原代免疫細(xì)胞是與GR配體在生物中的活性有很大相關(guān)性的非人工細(xì)胞系統(tǒng)。2)檢測(cè)未受刺激的原代免疫細(xì)胞中的參數(shù)避免可能歪曲參數(shù)和不能反映生物中狀況的刺激的必要性。3)研究證實(shí)所述原代免疫細(xì)胞中的參數(shù)以快速、劑量依賴性、可重復(fù)和一致的方式反映在體外添加后和在體內(nèi)給藥后GR配體的分子機(jī)制。4)在未受刺激的原代人免疫細(xì)胞上獲得的體外結(jié)果和在GR配體體內(nèi)給藥后的動(dòng)物試驗(yàn)研究中獲得的結(jié)果之間非常好的一致使得非常有可能將確定的參數(shù)應(yīng)用于人體體內(nèi)研究。5)未受刺激的原代免疫細(xì)胞中參數(shù)的可檢測(cè)性也允許直接測(cè)定用GR配體處理的生物的血樣中的參數(shù)。因此，容易得到用于體內(nèi)研究的研究材料。6)可以在用GR配體處理的生物的血樣中測(cè)定所述參數(shù)，而不引起取血方面的額外應(yīng)激。用于給藥相應(yīng)的GR配體和用于取血的額外干預(yù)不是必需的。用于研究的絕對(duì)必需的血液體積少于1毫升。7)可以在全血測(cè)定法中檢測(cè)所述參數(shù)，因此不發(fā)生例如細(xì)胞分離造成的結(jié)果損害。在這方面，可以得到可商購(gòu)的檢測(cè)系統(tǒng)。8)所述未受刺激的原代免疫細(xì)胞中參數(shù)的檢測(cè)可以被用于試驗(yàn)性的體外和體內(nèi)研究以及用于I期和臨床研究。在這方面，在GR配體的發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和臨床使用中，GR配體分子機(jī)制的參數(shù)一致是可能的。9)所述參數(shù)適用于在人體研究中作為用于表征GR配體的體內(nèi)分子機(jī)制的生物標(biāo)記物。10)被選擇的反式阻抑參數(shù)(抑制IL-1|3、IL-8、Rantes以及特別是TNF-oc炎癥介質(zhì)的表達(dá))還允許表征GR配體的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。11)因?yàn)榉词郊せ詈头词阶枰只钚詻Q定性地決定GR配體在生物中的作用，因此表征外周血的未受刺激的原代免疫細(xì)胞中確定的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)參數(shù)可以幫助甚至在早期研究以及甚至在健康人(例如I期研究)中獲得體內(nèi)分子機(jī)制的信息，從而獲得期望的GR配體的作用/副作用譜。本專利中的原代免疫細(xì)胞均為活生物的免疫細(xì)胞。具體地指血液、骨髓和淋巴器官(例如胸腺、脾、淋巴結(jié)、派伊爾淋巴集結(jié)(Peyer，splaque))中的免疫細(xì)胞。血液中的免疫細(xì)胞是非常特別優(yōu)選的。方法原理本發(fā)明描述了通過分析原代免疫細(xì)胞中GR敏感基因的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)表征糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體(標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素和選擇性GR配體)的分子機(jī)制。選擇性GR配體代表新一類GR配體，其不同程度地采用基因表達(dá)的GR介導(dǎo)的調(diào)節(jié)、敏感基因的反式激活或反式阻抑兩種機(jī)制。它們可以是相應(yīng)機(jī)制的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、部分拮抗劑和拮抗劑。對(duì)應(yīng)于GR介導(dǎo)的抗炎、免疫抑制和代謝作用，選擇性GR配體的適應(yīng)癥可以是例如炎性疾病或具有改變的代謝活性的病癥。對(duì)于這樣的新GR配體的發(fā)現(xiàn)、成功開發(fā)和臨床使用而言，基本要求是表征其在相關(guān)體外和體內(nèi)試驗(yàn)以及在I期和人體臨床研究中的分子機(jī)制。在試驗(yàn)性體外或體內(nèi)研究以及在I期和人體臨床研究中，所述方法的目的是通過未受刺激的免疫細(xì)胞、淋巴器官和血液中基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)或蛋白質(zhì)釋放的改變表征選擇性GR配體和標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素的反式阻抑和反式激活活性。為此，在從50多個(gè)基因的篩選中選擇參數(shù)，并進(jìn)行更為詳細(xì)的分析?；具x擇標(biāo)準(zhǔn)是l)基因調(diào)節(jié)與選擇性GR配體的反式阻抑或反式激活活性之間的相關(guān)性，2)在未受刺激的原代免疫細(xì)胞中的一致基因調(diào)節(jié)，和3)在體外測(cè)定中的快速反應(yīng)以及在體內(nèi)給藥GR配體后良好和持久的可檢測(cè)性。這些標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于所述參數(shù)用作生物標(biāo)記物是基本的。在體外檢測(cè)和離體檢測(cè)中，已經(jīng)證實(shí)促炎IL-lf3、IL-8、Rantes以及特別是TNF-oc細(xì)胞因子的抑制都特別適用于表征反式阻抑活性，且已經(jīng)證實(shí)谷氨酰胺合成酶和GILZ的誘導(dǎo)以及非常特別是CD163和FKBP51的誘導(dǎo)特別適用于反式激活活性。其他合適的參數(shù)是用于檢測(cè)反式阻抑的共輔助分子(co-accessoiymolecules)(HLA-DR、CD86)的表達(dá)和用于檢測(cè)反式激活活性的細(xì)胞因子受體(IFN畫yRl、TNF-R1、IL-1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR)及其他基因(P2-腎上腺素受體、血紅素加氧酶1(hemoxygenase1)、IL-2、MIF、膜聯(lián)蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白l)的表達(dá)?？梢酝ㄟ^用于mRNA檢測(cè)的方法(例如定量實(shí)時(shí)PCR)和/或用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法(例如連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)、免疫測(cè)定法、蛋白質(zhì)印跡)在原代免疫細(xì)胞中進(jìn)行對(duì)所述參數(shù)的表達(dá)調(diào)節(jié)的檢測(cè)?？梢栽谂囵B(yǎng)物上清液、血清、血漿和其他生物液體中檢測(cè)所分泌的蛋白。所述檢測(cè)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，此外，它們?cè)诩夹g(shù)文獻(xiàn)中有充分描述，因此它們的實(shí)施是可能的。下面基于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素潑尼松龍以及ScheringAG的兩種選擇性GR激動(dòng)劑(SEGRA)的表征闡述所述方法的適用性。所述物質(zhì)在用于GR的激動(dòng)或拮抗反式激活和反式阻抑活性的常用測(cè)定法中的不同機(jī)制與所選基因在原代人免疫細(xì)胞及物質(zhì)處理過的小鼠脾細(xì)胞的體外測(cè)定法中的表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān)。用于GR配體介導(dǎo)的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)節(jié)的測(cè)定法可以被用于檢測(cè)物質(zhì)對(duì)GR的反式激活或反式阻抑機(jī)制的競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性激動(dòng)和拮抗活性。對(duì)于后者，研究了對(duì)另一種加入的GR配體的作用的拮抗。在體內(nèi)試驗(yàn)中，還可以表征對(duì)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用的拮抗。所示的方法適用于表征GR配體在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中以及在I期和人體臨床研究的生物標(biāo)記物測(cè)定法中的分子機(jī)制。1.內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的調(diào)節(jié)和作用1.1內(nèi)源性糖皮質(zhì)^[素的調(diào)節(jié)健康成人的腎上腺每天產(chǎn)生40-80pmol(15-30mg;8-10mg/n^)的內(nèi)源性可的松。血漿濃度由游離皮質(zhì)醇的分泌、滅活速率和形成決定，并且顯示清晰的晝夜節(jié)律曲線。通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸調(diào)節(jié)腎上腺可的松生成來控制該晝夜節(jié)律周期、與自律神經(jīng)系統(tǒng)和與生理及情緒應(yīng)激的相互作用以及與低血糖和全身炎癥的反應(yīng)。由上述刺激觸發(fā)的下丘腦"促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素"(CRH)誘導(dǎo)垂體產(chǎn)生"促腎上腺皮質(zhì)激素"(ACTH)，其通過刺激腎上腺皮質(zhì)來增加可的松合成。在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的框架內(nèi)，全身增加的糖皮質(zhì)激素水平抑制CRH合成和ACTH釋放。機(jī)體中內(nèi)源性和醫(yī)源性糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)不僅依賴于可的松血漿水平。它們另外受酶系統(tǒng)11P-羥基類固醇脫氫酶(11(3-HSD)的兩種同工型的調(diào)節(jié)。11(3-HSDI催化無(wú)生物學(xué)活性的可的松轉(zhuǎn)化成活性皮質(zhì)醇。相反，lip-HSDII支持活性皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的可的松。該系統(tǒng)主要位于肝，但是也位于其他組織如脂肪組織(Tomlinson,J.W.;iev.2004,25:831)。1.2.糖皮質(zhì)激素經(jīng)GR的作用機(jī)制糖皮質(zhì)激素的作用經(jīng)糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)/傳遞。GR屬于核心受體蛋白質(zhì)家族，所述核心受體在與作為轉(zhuǎn)錄因子的它們的相應(yīng)配體結(jié)合之后被活化，并對(duì)特定耙基因的表達(dá)有影響。所述配體與存在于所述細(xì)胞的細(xì)胞漿中的GR結(jié)合誘導(dǎo)受體構(gòu)象的變化，其進(jìn)而導(dǎo)致現(xiàn)在結(jié)合了配體的GR易位到細(xì)胞核內(nèi)。在那里，活化GR能夠?qū)λ霭一虻谋磉_(dá)產(chǎn)生正面或負(fù)面影響。在基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)(反式激活)中，所述GR作為同二聚體與敏感基因啟動(dòng)子中的特定序列(糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件，GRE)結(jié)合。體外和體內(nèi)突變分析表明GR的二聚是反式激活的必要條件(Reichardt，H.M.，Ce//.1998,93:531;Heck,S.,五細(xì)OJ1994,13:4087)。但是，根據(jù)最近的認(rèn)識(shí)，必須要限制性地指出，許多但是并非所有GR誘導(dǎo)的反式激活過程都依賴于所述受體的二聚(RogatskyI,尸^4S2003,100:13845)。被配體活化的GR也能夠抑制特定靶基因的表達(dá)(反式阻抑)。負(fù)調(diào)節(jié)的最常見機(jī)制是通過活化GR作為單體與已經(jīng)結(jié)合于DNA的其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來進(jìn)行。通過這種結(jié)合，所述其他轉(zhuǎn)錄因子的活性受到抑制，并因此也抑制耙基因的表達(dá)。在基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)的另一機(jī)制中，進(jìn)行活化GR與所謂的負(fù)GRE的結(jié)合，所述負(fù)GRE可見于幾個(gè)基因的啟動(dòng)子中。在這方面，通過GR的結(jié)合，導(dǎo)致對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子的替換，所述其他轉(zhuǎn)錄因子是誘導(dǎo)所述基因表達(dá)必不可少的。因此，所述GR與所述nGRE的結(jié)合阻止相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。另外，GR能夠以抑制方式抓住特定信號(hào)傳遞途徑中的MAP激酶，并通過這種方式介導(dǎo)其效應(yīng)。1.3重要的GK作用和機(jī)制糖皮質(zhì)激素控制許多生理過程，如葡萄糖平衡的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)和脂肪代謝。在許多這些生理過程中，糖皮質(zhì)激素通過對(duì)所涉及的蛋白質(zhì)/酶的表達(dá)施加影響而發(fā)揮作用(Wang,M.，M/化Meto6.(Zo"力.2005,2:3)。糖皮質(zhì)激素增加肝特異性磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及葡萄糖-6-磷酸酶表達(dá)的程度。也誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4的表達(dá)。(Imai，E.，Mo/.Ce〃.5/。/.19卯，10:4712;Schmoll，D.，1996,383:63;Lin，B.，DA^Ce〃Sz'o/.1998,17:967;Grosfeld，A.,D/W"o/ogz'a2002,45:527)。通過糖皮質(zhì)激素增強(qiáng)的例如酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)(Becker等人，1986;Jantzen等人，1987)、谷氨酰胺合成酶或色氨酸加氧酶(Becker，P.B.,A/<^we1986,324:686;Schmid,E.,/說oc/ie附.1987,165:499;Danesch,U.,五MBOJ:1987,6:625;Gaunitz，F(xiàn).,Commw".2002,296:1026)的表達(dá)導(dǎo)致氨基酸代謝增加，其保證生物在饑餓狀況下的能量供應(yīng)。糖皮質(zhì)激素對(duì)脂肪平衡的干預(yù)也通過調(diào)節(jié)一些參與所述脂肪平衡的蛋白質(zhì)/酶的表達(dá)來進(jìn)行。因此，表明激素敏感脂肪酶HSL和脂蛋白脂肪酶LPL受糖皮質(zhì)激素高度調(diào)控(Zilberfarb，V.，Z)/a6eto/og/a.2001,44:377)。參與能量或脂肪代謝的蛋白質(zhì)勒帕茄堿(leptine沐VLDLR("極低密度脂蛋白受體")也是如此(Slieker,L.J.，J!S/o/.CAew.1996，271,5301;Ensler，K.，Jcto.2002,1581:36)。拔炎糊疫鄉(xiāng)鄉(xiāng)糖皮質(zhì)激素通過參與炎癥信號(hào)傳遞途徑實(shí)現(xiàn)抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。這通過抑制適應(yīng)性或先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的活性或者通過直接阻斷促炎的、細(xì)胞因子控制的信號(hào)傳遞途徑而發(fā)生。反式阻抑已經(jīng)被描述為糖皮質(zhì)激素的抗炎和免疫抑制活性的主要機(jī)制。通過抑制幾種轉(zhuǎn)錄因子憤別是NF-KB和AP-1)的活性，減少了許多促炎細(xì)胞因子(例如TNF-a、GMCSF、IL-l卩、IL-2、IL-3、IL-12)、趨化因子(例如IL-8、RANTES、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)、MIP)、酶(iNOS、COX-2)和/或粘附分子(ICAM-l、VCAM-1)的生成(Barnes,P.J.,C//".5W.(Io"力.1998，94:557;Almawi,W.Y.,JMo/.編ocW"o/.2002,28:69)。但是，抗炎蛋白(脂皮質(zhì)蛋白-l、血清白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、神經(jīng)內(nèi)肽酶、MKP-l)的誘導(dǎo)也參與糖皮質(zhì)激素的抗炎作用(Bames,P.J.,C//".(ZowZ.人1998,94:557;Kassel,O.,2001,20:7108)。其他非基因組效應(yīng)如阻斷MAP激酶信號(hào)途徑也參與糖皮質(zhì)激素的抗炎和免疫抑制作用。1.4糖皮質(zhì)激素的副作用糖皮質(zhì)激素的上述生理作用及抗炎和/或免疫抑制作用可導(dǎo)致存在的糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期過量(例如在內(nèi)源性皮質(zhì)醇增多癥或治療性糖皮質(zhì)激素給藥的情況下)，也可導(dǎo)致多種不期望的效應(yīng)，如誘導(dǎo)高血糖癥成為觸發(fā)糖尿病、誘導(dǎo)高血壓、肌萎縮和/或肌病、軀干性肥胖、骨質(zhì)疏松等。參與葡萄糖和脂肪平衡的特殊效應(yīng)很大一部分受糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的反式激活過程調(diào)節(jié)。除了上述酶之外，糖皮質(zhì)激素給藥還誘導(dǎo)參與蛋白質(zhì)分解代謝的其他酶，例如谷氨酸脫氫酶、谷氨酸-oxalazetate-氨基轉(zhuǎn)移酶和絲氨酸脫水酶(Timmerman,M.,jExp.5/o/.Med^Afo"oo力2003，228:100;Barouki,R.,丄5/oc/zem.1989,186:79;Su，Y.，jrc/i5/oc/ie附.5/o/A".1992,297:239)。持久受高度調(diào)節(jié)的糖異生可導(dǎo)致高糖血癥、胰島素抵抗并作為結(jié)果導(dǎo)致糖尿病。如上所述，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)肝臟中糖異生的關(guān)鍵酶。長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素治療或內(nèi)源性皮質(zhì)醇增多癥所引起的持久免疫抑制可導(dǎo)致感染危險(xiǎn)增加。其所涉及的機(jī)制基本上是造成治療作用(抗炎和/或免疫抑制)的機(jī)制。但是，除了抑制許多促炎蛋白質(zhì)的表達(dá)之外，GR還通過直接誘導(dǎo)病毒啟動(dòng)子而與感染危險(xiǎn)增加有關(guān)。2選擇性GR配體及其應(yīng)用的適應(yīng)癥2.1選擇性GR配體選擇性GR配體(例如選擇性GR激動(dòng)劑-SEGRA、選擇性GR調(diào)節(jié)劑-SGRM、分離或分化的GR配體)代表新一類GR配體，其不同程度地操縱調(diào)節(jié)基因表達(dá)、敏感基因的反式激活或反式阻抑的兩種機(jī)制(Schaecke,H.,尸7V^S2004,101:227&O^r.Op/",/we幼'g.Dn/gs.2004,5:524)。在這方面，與內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素和/或治療性標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素相比，在反式激活或反式阻抑方面相當(dāng)?shù)摹⒃黾拥?、降低的和消除的作用以及它們的不同組合是可能的。它們可以是相應(yīng)機(jī)制的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、部分拮抗劑和拮抗劑。雖然激動(dòng)作用由GR配體對(duì)敏感基因和/或啟動(dòng)子構(gòu)建體的表達(dá)的直接作用確定，但拮抗作用由對(duì)其他配體對(duì)GR的效應(yīng)的抑制表征。下面在對(duì)來自ScheringAG的WO00/32584化合物1和WO02/10143化合物2的兩個(gè)選擇性GR激動(dòng)劑(SEGRA)的分子機(jī)制的表征中給出關(guān)于這方面的相應(yīng)樣品測(cè)定法。對(duì)于反式激活，GR的激動(dòng)配體通過其某種形式的結(jié)合活化受體，所述形式使得所述受體能夠通過與敏感基因的啟動(dòng)子區(qū)中的GRE結(jié)合而誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。另外，存在通過與GR結(jié)合引起受體的拮抗構(gòu)象的配體，它們不導(dǎo)致敏感基因的啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)。這樣的配體被稱為拮抗劑。另一組配體可以被稱為部分激動(dòng)劑或部分拮抗劑。后者只誘導(dǎo)部分激動(dòng)或拮抗GR活性。GR配體的拮抗或部分激動(dòng)活性基于細(xì)胞背景和調(diào)節(jié)敏感基因表達(dá)的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。對(duì)于反式阻抑，GR的激動(dòng)配體通過其某種形式的結(jié)合活化所述受體，所述形式使得被配體活化的受體能夠抑制特定靶基因的表達(dá)。這可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用并最終抑制所述其他轉(zhuǎn)錄因子的作用或者通過與負(fù)GRE結(jié)合來進(jìn)行。反式阻抑的部分激動(dòng)劑、部分拮抗劑和拮抗劑只部分介導(dǎo)這種GR作用和/或抑制其他GR配體的反式阻抑激動(dòng)作用。2.2用詵擇件GR配體治療的示例適應(yīng)癥一方面，用選擇性GR配體的治療的適應(yīng)癥是標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素所適用的任何適應(yīng)癥。這里，分離的對(duì)GR的作用可誘導(dǎo)就以下方面而言所述選擇性GR配體的優(yōu)點(diǎn)，即誘導(dǎo)與標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素相比減少的不期望的作用，即改善作用/副作用譜。另一方面，選擇性GR配體可被用于拮抗現(xiàn)有GR配體的副作用。另外，選擇性GR配體對(duì)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的不適作用的選擇性取代是可能的，而不出現(xiàn)對(duì)GR的不期望效應(yīng)的副作用。這些治療原理也可以組合存在。下面給出了示例應(yīng)用?？寡缀兔庖咭种浦委熖瞧べ|(zhì)激素屬于最常使用的抗炎和免疫抑制藥物(Franchimont,D.,^7"iVTv4a^Sc/.2004,1024:124)。但是，在一些情況中，它們的使用受到嚴(yán)重和不可逆的副作用的限制。己經(jīng)證明GR的反式阻抑活性對(duì)于GR配體的抗炎和免疫抑制作用而言是必要的，而重要的副作用(例如誘導(dǎo)糖異生)由反式激活介導(dǎo)(Schaecke，H.，尸/^/tw"co/.77zer2002，96:23)。在所獲得的反式阻抑活性方面具有降低的反式激活活性的選擇性GR配體可以生產(chǎn)有效的抗炎和免疫抑制藥物，所述藥物誘導(dǎo)的副作用與標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素相比減少，且基本上由反式激活機(jī)制介導(dǎo)。內(nèi)源性皮質(zhì)醇增多癥的治療在一些情況中，討論了組織特異性的、增加的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素活性對(duì)多種疾病和綜合征(例如糖尿病、軀干性肥胖、代謝綜合征、張力過高、動(dòng)脈粥樣硬化)而言的病理生理重要性。這些綜合征的特點(diǎn)是內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的代謝作用增加(即高糖血癥、高脂血癥)以及它們的不利后果。此外，慢性炎癥(低水平炎癥)常?？梢?UJ.J.，il/e^ca/Z^pc^^es2005,64:236;Wang,M.，胸r.Meto6.(Zo碎2005,2:3;Dandona，P.，C/簡(jiǎn)/加'o",2005，111:1448)。但是，基于所預(yù)期的不期望的代謝效應(yīng)的增加，用現(xiàn)在批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素治療并不適用。具有(部分)反式激活拮抗作用的選擇性GR配體可以通過不同機(jī)制減少內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的不利代謝作用。它們包括通過抑制下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸來抑制內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素合成和競(jìng)爭(zhēng)性和/或非競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素在GR中的代謝作用。此外，所述選擇性GR配體的反式阻抑激動(dòng)可以控制所述慢性炎癥。代謝作用缺乏的病癥的治療在各種非常嚴(yán)重的疾病中，期望糖皮質(zhì)激素的額外的代謝作用。它們包括惡病質(zhì)例如腫瘤、心血管病或HIV感染中的惡病質(zhì)。這些病癥的特點(diǎn)也是免疫抑制，但是其通過用標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素治療會(huì)得到增強(qiáng)(Mulligan,K.，Ca,叔2002，85，151;Tijerina,A.J.,CW/C7V脆2004，23:237)。具有顯著反式激活激動(dòng)作用和具有反式阻抑(部分)拮抗的選擇性GR配體可以誘導(dǎo)期望的GR代謝作用，而不損害生物的防御狀況。甚至可以想像通過內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的反式阻抑作用的拮抗提高感染防御。3在原代免疫細(xì)胞中表征選擇性GR配體的分子機(jī)制3.1圖示以上實(shí)例證明具有不同的反式激活/反式阻抑譜的選擇性GR配體可以被用于多種適應(yīng)癥。對(duì)于這樣的新的GR配體的發(fā)現(xiàn)、成功開發(fā)和臨床使用而言重要的必要條件是在相關(guān)體外和體內(nèi)試驗(yàn)及I期和人體臨床研究中表征它們的分子機(jī)制。外周血的有核細(xì)胞(即外周血白細(xì)胞)及來源于其的蛋白質(zhì)特別適用于監(jiān)測(cè)由選擇性GR配體和標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素的反式激活和反式阻抑介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)。與用于表征GR配體的分子機(jī)制的其他測(cè)定法相比，顯著的優(yōu)點(diǎn)是l)使用未受刺激的原代細(xì)胞，其與糖皮質(zhì)激素的體內(nèi)作用具有相關(guān)性，以及2)作為人體^F究中的生物標(biāo)記物的簡(jiǎn)單適用性(在血液中檢測(cè)，而不用侵入性干預(yù)例如活組織檢查或其他額外的應(yīng)激)?？梢酝ㄟ^mRNA檢測(cè)例如通過RT-PCR或其他擴(kuò)增方法或者通過用于直接mRNA檢測(cè)的方法進(jìn)行原代免疫細(xì)胞中基因調(diào)節(jié)的直接檢測(cè)。對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)，可以使用例如連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)、免疫測(cè)定法或蛋白質(zhì)印跡法?？梢栽诩?xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞溶解產(chǎn)物中或細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中或者在血漿、血清或其他生物液體中進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。該方法學(xué)的目的是基于原代免疫細(xì)胞中基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)表征GR配體的分子機(jī)制，并因此獲得關(guān)于以等效劑量使用的該物質(zhì)的可能作用譜的適應(yīng)癥。為了確定合適的參數(shù)，用廣泛篩選方法檢査了原代人免疫細(xì)胞中50多種基因的標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素和選擇性GR配體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)。在體外和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中進(jìn)一步表征了所選基因。偏離文獻(xiàn)工作(literaryworks)的條件在某些情況中導(dǎo)致相反的結(jié)果。參數(shù)選擇的決定性標(biāo)準(zhǔn)是l)一致性地反映GR配體的反式激活或反式阻抑性質(zhì)，2)檢測(cè)未受刺激的免疫細(xì)胞中的調(diào)節(jié)，和3)體外測(cè)定法中基因表達(dá)的快速反應(yīng)(篩選所用的時(shí)間是4小時(shí))，和在體內(nèi)施用GR配體后的良好及持久的可檢測(cè)性。這些性質(zhì)使得可能發(fā)生GR配體對(duì)基因表達(dá)的直接調(diào)節(jié)以及所述參數(shù)可用于體內(nèi)研究中(例如作為生物標(biāo)記物)。為了與標(biāo)準(zhǔn)GK進(jìn)行比較，這些參數(shù)的受GR配體影響的基因表達(dá)被歸一化成用標(biāo)準(zhǔn)GK潑尼松龍?zhí)幚砗蟮幕虮磉_(dá)。潑尼松龍是標(biāo)準(zhǔn)GK，與潑尼松龍相比，SEGRA物質(zhì)將表現(xiàn)出增加的分離，潑尼松龍?jiān)谟肧EGRA開發(fā)候選物的臨床研究的情況中作為比較物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，理論上也可以將該歸一化與任何其他糖皮質(zhì)激素相關(guān)。對(duì)于基因抑制而言，為了進(jìn)行歸一化，導(dǎo)出"潑尼松龍/GR配體"商，即，較低值(〈)表示GR配體相對(duì)較弱的抑制(剩余基因表達(dá)的值較高)。對(duì)于基因誘導(dǎo)而言，為了進(jìn)行歸一化，導(dǎo)出"GR配體/潑尼松龍"商，艮卩，<1的值表示GR配體的相對(duì)較弱的誘導(dǎo)。^一眾力渡微教潘辦淑式激柳敘巡微微斜/附扁敘相對(duì)潑尼松龍的反式激活CD163FKBP51相對(duì)潑尼松龍的反式阻抑IL-lpTNF曙a潑尼松龍1小時(shí)潑尼松龍2小時(shí)潑尼松龍4小時(shí)潑尼松龍12小時(shí)潑尼松龍24小時(shí)1.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.00地塞米松1小時(shí)潑尼松龍2小時(shí)潑尼松龍4小時(shí)潑尼松龍12小時(shí)潑尼松龍24小時(shí)1.020.891.891.131.341.081.131.071.041.050.610.800.690.851.271.010.961.001,160.97ZK2385871小時(shí)ZK2385872小時(shí)ZK2385874小時(shí)ZK23858712小時(shí)ZK23858724小時(shí)0.840.990.520.930.490.790.480.740.490.821.160.990.870.861.280.890.971.060.730.79ZK2431851小時(shí)ZK2431852小時(shí)ZK2431854小時(shí)ZK24318512小時(shí)ZK24318524小時(shí)0.930.770.330.190.040.260.070.260.060.331.170.760.510.591.250.730.450.670.850.52目的是通過概括地反映對(duì)不同的反式阻抑和反式激活參數(shù)的表達(dá)的不同影響的值來表征物質(zhì)的分離的程度。為了表征SEGRA測(cè)試物質(zhì)的分離的作用，因此基于所選基因的誘導(dǎo)或抑制確定分離因子，其顯示反式激活和反式阻抑活性的分離。下面，根據(jù)以下公式導(dǎo)出來自潑尼松龍歸一化值的反式阻抑和反式激活參數(shù)之間的比值16公式l:~~<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在該公式中TR代表經(jīng)歸一化的反式阻抑參數(shù)(TR撥尼松龍=1)TA代表經(jīng)歸一化的反式激活參數(shù)(TA撥尼松龍-l)^代表M的m次方根例如^7=3^'代表所有Tx值的乘積，其中指數(shù)x等于l到t例如^該比值因此是n個(gè)不同潑尼松龍歸一化的反式阻抑參數(shù)的乘積的n次方根除以m個(gè)不同潑尼松龍歸一化的反式激活參數(shù)的乘積的m次方根。作為反式阻抑參數(shù)，所有已知的參數(shù)都適用，包括共輔助分子(HLA-DR、CD86)的表達(dá)。特別適用的參數(shù)是IL-lj3、IL-8、Rantes。TNF-a是特別優(yōu)選的。作為反式激活參數(shù)，所有已知的參數(shù)都適用，包括細(xì)胞因子受體(IFN-yRl、TNF-R1、IL畫1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR)和其他基因(P2腎上腺受體、血紅素加氧酶1、IL-2、MIF、膜聯(lián)蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白l)的表達(dá)。特別適用的參數(shù)是谷氨酰胺合成酶和GILZ的表達(dá)，而非常特別適用的是CD163和FKBP51的表達(dá)?？梢詮倪@些反式阻抑和反式激活參數(shù)中選擇任一個(gè)，并可以根據(jù)上述公式將其用于確定公式I的比值。TNF-a和IL-1J3被優(yōu)選地用于測(cè)定反式阻抑。CD163和FKBP51被優(yōu)選地用于測(cè)定反式激活。根據(jù)該優(yōu)選的參數(shù)組合，在將單個(gè)參數(shù)歸一化之后，根據(jù)以下公式2導(dǎo)出反式阻抑參數(shù)和反式激活參數(shù)之間的比值公式2:比值=^/C濕3;c本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，上述公式1或2的比值理論上也可以自導(dǎo)出值(例如IC5o或EDs。)導(dǎo)出。從數(shù)學(xué)關(guān)系看，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在反式激活和反式阻抑值的差別較大的這樣的變更的計(jì)算方法的情況下，該比值將任選地小于l。試驗(yàn)部分通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR或者通過連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)獲得下面試驗(yàn)部分中所獲得的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果，并將其作為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差繪圖。為了mRNA檢測(cè)，從相應(yīng)樣品(人PBMC或人全血或小鼠脾細(xì)胞)分離總RNA，將所述mRNA轉(zhuǎn)錄入cDNA并通過實(shí)時(shí)TaqMan-PCR(AppliedBiosystems)進(jìn)行擴(kuò)增及檢測(cè)。與"管家"基因HPRT的表達(dá)相比進(jìn)行相對(duì)定量。在每種情況中，繪制GR配體的結(jié)果與載體對(duì)照的結(jié)果的比值。用來自相應(yīng)受體蛋白的可商購(gòu)的熒光素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行人免疫細(xì)胞中受體表達(dá)的連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。所述標(biāo)記在全血中進(jìn)行。在溶解紅細(xì)胞之后，通過FACScalibur連續(xù)流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)進(jìn)行所述連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)分析。繪制平均熒光活性。所測(cè)試的示例化合物是來自WO00/32584的化合物1(ZK238587)和來自WO03/082827的化合物2(ZK243185)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>3.2作為反式阻抑活性參數(shù)的基因/蛋白質(zhì)抑制已知標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素對(duì)免疫細(xì)胞中多種基因的表達(dá)的抑制(Gakm,J.,i^4犯5,/2002,16:61;Hayashi，R,，五w.泡麵co/.2004,500:51)。在我們關(guān)于未受刺激的原代免疫細(xì)胞的研究中，已證實(shí)在炎癥和特定免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用的基因/蛋白質(zhì)適用作反式阻抑活性的指示物。此外，這些參數(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)它們的抑制反映GR配體的抗炎和免疫抑制效應(yīng)。下面的圖顯示了通過定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的未受刺激的人外周單核血細(xì)胞(PBMC)的4小時(shí)培養(yǎng)物中標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素潑尼松龍對(duì)炎癥細(xì)胞因子(TNF-a、IL-lj3、IL-8、Rantes)和共刺激分子CD86的基因調(diào)節(jié)。潑尼松龍(1e-7moI/L)對(duì)人PBMG的4小時(shí)培養(yǎng)物中基因表達(dá)的效應(yīng)(n=6)TNFaIL'1ftIL-8RantesCD86嗎、，二教0,20,024小時(shí)后在小鼠脾細(xì)胞中研究潑尼松龍對(duì)標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素抑制基因(TNF-oc、IL-ip、Rantes)表達(dá)的體內(nèi)作用。己經(jīng)證實(shí)IL-ip、IL-8(只在人系統(tǒng)中可獲得)、Rantes的mRNA表達(dá)以及特別是TNF-a的mRNA表達(dá)特別適用于體外和離體檢測(cè)原代未受刺激的免疫細(xì)胞中GR配體的反式阻抑活性。反映GR配體的抗炎和免疫抑制作用的自主蛋白質(zhì)表達(dá)減少的樣品參數(shù)是通過全血測(cè)定法中連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的單核細(xì)胞上的II型MHC(HLA-DR)表達(dá)。單核細(xì)胞上的HLA—DR表達(dá)全血培養(yǎng)物中的潑尼松龍效應(yīng)■載體曰1e-6mol/L施用后24小時(shí)潑尼松龍(30mg/kg)對(duì)小鼠脾細(xì)胞中基因表達(dá)的效應(yīng)(n-5)TNF-aIL.1B幽TES2000-15001000-500-0-4h24h鵬^來核貧I113.3作為反式激活活性參數(shù)的基因和/或蛋白質(zhì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素對(duì)基因的誘導(dǎo)是己知的(Galon,J.,W犯AJ2002,16:61)。對(duì)于下面在我們的篩選中鑒定的基因，我們可以檢測(cè)未受刺激的免疫細(xì)胞中的誘導(dǎo)與選擇性GR配體的反式激活性質(zhì)之間的相關(guān)性細(xì)胞因子受體(例如TNF-R1、IFN-yRl、IL-1R1、IL匿2Rot、IL-13Ra、GITR、CXCR4)、CD163、FKBP51、膜聯(lián)蛋白1、IL-2、卩2-腎上腺素受體、MIF、GILZ、血紅素加氧酶1、凝血酶敏感蛋白1(thrombospondinl)和谷氨酰胺合成酶。在一些情況中，這些蛋白質(zhì)主要參與GR配體的抗炎和代謝作用以及參與GR作用的調(diào)節(jié)。在一些情況下，獲得與文獻(xiàn)結(jié)果相反的結(jié)果，例如，觀察到IL-1RA表達(dá)的阻抑而不是誘導(dǎo)(未顯示)。證實(shí)CD163、FKBP51、GILZ和谷氨酰胺合成酶的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)特別適用于體外和離體檢測(cè)GR配體的反式激活活性。該圖顯示了在人PBMC的4小時(shí)培養(yǎng)物中潑尼松龍對(duì)基因的誘導(dǎo)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>下面的所選GR配體的反式阻抑活性參數(shù)和反式激活活性參數(shù)的圖顯示潑尼松龍對(duì)基因表達(dá)的效應(yīng)的劑量依賴性(潑尼松龍對(duì)人PBMC的4小時(shí)培養(yǎng)物中基因表達(dá)的劑量依賴性效應(yīng)(n=6)<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>在經(jīng)潑尼松龍?zhí)幚淼男∈蟮钠⒓?xì)胞中檢測(cè)潑尼松龍對(duì)所選基因的表達(dá)的體內(nèi)誘導(dǎo)。施用后24小時(shí)潑尼松龍(30mg/kg)對(duì)小鼠脾細(xì)胞中基因表達(dá)的效應(yīng)(n-5)<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>下面，繪制了通過連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的潑尼松龍對(duì)人全血培養(yǎng)物中總之，免疫細(xì)胞中基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)的研究都適用于表征GR配體的抑制效應(yīng)(反式阻抑)或增加效應(yīng)(反式激活)。隨后顯示這樣的結(jié)果與反式激活和反式阻抑篩選測(cè)定法的結(jié)果之間的相關(guān)性。4來自WO00/32584和WO02/10143的選擇性GR激動(dòng)劑(SEGRA)下面，繪制用于表征篩選中的SEGRA物質(zhì)的分子機(jī)制的測(cè)定法以及具有不同反式激活活性的兩種所選SEGRA物質(zhì)的結(jié)果。這些測(cè)定法證實(shí)了用于基于細(xì)胞系中受體測(cè)定法或啟動(dòng)子測(cè)定法表征GR配體的分子機(jī)制的當(dāng)前常用方法的情形。4.1表征GR配體的分子機(jī)制首先，對(duì)所述物質(zhì)進(jìn)行受體結(jié)合測(cè)試，以顯示與GR的結(jié)合，并同時(shí)顯示對(duì)GR的選擇性。用重組產(chǎn)生的受體檢查所述物質(zhì)與糖皮質(zhì)激素受體(GR)和其他類固醇激素受體(鹽皮質(zhì)激素受體(MR)、孕酮受體(PR)和雄激素受體(AR))的結(jié)單核細(xì)胞上的受體的蛋白質(zhì)表達(dá)的增加效應(yīng)。粒細(xì)胞也得到了相似的結(jié)果。單核細(xì)胞上的CDW3表達(dá)全血培養(yǎng)物中的效尼松龍效應(yīng)4h24h羅敏體01"moVL單核細(xì)胞上的INF-gRl表達(dá)全血培養(yǎng)物中的潑尼松龍效應(yīng)■載體■截體g,,4mo!A>單核細(xì)胞上的TNF-R1表達(dá)全血培養(yǎng)物中的龍尼松龍效應(yīng)v瞎栄欲還&鬮合。為此，使用以含有相應(yīng)類固醇激素受體的編碼序列的桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞的提取物。與參比物質(zhì)fH]-地塞米松相比，所述物質(zhì)顯示與GR的高至極高的親和力。為了測(cè)定SEGRA物質(zhì)的反式激活活性，使用兩個(gè)測(cè)試系統(tǒng)。小鼠乳瘤病毒(MMTV)的啟動(dòng)子含有活化GR的特異性結(jié)合位點(diǎn)(所謂的GRE)。在報(bào)道基因(螢光素酶)之前克隆該啟動(dòng)子，并將構(gòu)建體以穩(wěn)定方式整合到人細(xì)胞系HeLa(宮頸癌細(xì)胞)的基因組中。通過添加測(cè)試物質(zhì)和參比物質(zhì)活化MMTV啟動(dòng)子并表達(dá)螢光素酶，通過光度測(cè)量可以檢測(cè)螢光素酶的活性。在第二個(gè)反式激活系統(tǒng)中，測(cè)定糖皮質(zhì)激素對(duì)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)的誘導(dǎo)。在TAT的基因的啟動(dòng)子中也存在GRE，因此通過被配體活化的GR的結(jié)合，該基因以增強(qiáng)的形式表達(dá)。為此，用測(cè)試物質(zhì)和參比物質(zhì)處理小鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(H4I正3)24小時(shí)，然后通過光度法測(cè)定TAT活性。對(duì)于兩種測(cè)定法，檢測(cè)SEGRA物質(zhì)的反式激活激動(dòng)作用以及檢測(cè)其他GR配體在所述參數(shù)的誘導(dǎo)方面的拮抗作用都是可能的。為了測(cè)定反式阻抑活性，使用含有部分膠原酶啟動(dòng)子的啟動(dòng)子系統(tǒng)。在報(bào)道基因(螢光素酶)之前放置所述啟動(dòng)子，并將產(chǎn)生的構(gòu)建體以穩(wěn)定的形式整合到人細(xì)胞系HeLa的基因組中。在用佛波醇酯刺^[所述細(xì)胞之后，該啟動(dòng)子被活化。SEGRA測(cè)試物質(zhì)和糖皮質(zhì)激素的給藥抑制佛波醇酯誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。通過對(duì)螢光素酶活性的光度測(cè)定進(jìn)行所述檢測(cè)。與參比物質(zhì)地塞米松的活性相比較測(cè)定SEGRA物質(zhì)在相應(yīng)的反式激活和反式阻抑系統(tǒng)中的活性。4.2反式激活激動(dòng)劑化合物1已經(jīng)在上述反式作用(transaction)測(cè)定法中測(cè)試了作為激動(dòng)劑的SEGRA物質(zhì)化合物1?；衔?誘導(dǎo)MTTV啟動(dòng)子的活性，功效為10±1.4nmol，且效力為最大地塞米松效應(yīng)的73±2.8%(11=2)。在誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中TAT活性方面，所述物質(zhì)顯示5.7土0.6nmol的功效，且效力為最大地塞米松效應(yīng)的86±12.7%(n=2)。其在MMTV啟動(dòng)子測(cè)定法和TAT啟動(dòng)子測(cè)定法中都沒有拮抗效應(yīng)。4.3反式激活拮抗劑化合物2與化合物l相反，化合物2是明確的MMTV啟動(dòng)子的拮抗劑。該物質(zhì)拮抗由地塞米松誘導(dǎo)的MMTV啟動(dòng)子活性，功效為85土12nmo1，且效力為GR拮抗劑RU486的最大效應(yīng)的119±3.6%(n=3)。在TAT啟動(dòng)子方面，化合物2表現(xiàn)為部分激動(dòng)劑?；衔?誘導(dǎo)TAT啟動(dòng)子的活性，功效為67土10nmo1,且效力為最大地塞米松效應(yīng)的43.5±10.6%(n=2)。在1pmol的濃度下，化合物2拮抗地塞米松誘導(dǎo)的TAT活性，其效力是RU486的最大效應(yīng)的35%。5通過原代免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)分析表征化合物1和化合物2的反式激活和反式阻抑活性下面，舉例來說，基于兩種SEGRA物質(zhì)反式激活激動(dòng)劑(化合物1)和反式激活拮抗劑(化合物2)比較地顯示通過原代免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)分析表征選擇性GR配體的反式激活和反式阻抑活性的應(yīng)用。先前用常用測(cè)定法已經(jīng)表征了這些物質(zhì)的分子機(jī)制(見5.2和5.3)。通過定量實(shí)時(shí)TaqMan-PCR進(jìn)行該基因表達(dá)分析。顯示了GR配體的結(jié)果與載體對(duì)照的結(jié)果的比值(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。5.1原代人免疫細(xì)胞的體外結(jié)果所述SEGRA物質(zhì)顯示作為反式阻抑活性參數(shù)的人PBMC中細(xì)胞因子的表達(dá)的相當(dāng)抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>水久地誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)，而反式激活拮抗劑化合物2不導(dǎo)致基因表達(dá)的增加。另外，檢査了反式激活拮抗劑是否可以選擇性地阻止標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素潑尼松龍對(duì)所選反式激活活性參數(shù)的基因誘導(dǎo)。潑尼松龍和化合物2都導(dǎo)致人PBMC培養(yǎng)物中反式阻抑參數(shù)TNF-a和IL-lf3的mRNA表達(dá)的抑制。兩種GR配體的組合導(dǎo)致與單個(gè)劑量相似的結(jié)果。<image>imageseeoriginaldocumentpage27</image><image>imageseeoriginaldocumentpage28</image>與此相反，只有潑尼松龍誘導(dǎo)反式激活參數(shù)CD163和FKBP51，但反式激活拮抗劑化合物2不誘導(dǎo)之。同時(shí)給藥化合物2和潑尼松龍導(dǎo)致明顯比單獨(dú)給藥的潑尼松龍低的反式^[活參數(shù)誘導(dǎo)。事實(shí)上，在所有批次中，化合物2都減少CD163表達(dá)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在我們確定的新測(cè)試系統(tǒng)，即未受刺激的原代免疫細(xì)胞中，所選參數(shù)適用于檢測(cè)選擇性GR配體的拮抗活性。.2小鼠中的體內(nèi)結(jié)果在給藥所述SEGRA物質(zhì)5天之后腎上腺重量的降低證實(shí)，在所選劑tC30mg/kg)下，兩種物質(zhì)在體內(nèi)都是有活性的。小鼠腎上腺重量(5/組)SEGRAs.c.施用(30ma/kg)5天載體ZK238587ZK2431肪24小時(shí)后在SEGRA處理的小鼠的脾細(xì)胞中表征所選基因的表達(dá)的體內(nèi)調(diào)節(jié)。反式激活拮抗劑化合物2對(duì)作為反式阻抑參數(shù)的炎癥細(xì)胞因子的抑制不如激動(dòng)劑化合物1的顯著。但是，與載體對(duì)照相比，兩種物質(zhì)都顯著地抑制這些基因的表達(dá)。,ZK238587(30mg/kg)HZK243185(加mg/kg)施用后24小時(shí)SEGRAcpds.(30mg/kg)對(duì)小鼠脾細(xì)胞中基因表達(dá)的效應(yīng)(n=5)TNFaIL-1BRANTES<image>imageseeoriginaldocumentpage29</image>下面，顯示了所選基因的體內(nèi)調(diào)節(jié)的結(jié)果，所述基因的誘導(dǎo)與GR配體的反式激活活性相關(guān)。用反式激活激動(dòng)劑化合物1處理導(dǎo)致脾細(xì)胞中FKBP51、CD163、GILZ和谷氨酰胺合成酶表達(dá)的明顯誘導(dǎo)。與此相反，反式激活拮抗劑化合物2減少這些基因的表達(dá)。對(duì)于所有所選參數(shù)而言，不僅可以檢測(cè)到所述反式激活拮抗劑對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)降低，甚至還可以檢測(cè)到其對(duì)基因表達(dá)的抑制。這種效應(yīng)可能由內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的反式激活活性的拮抗誘導(dǎo)?？傊?，基于兩種所選的、ScheringAG的選擇性GR激動(dòng)齊U(SEGRA)，可能顯示未受刺激的原代免疫細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)中確定的基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)的研究適用于表征選擇性GR配體就其反式激活或反式阻抑體外和體內(nèi)激動(dòng)或拮抗活性而言的分子機(jī)制。5.3評(píng)價(jià)公式2的比值目的是通過概括地反映對(duì)不同反式阻抑和反式激活參數(shù)的表達(dá)的不同影響的值表征物質(zhì)的分離的程度。為了表征SEGRA測(cè)試物質(zhì)的分離的作用，因此確定分離因子，其基于對(duì)所選基因的誘導(dǎo)或抑制顯示反式激活和反式阻抑活性的分離。f丞q;-逸弒/長(zhǎng)2aio選擇TNF-a和IL-ip作為可以生成反式阻抑機(jī)制的參照的參數(shù)。用CD163和FKBP51檢測(cè)反式激活活性。下面，根據(jù)公式2導(dǎo)出歸一化為潑尼松龍的反式阻抑和反式激活參數(shù)之間的比值比值x/丄-1/對(duì)反式激活和反式阻抑活性的因子進(jìn)行幾何平均，并且計(jì)算成彼此的比值。根據(jù)該公式，CD163和FKBP51的降低的基因誘導(dǎo)和與潑尼松龍相當(dāng)?shù)腡NF-ot和IL-ip抑制導(dǎo)致該比值增加到比值H。所述比值越高，GR配體與潑尼松龍(比值-l)相比則越分離。下圖描述了該結(jié)果。<image>imageseeoriginaldocumentpage31</image>藶.'^fi示h2、4、"浙W//、好后戶5MC潛養(yǎng)欽(7|=力*與拔^松龍裙M所迷C^配沐游沐W分庸效^t在搭基齒表這澄力一眾為渡^投龍之后，A及式超滯參教(TM^浙/丄-柳浙及式激活參教卩0)763浙i^O尸5〃游yi^T錄澄游裔W,該M澄。乎場(chǎng)澄i5D。地塞米松lb8M化合物1le-5M反式激活激動(dòng)劑化合物2le-SM反式激活拮抗劑1小時(shí)2小時(shí)4小時(shí)12小時(shí)24小日寸總之，可以從PBMC培養(yǎng)物中的基因表達(dá)值得到比值(分離因子)，其表征SEGRA測(cè)試物質(zhì)的分子機(jī)制，其與潑尼松龍相比被不同程度地分離。特別是對(duì)于TA拮抗劑而言，隨著時(shí)間可以觀察到比值增加的良好持續(xù)性(開始于2小時(shí)值)?；谠摲蛛x因子，標(biāo)準(zhǔn)GK潑尼松龍和地塞米松的反式阻抑和反式激活性質(zhì)總是在很大程度上相當(dāng)。5.4體內(nèi)領(lǐng)!l試用GR配體處理的小鼠的脾細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)與體外動(dòng)力學(xué)測(cè)試中一樣，計(jì)算分離因子，以顯示所述SEGRA測(cè)試物質(zhì)的分離的體內(nèi)作用。這些因子包括歸一化為潑尼松龍?zhí)幚砗蟊磉_(dá)(不同時(shí)間的潑尼松龍組的平均值)的反式阻抑和反式激活參數(shù)的基因表達(dá)值?；蛞种茀?shù)是TNF-a和IL-ip，而基因誘導(dǎo)參數(shù)是CD163和FKBP51。相應(yīng)于說明性公式2，從反式阻抑和反式激活參數(shù)的幾何平均值的商計(jì)算所述分離因子。上圖用圖表顯示所述SEGRA測(cè)試物質(zhì)與潑尼松龍相比的分離的比值的動(dòng)力學(xué)。對(duì)于所有SEGRA測(cè)試物質(zhì)，可以在給藥后24小時(shí)檢測(cè)最大的體內(nèi)分離。在6小時(shí)后觀察到所有SEGRA測(cè)試物質(zhì)的最小分離。對(duì)于TA激動(dòng)劑和TA部分激動(dòng)劑，所述值與潑尼松龍相比甚至顯著低。潑尼松龍(30mg/kg)化合物1(30mg/kg)反式激活激動(dòng)劑化合物2(30mg/kg)反式激活拮抗劑厭-^ff示2、6界W/力好后A4HcV、廣-5)^與發(fā)^松方裙比費(fèi)述G及縱游沐力分鄉(xiāng)雌絲基辦這做一眾為縱絲之后，漸式娜參教,-ct浙/丄-7"浙發(fā)式激活參教^0)/"莉/^B"〃游yz^r鉤澄游裔^,該"澄。總之，已經(jīng)證實(shí)所選參數(shù)也適用于在體內(nèi)顯示GR配體的反式阻抑和反式激活活性以及TA部分激動(dòng)劑和TA拮抗劑的分離的作用。但是，總體上，小鼠脾細(xì)胞中的體內(nèi)分離不如人PBMC的體外測(cè)試中，且不如其一致。這至少部分是因?yàn)樗鯯EGRA物質(zhì)在體內(nèi)抑制反式阻抑參數(shù)TNF-a和IL-1(3的活性較低。5.5顯示使用參數(shù)以檢測(cè)拮抗作用先前的結(jié)果只顯示GR配體的不同激動(dòng)，即，例如反式激活拮抗劑ZK243185(化合物2)對(duì)CD163和FKBP51的誘導(dǎo)的降低或缺乏。所述參數(shù)也可以被用于通過標(biāo)準(zhǔn)糖皮質(zhì)激素如潑尼松龍阻止原代人免疫細(xì)胞中TA介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)來直接產(chǎn)生拮抗，同時(shí)TR介導(dǎo)的抑制，例如TNFa表達(dá)不被損害。也就是說，要求拮抗的分離。<image>imageseeoriginaldocumentpage34</image>權(quán)利要求1.用于通過GR敏感基因的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析表征糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體的反式激活和反式阻抑活性的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)將原代免疫細(xì)胞暴露于GR配體；b)檢測(cè)至少一種GR敏感基因的表達(dá)調(diào)節(jié)以測(cè)定所述反式阻抑；c)檢測(cè)至少一種GR敏感基因的表達(dá)調(diào)節(jié)以測(cè)定所述反式激活；d)通過參考已知糖皮質(zhì)激素將所得值歸一化；e)根據(jù)公式1導(dǎo)出比值2.權(quán)利要求l的方法，其中為了表征所述反式激活，測(cè)定IFN-yRl、TNF-Rl、IL-1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR、卩2-腎上腺素受體、血紅素加氧酶1、IL-2、MIF、膜聯(lián)蛋白1或血小板反應(yīng)蛋白1的表達(dá)。3.權(quán)利要求1的方法，其中為了表征所述反式激活活性，測(cè)定CD163、FBKP51、谷氨酰胺合酶或GILZ的誘導(dǎo)。4.權(quán)利要求1的方法，其中為了表征所述反式阻抑活性，測(cè)定HLA-DR、CD86或促炎細(xì)胞因子IL-P、IL-8、TFN-oc或Rantes的抑制。5.用于通過GR敏感基因的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析表征糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體的反式激活和反式阻抑活性的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)將原代免疫細(xì)胞暴露于GR配體；b)檢測(cè)TNF-a和IL-ip的表達(dá)調(diào)節(jié)；c)檢測(cè)CD163和FKBP51的表達(dá)調(diào)節(jié)；d)通過參考已知糖皮質(zhì)激素將所得值歸一化；e)根據(jù)公式2導(dǎo)出比值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.權(quán)利要求1-5的至少一項(xiàng)的方法，其中所述原代免疫細(xì)胞是未受刺激的。7.權(quán)利要求1-6的至少一項(xiàng)的方法，其中在所述細(xì)胞上或在分泌到液體中后進(jìn)行所述蛋白質(zhì)檢測(cè)。8.權(quán)利要求l-7的至少一項(xiàng)的方法，其中檢查來自淋巴器官、來自骨髓或來自血液的原代免疫細(xì)胞。9.權(quán)利要求1-8的至少一項(xiàng)的方法，其中已經(jīng)除去了活生物中的血液。10.權(quán)利要求1-9的至少一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行反式阻抑和反式激活參數(shù)對(duì)潑尼松龍的歸一化。11.前述權(quán)利要求的方法用于檢測(cè)GR配體的競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性激動(dòng)、部分激動(dòng)、部分拮抗或拮抗活性的用途。12.權(quán)利要求1-10的方法在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中以及作為生物標(biāo)記物測(cè)定法的用途。全文摘要本發(fā)明涉及用于通過原代免疫細(xì)胞中的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析表征糖皮質(zhì)激素受體(GR)配體的反式激活和反式阻抑活性的方法及其用途。文檔編號(hào)G01N33/74GK101166980SQ200680014619公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2006年5月2日優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日發(fā)明者B·舒爾茨,C·倫奇,C·施托克,H·沙克,H·雷溫克爾,N·施密斯,P·戈勒茨,W-D·德克申請(qǐng)人:拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司