一種調(diào)控楊樹不定根發(fā)育的生長素受體基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控不定根發(fā)育的生長素基因及其應用，尤其涉及一種調(diào)控楊樹 不定根發(fā)育的生長素受體基因PtrFBLl及其應用，屬于植物基因工程和生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著近年來分子生物學技術的發(fā)展和楊樹基因組測序工作的完成，楊樹已經(jīng)成為 一種研究多年生植物的木材形成、生長發(fā)育、季節(jié)變化規(guī)律、性別決定、開花以及生物互作 的模式植物。楊樹本身是一種在世界范圍廣泛分布的經(jīng)濟樹種，不僅是重要的木材原材料， 也被認為是一種重要的能源植物，具有分布廣、適應性強、早期速生、易雜交改良和繁殖等 特點，因而廣泛用于速生材栽培。楊樹栽培多通過硬枝扦插來進行無性繁殖，而目前許多優(yōu) 良楊樹無性系尤其是白楊派樹種扦插生根非常困難。因此，加強木本植物扦插生根機理研 究，利用分子生物學和基因工程技術提高楊樹扦插生根能力具有重要理論意義和實際應用 價值。
[0003] 不定根是指植物地上部分的莖、葉或下胚軸上所形成的根，其生長發(fā)育受外在環(huán) 境和內(nèi)源激素的協(xié)同作用。植物通過不定根的形成方式使其具備了形成更多根系的能力， 讓植物或細胞具有了再生能力，它的這種作用形式在植物組織扦插和組織培養(yǎng)等無性繁殖 中發(fā)揮著越來越巨大的作用。在激素調(diào)控中，生長素是最關鍵的內(nèi)源激素，其他激素主要通 過與生長素互作來調(diào)節(jié)不定根的發(fā)育，生長素不僅可以直接作用于胞內(nèi)組分而影響細胞反 應，還可以間接方式調(diào)控生長發(fā)育相關基因的表達。因此，研究木本植物不定根發(fā)育的分 子形成機理，必然要涉及到生長素信號轉(zhuǎn)導的相關基因具體的表達研究，這個過程核心內(nèi) 容是生長素信號的識別以及下游相關基因的表達。分離生長素調(diào)控不定根發(fā)育相關的關鍵 基因，鑒定其生物學功能，通過遺傳改良促進難生根植物生根，是林木分子育種重要研究內(nèi) 容，不僅對林木根系發(fā)育生物學研究有重要理論意義，而且在林木良種無性系繁殖生產(chǎn)中 具有潛在的應用價值。生長素與生長素受體（TRANSPORTINHIBITORRESPONSE1，TIR1)結(jié) 合后，通過泛素化途徑降解Aux/IAA轉(zhuǎn)錄抑制因子，激活生長素響應因子（Auxinresponse factor，ARF)蛋白，進而調(diào)控生長素響應基因的表達。TIR1是唯一在細胞核中調(diào)節(jié)下游生 長素響應基因轉(zhuǎn)錄的生長素受體，因此，TIR1是生長素信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的關鍵基因，其先形成 SCFTIR1-Aux/IAA復合體，再與Aux/IAA啟動子區(qū)域的順式作用元件AuxRE結(jié)合，啟動Aux/ IAA蛋白泛素介導的蛋白水解進程；Aux/IAA蛋白降解，使ARF啟動或抑制生長素下游響 應基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生生長素效應，完成生長素對基因表達的調(diào)節(jié)過程。近年來，人們在多種 草本植物中研究發(fā)現(xiàn)不同TIR1基因通過調(diào)控不同的基因表達影響根系的生長發(fā)育，說明 TIR1基因?qū)χ参锔蛋l(fā)育具有重要的作用。
[0004] 目前在木本植物中，生長素受體調(diào)控不定根發(fā)育的機制鮮有報道。另外，木本植 物在進化過程中經(jīng)歷了 2次基因組復制事件，部分基因家族發(fā)生了擴張或丟失，一些基 因功能也發(fā)生了分化，如TIR1基因家族，在擬南芥中有6個成員，在楊樹中有8個成員 (PtrFBLls)，其基因家族進行了擴張，部分同源基因的表達模式發(fā)生分化。因此，利用木本 植物為研究對象，結(jié)合分子生物學和基因工程技術，解析生長素受體調(diào)控楊樹不定根的分 子發(fā)育機制，對于了解木本植物根系發(fā)育的分子基礎，以及通過分子育種改良難生根林木， 加快林木繁育具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種調(diào)控楊樹不定根系的 生長素受體基因PtrFBLl，本發(fā)明的另一目的是提供一種調(diào)控楊樹不定根系的生長素受體 基因PtrFBLl的應用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案：
[0007] -種調(diào)控楊樹不定根發(fā)育的生長素受體基因PtrFBLl，其核苷酸序列如序列表中 的序列1所示。
[0008] -種調(diào)控楊樹不定根發(fā)育的生長素受體基因PtrFBLl的表達蛋白，其氨基酸序列 如序列表中序列2所示。
[0009] -種含有調(diào)控楊樹不定根發(fā)育的生長素受體基因PtrFBLl的載體 PMDC32-PtrFBLl，所述載體在PtrFBLl基因的5'端組裝組成型強表達啟動子P35S;在 PtrFBLl基因的3'端組裝有強終止子N0S。
[0010] -種由上述載體組裝的HPT基因可作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標記，用潮霉素進行轉(zhuǎn) 基因楊樹的篩選。所述的載體上組裝有LB序列和RB序列，LB序列和RB序列能促使組裝 于其間的PtrFBLl基因整合至楊樹受體細胞染色體中。
[0011] 所述的楊樹生長素受體基因PtrFBLl在調(diào)控楊樹生長發(fā)育過程中的應用。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明以84k銀腺楊為材料，克隆了PtrFBLl基因；同時，構(gòu)建 過量表達載體PMDC32-PtrFBLl，該基因位于啟動子P35S之后，在啟動子P35S的驅(qū)動下， PtrFBLl可在楊樹體內(nèi)高效表達，從而調(diào)控楊樹不定根的發(fā)育。其中，PtrFBLl基因是調(diào)控 楊樹不定根發(fā)育的關鍵基因。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過將PtrFBLl基因轉(zhuǎn)入84k銀腺楊，過量表達PtrFBLl 的轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型比較，明顯提早生根，且不定根數(shù)量明顯增多，不定根總長和不定根 總面積顯著增大，說明PtrFBLl基因是調(diào)控楊樹不定根發(fā)育的關鍵調(diào)芐基因，在林木基因 工程領域和無性系林業(yè)領域有重要應用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1是植物表達載體PMDC32-PtrFBLl的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015] 圖2-1至圖2-4是過量表達PtrFBLl的未轉(zhuǎn)基因楊樹與轉(zhuǎn)基因楊樹根系比較圖； 圖2_1和圖2-2為扦插后15天株系根系，圖2-3和圖2-4為扦插5個月后株系根系。
[0016] 圖3是過量表達PtrFBLl的轉(zhuǎn)基因楊樹的轉(zhuǎn)錄水平定量檢測圖。
[0017] 圖4是過量表達PtrFBLl的轉(zhuǎn)基因楊樹與未轉(zhuǎn)基因楊樹，不定根發(fā)生第15天根系 不定根數(shù)目比較圖和種植2個月后總根長和總根面積比較圖。
[0018] 圖5-1和圖5-2分別是過量表達PtrFBLl的未轉(zhuǎn)基因楊樹與轉(zhuǎn)基因楊樹不定根發(fā) 生第6天生根圖。
[0019] 圖6是不定根誘導野生型（84k)與轉(zhuǎn)基因楊樹（#B、#D、#F)不同時間的生根率。
[0020] 圖7A至圖7H為采用生長素處理野生型（84k)與轉(zhuǎn)基因楊樹（#B、#D)的根部生長 圖及生根率統(tǒng)計圖。
[0021] 圖8A至圖8H是采用BA處理野生型（84k)與轉(zhuǎn)基因楊樹（#B、#D)的根部生長圖 及生根率統(tǒng)計圖。
[0022] 圖9A至圖9D是采用PEG6000處理的野生型（84k)與轉(zhuǎn)基因楊樹（#B、#D)的根部 生長圖及生根率統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下實施例中未進行詳細說明的 操作可參照分子克隆，相關試劑盒使用說明的操作實現(xiàn)。
[0024] 實施例1克隆PtrFBLl基因
[0025]以 84K(P.albaXP.glandulosa)銀腺楊為材料，使用RNeasyPlantMini試劑盒 和RNase-freeDNaseI試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany)提取扦插 10 天的 84K組培苗 總RNA。每個樣品取約 3.0ygRNA通過使用SuperscriptIIIfirst-strandsynthesis system(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一鏈。參考已發(fā)表的毛果楊 基因組序列，使用Primer5軟件設計引物（擴增子包含起始密碼子及終止密碼子），進行基 因全長擴增（引物中引入GATEWAY接頭）。
[0026] 其中，PtrFBLIORF正向引物為（如序列表中序列3):
[0027] GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAATGTTGAGAAAGGCGAATTC,
[0028]PtrFBLIORF反向引物為（如序列表中序列4):
[0029] GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTATCAAGAAAACCTTGACACAGAATC；
[0030] 高保真PCR反應體系如下：TaKaRa高保真擴增酶PrimeSTAR12y1，正向引物 (10yM) 0? 8y1，反向引物（10yM) 0? 8y1，模板（84K楊cDNA) 0? 8y1，無菌ddH20 補足至 20y1。反應程序：預變性 98°C，5min;98°C，30s;56°C，30s;72°(：，31^11，10個循環(huán)；98°(：， 30s;6(TC，30s;72°C，3min，25 個循環(huán)；72°C10min。
[0031] 最終獲得基因全長cDNA序列為1755bp，命名為PtrFBLl基因，序列如序列表中序 列1所示，其所編譯表達蛋白序列如序列表中序列2所示。
[0032] 實施例