專(zhuān)利名稱：新型的l－賴氨酸－誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子、包含該核酸分子的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和使用L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
棒狀細(xì)菌(Coryneform bacteria)是生產(chǎn)在動(dòng)物飼料工業(yè)、藥品工業(yè)、食物工業(yè)和類(lèi)似工業(yè)中具有多種應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)的工業(yè)微生物，所述化學(xué)物質(zhì)包含L-賴氨酸、L-蘇氨酸和多種核酸。為了通過(guò)基因工程或代謝工程從這些棒狀細(xì)菌中開(kāi)發(fā)高效價(jià)菌株，在棒狀細(xì)菌中涉及幾個(gè)代謝途徑的基因表達(dá)應(yīng)該被有選擇地調(diào)節(jié)。因此，需要對(duì)該基因調(diào)節(jié)有用的啟動(dòng)子序列。
在棒狀細(xì)菌上一旦發(fā)生基因表達(dá)，基因通常從它們自己的啟動(dòng)子表達(dá)(Vasicova，P.，等，J.Bacteriol.181，6188-6191，(1999)，等等)。然而，不像其它的工業(yè)微生物例如大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，沒(méi)有關(guān)于在棒狀細(xì)菌中負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列的基本結(jié)構(gòu)的信息。因?yàn)檫@個(gè)原因，通過(guò)以下步驟開(kāi)發(fā)出啟動(dòng)子從與抗生素抗性相關(guān)的基因中除去啟動(dòng)子區(qū)，抗生素例如氯霉素；引導(dǎo)從棒狀細(xì)菌分離的并使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化的染色體DNA進(jìn)入啟動(dòng)子位點(diǎn)；使用所形成的DNA分子轉(zhuǎn)化棒狀細(xì)菌；評(píng)估所獲得的菌株的抗生素抗性(Eikmanns，B.J.等，Gene，102，93-98(1991)；Patek，M.等，Microbiology，142，1297-1309(1996))。然而，考慮到目標(biāo)基因的選擇性表達(dá)和表達(dá)效率，先前開(kāi)發(fā)的啟動(dòng)子序列仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)。
涉及啟動(dòng)子分離的傳統(tǒng)方法包括(1)啟動(dòng)子探針載體系統(tǒng)在報(bào)道基因上游的基因組DNA片段的隨機(jī)克隆中的使用，該報(bào)道基因僅當(dāng)克隆的片段中包含啟動(dòng)子活性時(shí)才進(jìn)行表達(dá)；(2)基于基因特異性探針的雜交，通過(guò)該雜交，基因和它的啟動(dòng)子從基因組文庫(kù)分離出來(lái)；以及(3)誘導(dǎo)性的cDNA探針和非誘導(dǎo)性cDNA探針與基因文庫(kù)的差示雜交。
近來(lái)發(fā)展的使用2維(2-D)凝膠電泳的比較蛋白質(zhì)組分析是鑒別在不同的生理狀態(tài)下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的技術(shù)。基于差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，許多研究已被施行以便鑒定能增加蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)基因。
基于這個(gè)背景，本發(fā)明人對(duì)存在賴氨酸時(shí)表達(dá)被誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了2-D凝膠電泳，以及通過(guò)比較蛋白質(zhì)組分析檢測(cè)和鑒別了顯示差異表達(dá)圖式(pattern)的蛋白質(zhì)。當(dāng)與鑒定的蛋白質(zhì)的推定的啟動(dòng)子區(qū)相對(duì)應(yīng)的多核苷酸通過(guò)PCR擴(kuò)增并被引入缺少啟動(dòng)子的lacZ基因的上游時(shí)，觀察到在存在賴氨酸時(shí)β-半乳糖苷酶的活性顯著增加，從而導(dǎo)致了本發(fā)明，其提供能在賴氨酸存在時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)的新型啟動(dòng)子核酸分子。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供新型的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含該新型的啟動(dòng)子核酸分子的載體。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是提供用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的還有另外一個(gè)目標(biāo)是提供使用新型的啟動(dòng)子核酸分子誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的方法。
附圖簡(jiǎn)述[11]結(jié)合附圖，通過(guò)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其它的目標(biāo)、特征和其它優(yōu)點(diǎn)將被更清楚的理解，在附圖中[12]

圖1表示存在和不存在賴氨酸情況下培養(yǎng)的谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的2-D凝膠電泳的結(jié)果，其中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)用箭頭表示；以及[13]圖2是構(gòu)建用于監(jiān)控啟動(dòng)子活性的載體的方法的圖示，其中β-半乳糖苷酶被用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性。
實(shí)施本發(fā)明的最好的方式[14]一方面，本發(fā)明涉及新型的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子。
具體而言，本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子具有SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列。
依照本發(fā)明的啟動(dòng)子核酸分子的核苷酸序列可使用幾個(gè)近來(lái)發(fā)展的方法中的任意一個(gè)修飾到一定的程度，這些方法例如定向進(jìn)化或定點(diǎn)誘變。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地認(rèn)識(shí)到，經(jīng)過(guò)這種人工修飾具有70％或更高同源性的核苷酸序列衍生自本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的核苷酸序列，只要它保持了用于表達(dá)靶基因的啟動(dòng)子活性。
因此，本發(fā)明的L-賴氨酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子包括與上述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核苷酸序列。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“同源性(homology)”意欲指與天然核酸序列的序列相似性?！巴葱浴卑ㄅc本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子的核苷酸序列具有優(yōu)選地75％或更高，更優(yōu)選地85％或更高，甚至更優(yōu)選地90％或更高，以及最優(yōu)選地95％或更高同一性的DNA序列。同源性的評(píng)價(jià)可用肉眼或商業(yè)上可獲得的軟件進(jìn)行。使用商業(yè)可獲得的計(jì)算機(jī)程序，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性可以用百分比(％)表示，相鄰序列之間的同源性(％)可被評(píng)價(jià)。
另外，本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子包括選自與上述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的(complementary)”涉及在核苷酸或核酸之間的雜交或堿基配對(duì)，例如諸如雙鏈DNA分子的兩條鏈之間或者寡核苷酸引物和將被測(cè)序或擴(kuò)增的單鏈核酸上的引物結(jié)合位點(diǎn)之間。
本發(fā)明的L-賴氨酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子也包括行使與L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子相同活性的功能等價(jià)物。包括功能片段在內(nèi)的功能等價(jià)物可包括這樣的變體，在該變體上，一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基通過(guò)取代、缺失、插入或其組合進(jìn)行改變。
本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子源自棒狀細(xì)菌，并且在原核細(xì)胞中，特別在大腸桿菌和棒狀細(xì)菌中，作為用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子是有效用的。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子(promoter)”涉及RNA聚合酶與之結(jié)合以啟始基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，和在mRNA轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)的5’方向的位置。依照本發(fā)明的目的，本發(fā)明的啟動(dòng)子指L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在存在外部信號(hào)L-賴氨酸時(shí)，其足以去指導(dǎo)啟動(dòng)子依賴性的基因表達(dá)。
本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子可使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)分離或制備。例如，它可通過(guò)使用適當(dāng)?shù)囊镄蛄械腜CR來(lái)分離。它也可以通過(guò)使用自動(dòng)DNA合成儀的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)來(lái)制備。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“棒狀細(xì)菌”包括屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物。這些棒狀細(xì)菌包括谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032；其它野生型菌株，已知作為棒狀桿菌屬、特別是種谷氨酸棒狀桿菌的適當(dāng)?shù)木?、熱氨基棒狀桿菌(CorynebacteriumThermoaminogene)FERM BP-1539、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067以及乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Lactofermentum)ATCC 13869；以及由此制備的產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌株，例如谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10881和谷氨酸棒狀桿菌KFCC 11001。
另一方面，本發(fā)明涉及包含新型的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子的載體。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“載體”涉及包含可操作地連接到適合的控制序列的DNA序列的DNA構(gòu)建物。這些控制序列可包括指引轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制該轉(zhuǎn)錄的某些操縱子序列、在mRNA上編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒或僅僅是潛在的基因組插入片段。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主，載體可以獨(dú)立于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和行使功能，或者可以在一些情況下，自身整合入基因組。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接(operably linked)”指將準(zhǔn)備表達(dá)的基因以某種方式連接到它的控制序列以被表達(dá)。
在施行2-D凝膠電泳之后，本發(fā)明人通過(guò)比較蛋白質(zhì)組分析鑒定顯示出增加的表達(dá)的蛋白質(zhì)，以及使用報(bào)道基因從此類(lèi)蛋白質(zhì)搜尋啟動(dòng)子序列。報(bào)道基因是通過(guò)其表達(dá)使得目標(biāo)啟動(dòng)子的活性能夠被很容易地檢測(cè)的基因?？衫玫膱?bào)道基因包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、熒光素酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶和熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白等等)。
在本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)踐中，為了通過(guò)測(cè)量從LacZ基因表達(dá)的β-半乳糖苷酶的活性來(lái)確定本發(fā)明的新型啟動(dòng)子核酸分子是否是L-賴氨酸誘導(dǎo)型的，構(gòu)建重組載體，pLCP。在本發(fā)明的另外一個(gè)詳細(xì)實(shí)踐中，包含本發(fā)明的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子的pLCP載體在存在250mM L-賴氨酸時(shí)，其顯示的β-半乳糖苷酶活性是不存在L-賴氨酸的情況下的β-半乳糖苷酶活性的2倍或更多倍。
為了重組產(chǎn)生靶基因，包含L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子的本發(fā)明載體可操作地連接到編碼多種蛋白的任一基因上。使用本發(fā)明載體容易表達(dá)的靶基因包括但不限定于asd、daβA、dapC、dapF、fbp、lysC和pyc。在這些靶基因中，asd、dapA、lysC和pyc是特別優(yōu)選地。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
上述包含L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子的載體可操作地連接到編碼靶蛋白的基因上以誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)。用這種方式構(gòu)建的載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，例如原核細(xì)胞，優(yōu)選地為大腸桿菌和棒狀細(xì)菌，更優(yōu)選地為棒狀細(xì)菌。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化(transformation)”指引導(dǎo)DNA以這樣的方式進(jìn)入宿主，即它能作為染色體外的成分復(fù)制，或者通過(guò)染色體整合進(jìn)行復(fù)制。
如此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的培養(yǎng)可以按照本領(lǐng)域的普通方法進(jìn)行。已知的培養(yǎng)方法被Chmiel所描述(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrungin die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))；以及被Storhas所描述(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
在還有另一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的方法，其是以使用L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子為基礎(chǔ)的。
本發(fā)明的新型L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子能誘導(dǎo)可操作地被連結(jié)到其上的靶基因的高水平的表達(dá)，因此在靶蛋白的大量生產(chǎn)中是有效用的。
對(duì)本發(fā)明的更好的理解可以通過(guò)下述實(shí)施例獲得，這些實(shí)施例被提出以舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1在谷氨酸棒狀桿菌中其表達(dá)被L-賴氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的篩選和鑒定。
(1)從培養(yǎng)在不同濃度L-賴氨酸中的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中制備蛋白質(zhì)樣品。
谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032被培養(yǎng)在不存在和存在L-賴氨酸(0、250和500mM)的情況下，細(xì)胞通過(guò)離心獲得。用10mM Tris-Hcl緩沖液(pH7.5)洗細(xì)胞三遍。
洗過(guò)的細(xì)胞被重新懸浮在裂解緩沖液中(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基-銨]-1-丙磺酸鹽)，0.4％二硫蘇糖醇)，在冰上使用超聲波儀經(jīng)超聲波處理而破裂，并在4℃下12,000×g離心15分鐘。如此獲得的細(xì)胞裂解產(chǎn)物與最終濃度為700單位/ml的核酸內(nèi)切酶(Sigma)和1×蛋白酶抑制劑混合物(Roche)混合。蛋白質(zhì)濃度使用布拉德福(Bradford)方法測(cè)定。
(2)通過(guò)2-D凝膠電泳的蛋白質(zhì)分離。
每一個(gè)得到的蛋白樣品中的500μg與溶解緩沖液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基-銨]-1-丙磺酸鹽)，0.4％二硫蘇糖醇，1％溴酚藍(lán))混合得到最終體積500μl，然后在4℃下20,000×g離心15分鐘。上清液與0.5％固定化電介質(zhì)(immobiline)pH梯度(IPG)緩沖液(pH4.5-5.5載體兩性電解質(zhì)，Amersham PharmaciaBiotech)混合。所形成的溶液被裝載到IPG干條再水化盤(pán)(IPG dry striprehydration tray)上，含pH4.5-5.5線性梯度的18cm IPG干條在再水化盤(pán)上與蛋白質(zhì)樣品再水化12小時(shí)。
再水化的條在Multiphor II電泳槽(Amersham PharmaciaBiotech)上進(jìn)行等電聚焦，90kVh。
在第一向等電聚焦完成后，聚焦的IPG條用平衡緩沖液(0.2mM三丁基膦、6M尿素、2％SDS、375mM Tris-HCL、pH8.8、20％甘油和2.5％丙烯酰胺)攪拌下平衡15分鐘。
平衡的IPG條用1×SDS-PAGE分離緩沖液(192mM甘氨酸、0.1％SDS、24.8mM Trisma Base)輕微潤(rùn)濕，然后如下進(jìn)行第二向電泳。
平衡的IPG條被置于8-16％的梯度聚丙烯酰胺凝膠的頂部，并在每凝膠15mA下跑膠16小時(shí)來(lái)分離蛋白質(zhì)。
(3)顯示增加的表達(dá)水平的蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)。
雙向凝膠用250ml三重蒸餾水(triple-distilled water)清洗，在固定溶液(40％甲醇、5％磷酸)中溫育1小時(shí)。凝膠用考馬斯亮(Coomassie brilliant)G-250(sigma)染色5個(gè)小時(shí)，然后在去染色溶液(1％醋酸)中去染色12小時(shí)以除去過(guò)多的染色。
利用PDQuest軟件(Bio-rad)，對(duì)用蛋白質(zhì)樣品制備的雙向凝膠進(jìn)行相互比較，所述蛋白質(zhì)樣品是從存在0、250和500mM的L-賴氨酸下培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得的。結(jié)果如圖1所示。五個(gè)表示出增加的表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)被檢測(cè)到。
實(shí)施例2其表達(dá)被L-賴氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的鑒定(1)從蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽提取[48]在圖1中所示的目標(biāo)蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切下來(lái)，轉(zhuǎn)移到微量離心管。凝膠塊三次用120μl在25mM碳酸氫銨(pH7.8)中的50％乙腈去染色15分鐘，伴隨溫和的攪動(dòng)，并被完全干燥。干燥的凝膠塊在37℃下在胰蛋白酶消化液(25mM碳酸氫銨，pH7.8，0.015μg/μl胰蛋白酶)中溫育16個(gè)小時(shí)，以消化凝膠中的蛋白質(zhì)。在凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化完成以后，消化的凝膠塊用8μl肽提取液(50％乙腈和0.5％三氟乙酸的混合物)覆蓋，并且被超聲處理10分鐘以從凝膠中提取肽。然后，凝膠塊被離心，回收包含從凝膠中釋放的肽的上清液并使用冷凍干燥器濃縮到大約5μl的體積。
(2)通過(guò)質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)鑒定[49]1μl的每個(gè)濃縮樣品與1μl的基質(zhì)溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基肉桂酸、0.5％三氟乙酸和50％乙腈)混合，然后被裝載到用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜的采樣板上，并被干燥以結(jié)晶。結(jié)晶肽的質(zhì)量用MALDI-TOF質(zhì)譜分析。為了蛋白質(zhì)的鑒定，測(cè)量的肽質(zhì)量被用于搜尋美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr.Z)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和其它來(lái)源，這使用MS-Fit軟件(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm)或者Profound軟件(http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)進(jìn)行。結(jié)果被列在下面的表1里。如表1所示，五個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被鑒定為Cgl1910編碼點(diǎn)a、Cgl2134編碼點(diǎn)b、Cgl2754編碼點(diǎn)c、Cgl2818編碼點(diǎn)d以及Cgl3209編碼點(diǎn)e。
表1[50]存在賴氨酸情況下顯示增加的表達(dá)水平的蛋白


實(shí)施例3包含啟動(dòng)子序列的重組載體的構(gòu)建(1) 對(duì)應(yīng)于推定的啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的擴(kuò)增[51]谷氨酸棒狀桿菌基因組基因的核苷酸序列已經(jīng)完全被測(cè)定并廣為人知了。列于表1中的蛋白質(zhì)的遺傳信息(Cgl1910、Cgl2134、Cgl2754、Cgl2818和Cgl3209)可從NIH GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中得到。為了擴(kuò)增位于每個(gè)蛋白質(zhì)ORF上游的推定的啟動(dòng)子區(qū)(SEQ ID No.1Cgl1910的啟動(dòng)子區(qū)；SEQ ID No.2Cgl2134的啟動(dòng)子區(qū)；SEQ ID No.3Cgl2754的啟動(dòng)子區(qū)；SEQ ID No.4Cgl2818的啟動(dòng)子區(qū)；SEQ IDNo.5Cgl3029的啟動(dòng)子區(qū))，如下面表2所示，基于報(bào)道的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物以包含BamHI位點(diǎn)，并將其合成。為了擴(kuò)增五個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，用谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA作為模板與合成的引物一起進(jìn)行PCR[Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories]。PCR的條件包括25個(gè)循環(huán)在94℃下變性1分鐘，在58℃下退火1分鐘以及在68℃下聚合30秒。
表2

(2)用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性的載體的構(gòu)建[52]圖2示意性的說(shuō)明了構(gòu)建檢測(cè)每一個(gè)推定的啟動(dòng)子活性的重組載體的方法。
在實(shí)施例3的(1)中擴(kuò)增的DNA片段被分別地克隆到包含LacZ基因的pRS415的BamHI位點(diǎn)(Simons，R.W.等，Gene，53，85-96(1987))。每一個(gè)重組載體用HindIII和XbaI消化，以便在插入的推定啟動(dòng)子之前和LacZ基因的后面都進(jìn)行切割，并在瓊脂糖凝膠上電泳。每一個(gè)DNA片段被從凝膠上切除，并用凝膠提取試劑盒(Gel ExtractionKit(Qiagen))進(jìn)行純化。
純化的DNA片段被插入pXMJ19載體(Jakoby，M.J.，等，Biotechniques，13，437-441(1999))，因此產(chǎn)生了檢測(cè)啟動(dòng)子活性的載體pLCP-1910、pLCP-2134、pLCP-2754、pLCP-2818和pLCP-3029。通過(guò)LacZ基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶活性的測(cè)量，這些載體可進(jìn)行推定的啟動(dòng)子活性的檢測(cè)。
如此獲得的重組載體依照Van der Rest等(Appl.Microbiol.Biotechnol.52，541-545，(1999))描述的方法被引入到谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被涂在補(bǔ)充以17mg/ml氯霉素的LB瓊脂平板(0.5％酵母提取物、1％Nacl、1％胰化蛋白胨和1.5％瓊脂)上，在30℃下培養(yǎng)以選擇生長(zhǎng)的菌落。
實(shí)施例4谷氨酸棒狀桿菌中啟動(dòng)子序列活性的測(cè)量(1)在存在和不存在250mM賴氨酸的情況下，啟動(dòng)子序列活性的測(cè)量[56]轉(zhuǎn)化的菌落被培養(yǎng)以分析啟動(dòng)子序列的活性，如下。
每一個(gè)轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌的菌落在包含25ml基本培養(yǎng)基(5g葡萄糖、5g硫酸銨、2g尿素、0.5g NaCl、1g KH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、200μg生物素、100μg維生素B1和1ml微量元素溶液，于1升蒸餾水中，pH7.2)的250ml帶擋板的瓶中以1∶20的比率接種，該基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充或不補(bǔ)充250mM的L-賴氨酸，然后在30℃和200rpm持續(xù)搖動(dòng)的情況下被培育。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的中期(mid-exponential growth phase)(吸光度為5)時(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)離心收集，懸浮在100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，通過(guò)超聲波處理裂解，然后高速離心。按照Rosenthal的方法(Rosenthal，N.，Methods Enzymol.152，704-720(1987))，使用2μl上清液測(cè)量β-半乳糖苷酶的活性。結(jié)果是，當(dāng)賴氨酸存在下培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯示β-半乳糖苷酶的活性高于賴氨酸不存在的情況下培養(yǎng)的活性，具體來(lái)說(shuō)對(duì)Cgl1910，高2.1倍；對(duì)Cgl2134，高2.1倍；對(duì)Cgl2754，高2.0倍；對(duì)Cgl2818，高3.4倍以及對(duì)Cgl3029，高2.7倍(表3)。這些結(jié)果表明每一個(gè)啟動(dòng)子在存在賴氨酸的情況下誘導(dǎo)了β-半乳糖苷酶的表達(dá)。
表3在存在和不存在賴氨酸情況下啟動(dòng)子活性的比較

(2)存在或不存在250mM NaCl時(shí)啟動(dòng)子序列活性的測(cè)量[58]每一個(gè)啟動(dòng)子的活性依照與實(shí)施例4的(1)中相同的方法進(jìn)行測(cè)量，除了細(xì)胞被培養(yǎng)在存在或不存在NaCl而不是賴氨酸的情況下。結(jié)果被列在下面的表4里。如表4所示，在兩種培養(yǎng)條件下觀察到相似的β-半乳糖苷酶活性，也就是存在和不存在NaCl的條件下。這些結(jié)果排除了LacZ基因表達(dá)被賴氨酸以外的因素誘導(dǎo)的可能性，因此證明了，每一個(gè)啟動(dòng)子以對(duì)賴氨酸的特異性反應(yīng)而誘導(dǎo)基因表達(dá)。
表4在存在和不存在NaCl情況下啟動(dòng)子活性的比較

工業(yè)適用性[59]像在上文中描述的，本發(fā)明提供了對(duì)賴氨酸特異性反應(yīng)的、誘導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子核酸分子，因此本發(fā)明對(duì)開(kāi)發(fā)高效價(jià)細(xì)菌菌株十分有用，該菌株能高水平的表達(dá)編碼目標(biāo)蛋白的基因。
<110>希杰公司<120>新型的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子<160>15<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>578<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(578)<223>cgl1910的啟動(dòng)子<400>1aaccccgtag caaccagcga ctcactgacc acggtggctg ctgaggcctt gagcggcacg60atttcatcgc gctcgggcag atatttggtg gcaccttcgt ggcgcgcggc ggtgtacagc120accccggtga ccacattgat cacagcacct gccacgacct cgccgtcgat cgccgcagcg180atcgagacgg cgtattgggg caggtcataa aggaagttga cggtgccgtc aatggggtcg240acgatccagg taactccgct tatcgacgcc gtccccgtcc cttcctcgcc tatcagcccg300tctttaggcc gaagttcctg caacctattg gcgataaaat cttcagccaa agtatctact360atcgtcaccg gatcgactgt cgaacttttg gtgttggtgt agtcccacaa attggtgagt420tcagcacgct tatccctgat acgtacagcg gtaagcgtgg cagtttccgc ggcgatggca480cgcaactcat taaacgattg ttgttccata agaccatcat cgttgttttt ttagaaaatt540gcctgccaaa agccgaagta atttgtacac ttgggcgc578<210>2<211>500<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(500)<223>Cgl2134的啟動(dòng)子<400>2ttgcctctag tgggactggc tatgaaccga acgcagtgcc ggactaeatc cgatgatttt60ctcattgatc ccctgcatat cactgacggt gatgtaggcg aggaaatcga agcatatcta120gtgggtgcct actgcatcga agatgagctg attttacgcc ggcgaatccg cttcccgaga180ggagtcaaac caggagatat catcggaatt cctaacaccg caggatactt catgcatatc240ttggaaagtg catcgcacca aatcccgttg gcgaaaaatg tagtgtggcc ggaggggcag300ttagacgata tcgatgcgga ttaagacata accattcgct aatctttcga cgccccttct360gaggtgggga tttcttttca tcccctttaa ttattttcgg aaatttatac agcaatcctc420gaaatcctaa taaagatccc ttatcgtggg agaggtacgg tagttcgttc gaggacaacg480tcgagaaagg catgatttca500
<210>3<211>498<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(498)<223>Cgl2754的啟動(dòng)子<400>3atttcagcct gaaccttctc attgatgaca cttcaggctt gtgcctcctg gcactaatga60ggggaggttg tgatttctta catagtttag cgttcgtccg ccttgcgtac agcccggttt120gcaaagtttt attttgtaat tttcaaaccg atctcaattc cacgctttga gcagcacaaa180tgcttattgc cgtagaaaac aatacggagc ggttacaagt tgcgaagcac cctttgcaaa240gtttttagcg gtactttaca gctcttcacc ccccattaat ggggtctatg aaagcgcgca300gcgtgacaaa tctgacccca gcaaagcccc caatactccc cgactggcct ttattagtct360gcacttacca cgtatcatgg agggttgata gcagggcacc attagcagtc gcaccccgat420aggagtcgaa tctacaagtg gaacccccgc tcacatactc cacatttttt agaacccctt480taaggaatcg aactttat 498<210>4<211>498<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(498)<223>Cgl2818的啟動(dòng)子<400>4tgcttaattt cctcggcatg gttaagcggc tcggtgccgt cgattttcca ttggccttcg60ggcttaggct tcctggcggc acgtgctggc cgggcacttc cggtggttgt tgtcatgggg120agttaatcct taaagagcta gtgaagtaca tgtcactcgg tttgatctat ccgcaaactt180agacgtaccg ctctgtctag accaaccatt agattcatga gactgaaagc aatggagtca240cctaatgccc gtttaaatga attaacctgg ggatattagg ttaggttcac cgtgaatata300atagaccgat ctgtctagtt ttttcatgga gtttgaattt aattaagcaa aagtcttcgc360attgtcgcat ttcgctgcta cgtttacaga ccaagcggtc taggagtgtt aaacagcctg420gacttgaaac acctttaact acttgatttt cacacccttg tttccataaa agggctcacg480aaaggcaact tcaaacac 498<210>5<211>498<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(498)<223>Cgl3029的啟動(dòng)子<400>5
atggctgcgc atactgttgc gatggttgac gcgaagcgca gtcgcgaaac cccgcaggcg60cctgtttccg ctgaaattga agaggccggt ggtgtgacta ttacctcgcc gattatcaac120aagactccgc tgaatgcccc caagattgac ttggatgcag tgcgtagagc tgcggaaact180acgcaagaac ccaaaaatga ttaataattg agacaagctt cccactatgt gataaagtcc240cattttgtga ataactcttg tctcagtcaa agcacccagt ggtggtggcg cgctaactaa300gcgagcctga cacctcaagt tgttttcact ttgatgaatt ttttaaggct cgtacttcgt360tcgacgaaga agcgggcctt ttgtggtttt tagcccacaa ccggcaagcc ctggatcgaa420tgaagctcgc agcgagtaat tatttgatgt ttcccagaaa ggcttcagcc ccacaatgat480ttcctcggta ggtgcccc 498<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl1910基因的啟動(dòng)子的引物<400>6ttggatccaa ccccgtagca accagc 26<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl1910基因的啟動(dòng)子的引物<400>7gaggatccgc gcccaagtgt acaaatt27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2134基因的啟動(dòng)子的引物<400>8atggatcctt gcctctagtg ggactg 26<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2134基因的啟動(dòng)子的引物<400>9taggatcctg aaatcatgcc tttctcg27<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2754基因的啟動(dòng)子的引物<400>10taggatccat ttcagcctga accttc 26<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2754基因的啟動(dòng)子的引物<400>11caggatccat aaagttcgat tccttaaa28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2818基因的啟動(dòng)子的引物<400>12acggatcctg cttaatttcc tcggca 26<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl2818基因的啟動(dòng)子的引物<400>13atggatccgt gtttgaagtt gccttt 26<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl3029基因的啟動(dòng)子的引物<400>14aaggatccat ggctgcgcat actgttg 27<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增Cgl3029基因的啟動(dòng)子的引物<400>15atggatccgg ggcacctacc gaggaa 2權(quán)利要求
1.一種L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子，其選自(a)SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列；(b)與(a)中所述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核苷酸序列；以及(c)與(a)或(b)中所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.一種載體，包含權(quán)利要求1所述的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子。
3.一種原核宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求2所述的載體轉(zhuǎn)化。
4.如權(quán)利要求3中所述的原核宿主細(xì)胞，其是棒狀細(xì)菌。
5.一種使用權(quán)利要求1所述的L-賴氨酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的方法。
全文摘要
公開(kāi)的是新型的L－賴氨酸－誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子。也公開(kāi)的是包含該核酸分子的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及使用該L－賴氨酸－誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核酸分子誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101087881SQ200580044917
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者樸英薰, 具賢敏, 文準(zhǔn)玉, 金成俊, 金孝珍, 李廷基 申請(qǐng)人:希杰株式會(huì)社