金銀花hqt基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，尤其涉及一種金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
【背景技術(shù)】
[0002] 山東道地藥材金銀花（LonicerajaponicaThunb.)是忍冬科忍冬屬（Lonicera) 植物，具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。它含有的多種生 物活性成分中，綠原酸類化合物被認(rèn)為是其主要的有效成分，其含量高低是評(píng)價(jià)金銀花質(zhì) 量的重要指標(biāo)。因此，利用基因工程提高綠原酸含量對(duì)改善金銀花品質(zhì)有重要意義。（趙琰 玲，伊蓮.金銀花化學(xué)成分與有效成分提取研究進(jìn)展.藥學(xué)導(dǎo)報(bào)，2007, 26(5):521~523)
[0003] 近年來(lái)，對(duì)不同植物中的綠原酸合成的研究表明，綠原酸生物合成有三條可能的 途徑，其中通過(guò)羥基化肉桂酸輔酶A:奎寧酸肉桂酸羥基化轉(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoylCoA quinatehydroxy-cinnamoyltransferase,HQT)(Ulbrich, 1979)能催化咖啡酰輔酶A和 奎寧酸生成綠原酸，為合成綠原酸主要合成途徑。在富含綠原酸的植物如西紅柿、煙草、朝 鮮薊、咖啡和金銀花中都有HQT基因存在，HQT表達(dá)的組織部位與綠原酸在植物中的分布部 位具有相關(guān)性，它的表達(dá)量高低也關(guān)系到綠原酸含量高低。通過(guò)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 在過(guò)表達(dá)HQT基因的植物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)綠原酸含量明顯提高，植物自身抗病性和抗氧化脅 迫也大大增強(qiáng)。（LIUYing,PENGXiao-xiao.ResearchesontheRelativeExpression ofHQTGeneinDifferentOrgansofLonicerajaponica.JournalofChinese MedicinalMaterials, 2012, 35(7) ；CleCl,HillLM.Modulationofchlorogenicacid biosynthesisinSolanumlycopersicum!consequencesforphenolicaccumulation andUV-tolerance.Phytochemistry，2008 69(11) :2149-56;何柳，陳士林.植物中綠原酸 合成途徑研究進(jìn)展.藥物生物技術(shù)，2013, 20(5) :463~466)利用生物技術(shù)手段提高植物 中綠原酸含量，再結(jié)合化合物分離提取方法，將是大規(guī)模獲得綠原酸的可靠途徑。
[0004] 植物能夠根據(jù)外界環(huán)境變化調(diào)控不同基因的表達(dá)以適應(yīng)不同的生境變化。啟 動(dòng)子控制著基因表達(dá)的開(kāi)始，也很大程度上決定了基因表達(dá)的強(qiáng)度，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 著基因的時(shí)空和量的表達(dá)。植物啟動(dòng)子由核心元件和上游元件構(gòu)成，如TATA-box和 起始因子。在逆境相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列中還存在一些與逆境誘導(dǎo)相關(guān)，參與基因轉(zhuǎn) 錄調(diào)控的順式作用元件。目前研究較深入的有：脫落酸響應(yīng)元件（ABA-responsive element,ABRE)、乙稀響應(yīng)元件（ethylene-responsiveelement,ERE)、茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答 元件（jasmonate-responsiveelement,JRE)、低溫口向應(yīng)元件（low-tempraturereponsive element,LTRE)和干旱應(yīng)答元件（dehydration-responsiveelement,DRE)等。（朱剛萍， 于壯，等.植物逆境相關(guān)啟動(dòng)子及功能.遺傳.2010, 32(3) :229-234)對(duì)植物啟動(dòng)子的研 究有助與了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和其調(diào)控機(jī)制，且對(duì)特異性及誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的研究， 有助得到正常高效的轉(zhuǎn)基因植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的要求，本發(fā)明的目的是提供一種金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。
[0006] 本發(fā)明所述的金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下列核苷酸序列之一：
[0007] 1)序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列；
[0008] 2)與序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功 能的DNA序列。
[0009] 優(yōu)選的實(shí)施方式是：所述金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核苷酸序列是序列表 中SEQIDNo:1所述的序列，其由1891個(gè)堿基組成。
[0010] 再進(jìn)一步，含有所述金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)盒，表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基 因植株體系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 優(yōu)選的實(shí)施方式是：一種⑶S表達(dá)載體，其特征在于：所述⑶S表達(dá)載體是含有上 述金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的GUS表達(dá)載體。或者，一種轉(zhuǎn)基因植株體系，其特征 在于：所述轉(zhuǎn)基因植株體系是含有上述金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥株 系。
[0012] 申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室參照其它植物HQT保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以金銀花葉片cDNA為模 板，使用ExTaq(TaKaRa，Dalian,China)成功擴(kuò)增出金銀花LjHQT的核心片段，并根據(jù)已 獲得的LjHQT核心序列的5'端和3'端各設(shè)計(jì)3個(gè)基因特異引物，使用RACE技術(shù)獲得該 基因的兩端側(cè)翼序列，得到金銀花LjHQT基因的全長(zhǎng)序列。為了研究該基因的功能，構(gòu)建了 35S: =LjHQT過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入擬南芥，得到LjHQT基因過(guò)表達(dá)擬南芥，通過(guò)HPLC檢測(cè)了 各株系中綠原酸含量，結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因株系中均有綠原酸積累，野生擬南芥中不含有綠 原酸。實(shí)驗(yàn)確認(rèn)克隆得到的LjHQT基因確實(shí)為綠原酸的合成基因。
[0013] 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，金銀花HQT基因啟動(dòng)子在正常培養(yǎng)條件下能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因 轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明金銀花HQT基因在金銀花的生理過(guò)程中起一定的作用，在冷脅迫條件下，金 銀花HQT基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)，表明冷脅迫可以促進(jìn)金銀花HQT基因 的表達(dá)，這與植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物來(lái)抵御自然界不利環(huán)境相關(guān)，說(shuō)明金銀花HQT基因能 夠受到冷脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?；诖耍景l(fā)明利用缺失實(shí)驗(yàn)以尋找HQT啟動(dòng)子序列 上參與冷脅迫響應(yīng)的順式作用元件，獲得了一種金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證，本發(fā)明公開(kāi)的金銀花HQT基因冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在擬南芥的萼片、葉 脈維管束、雌蕊柱頭及腋芽中表達(dá)，且其表達(dá)受到低溫（_4°C)的誘導(dǎo)。預(yù)示本發(fā)明的啟動(dòng) 子將在HQT基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制中起到重要作用，且可以用來(lái)構(gòu)建冷脅迫響應(yīng)的誘導(dǎo)性啟 動(dòng)子。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為T(mén)ail PCR克隆HQT基因啟動(dòng)子流程圖。
[0015] 圖2為HQT基因Tail PCR結(jié)果電泳圖
[0016] 其中：M為以A作為Marker ;1-2為AD2與基因特異引物進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增，1、 2分別為第二、三輪產(chǎn)物；3-4為AD4與基因特異引物進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增，3、4分別為第二、 三輪產(chǎn)物；5-6為AD5與基因特異引物進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增，5、6分別為第二、三輪產(chǎn)物；7-8 為AD7與基因特異引物進(jìn)行TaiI-PCR擴(kuò)增，7、8分別為第二、三輪產(chǎn)物；9-10為AD8與基因 特異引物進(jìn)行TaiI-PCR擴(kuò)增，9、10分別為第二、三輪產(chǎn)物；11-12為AD9與基因特異引物進(jìn) 行Tail-PCR擴(kuò)增，11、12分別為第二、三輪產(chǎn)物。
[0017] 圖3為pCAMBIA1304載體結(jié)構(gòu)圖。
[0018] 圖4為pHQT::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥不同系T3代純系篩選及幼苗的⑶S染色結(jié)果圖
[0019] 其中：a，e為轉(zhuǎn)基因擬南芥純系T3-1的篩選及⑶S染色結(jié)果；b，f轉(zhuǎn)基因擬南芥 純系T3-2的篩選及⑶S染色結(jié)果；c，g為轉(zhuǎn)基因擬南芥純系T3-1的篩選及⑶S染色結(jié)果； d，h為轉(zhuǎn)基因擬南芥純系T3-1的篩選及⑶S染色結(jié)果。
[0020] 圖5為pHQT::⑶ST3-4轉(zhuǎn)基因擬南芥不同組織的⑶S染色結(jié)果圖
[0021] 其中：a為L(zhǎng)jHQT啟動(dòng)子全長(zhǎng)在萼片中的表達(dá)；b為L(zhǎng)jHQT啟動(dòng)子全長(zhǎng)在葉脈維管 束中的表達(dá)；c為L(zhǎng)jHQT啟動(dòng)子全長(zhǎng)在雌蕊柱頭中的表達(dá)；d為L(zhǎng)jHQT啟動(dòng)子全長(zhǎng)在腋芽中 的表達(dá)。
[0022] 圖6為未處理及冷處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的⑶S染色結(jié)果圖
[0023] 其中：a為對(duì)照；b為低溫處理下⑶S的染色結(jié)果。
[0024] 圖7為未處理及冷處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的⑶S酶活測(cè)定結(jié)果圖
[0025] 其中：CK為對(duì)照；Cold為低溫處理下⑶S酶活測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1，金銀花HQT基因啟動(dòng)子的獲得
[0027] I. ITail-PCR克隆得到金銀花HQT基因啟動(dòng)子序列
[0028] 參照文獻(xiàn)（鄭岑，張立瓶，等.TAIL-PCR技術(shù)及其在植物基因中的克隆.基 因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué).2009, 28(3) :544-548;羅麗娟，施季森.一種DNA側(cè)翼序列分離 技術(shù)一TAIL-PCR?南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2003, 6:87-90 ;Ya〇-GuangLiu，YuanlingChen. High-efficiencythermalasymmetricinterlacedPCRforamplificationofunknown flankingsequences.BioTechniques, 43:649-656)根據(jù)HQT的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì) 3 個(gè)嵌 套的特異性引物，分別為SP1，SP2和SP3 ;根據(jù)物種普遍存在的蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè) 計(jì)兼并引物AD。（引物序列：SP1，CCACTCGGAGAAGCAACGGAACT;SP2,ITGGATTA