專利名稱：：示差檢測多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及示差檢測多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，及其免疫測定試劑盒。
背景技術(shù)：
：通常已知構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽的多聚化是蛋白質(zhì)的功能需要的。但是，在一些蛋白質(zhì)中多聚體形式經(jīng)常引起疾病或者紊亂。特別是，蛋白質(zhì)在正常狀態(tài)下作為單體存在，而在異常狀態(tài)(例如，轉(zhuǎn)變?yōu)殄e折疊形式)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑垠w(或者聚集型)。已經(jīng)明確，錯折疊且最終聚集(或者蓄積的)的即那些不處于其機能相關(guān)構(gòu)象的蛋白質(zhì)缺乏正常生物活性，不能正確折疊或者不能保持正確折疊會引起許多不同類型的生物機能障礙，從而引起許多不同形式的疾病(MassimoStefani,等人，J.Mol.Med.81:678-699(2003);和RadfordSE,等人，Cell.97:291-298(1999))。許多疾病最終因存在于具有不正確結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子(即，不同于在正常機能有機體中蛋白質(zhì)分子)的生活系統(tǒng)而引起。例如，與蛋白質(zhì)異常聚集或者錯折疊有關(guān)的疾病或者紊亂包括阿耳茨海默(氏)病、痙攣性假性硬化(Creutzfeldt-Jakobdisease)、海綿狀腦病、帕金森(氏)病、亨廷頓病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥(Serpindeficiency)、肺氣肺、肝硬變、II型糖尿病、原發(fā)性全身性淀粉樣變性、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、額顳骨癡呆(Fronto-temporaldementias)、老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病、遺傳大腦淀粉樣血管病、以及與血透析有關(guān)的淀粉樣變性病(haemodialysis-relatedamyloidosis)。已經(jīng)集中開展與聚集有關(guān)的疾病的早期診斷。但是，沒有提出任何示差檢測多聚體(聚集)形式和其單體(正常)形式的任何方法過禾呈和方法。由于傳染性海綿狀腦病(TSE)(PrusinerS.B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13363-13383(1998);以及HopeJ.Curr.Opin.Genet.Dev.10，568-57(2000))，人的散發(fā)的、變異的、醫(yī)源性的和家族性的痙攣性假性硬化、庫魯病、家族性致命性失眠和格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)綜合征、綿羊和山羊的癢癢病、貓的貓海綿狀腦病、水貂海綿狀腦病、鹿、麋鹿和駝鹿的慢性消耗性疾病、以及牛的牛海綿狀腦病是致命的神經(jīng)變性疾病。已強烈地認(rèn)為朊病毒蛋白質(zhì)的異常同種型或者瘙癢病型(PrPSe)是TSE的主要致病原因(CaugheyB.TrendsBiochem.Sci.26:235-42(2001》。朊病毒蛋白質(zhì)的正常型(PrP"包括a-螺旋和靈活無序蛋白質(zhì)，并且作為單體形式存在(Zahn，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:145-150(2000))，而瘙癢病型(PrpS,具有高p-折疊構(gòu)象并且作為多聚體(聚集)或者至少為二聚體形式存在(Caughey,B.,等人，J.Biol.Chem.273:32230-35(1998))。從a-螺旋變?yōu)?3-折疊的構(gòu)象變化是似乎應(yīng)對其神經(jīng)病理學(xué)負(fù)責(zé)的疾病的結(jié)果。Prpe對蛋白酶(Prpse")敏感，而PrPe對蛋白水解作用有部分抗性并且易于形成高分子量聚集物(BoltonD.C.Lancet,358:164-5(2001))。后者的特征使得難于分析導(dǎo)致PrPreS形成或者表現(xiàn)其特征的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。通過消化細(xì)胞型而只保留瘙癢病型以在ELISA中4全測，已將蛋白酶K消化法用于鑒別PrP的多種形式(瘙癢病型)的抗性。但是，PK消化法正被質(zhì)疑。PrP構(gòu)象、濃度、組織抗體、消化時間和緩沖液會影響PK的敏感性，這極大地降低了PK消化法的可靠性。因此，尚需開發(fā)一種具有更高可靠性且便利的示差^r測多聚體形式(例如，PrP的瘙癢病型)和其單體形式(例如，PrP的細(xì)胞型)的新方法。本申請從始至終參考了多份專利和出版物，并將引用在括號中示出。為了更充分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
的現(xiàn)狀，這些專利和出版物在其實體中的公開以參考方式并入本申請。
發(fā)明內(nèi)容在這種情況下，本申請人已進行了深入的研究，開發(fā)出一種用于示差檢測多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體(聚集)形式的新方法，結(jié)果，通過使用唯——組捕捉和檢測抗體，開發(fā)出一種新穎的免疫測定法。因此，本發(fā)明的目的是提供一種示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的試劑盒。本發(fā)明的又一目的是提供一種基于凝集作用的用于示差檢測多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法。從隨后的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求和附圖中，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將變得顯而易見。圖1圖示了本發(fā)明的具體實施方式的方法。圖2圖示了基于凝集作用的本發(fā)明的具體實施方式的方法。圖3圖示了重組牛朊病毒蛋白質(zhì)的蛋白印跡分析結(jié)果。圖4為圖示了通過常規(guī)方法(SPIbio)或者本方法(MDS)對朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)的分析結(jié)果圖，以證明本方法可示差檢測朊病毒的多聚體(瘙癢病)形式(PrpSe)。圖5圖示了根據(jù)本發(fā)明檢測倉鼠腦勻漿中PrPSe多聚體的結(jié)果。使用不同蛋白水解酶(蛋白酶K和胰蛋白酶)獲得倉鼠腦勻漿。圖6a圖示了用于分析總PrP濃度的對照ELISA的結(jié)果。使用野生型和PrP剔除(PrPKO)小鼠的血漿樣本。圖6b圖示了本方法用于檢測野生型及PrP剔除(PrPKO)小鼠血漿樣本中朊病毒的多聚體形式(PrP"的結(jié)果。圖6c圖示了用于分析正常人血漿中總PrP濃度的對照ELISA的結(jié)果。圖7a-7c分別圖示了本方法用于檢測牛、小鼠和人重組朊病毒蛋白質(zhì)樣本中朊病毒的多聚體形式(PrpSe)的結(jié)果。圖8為圖示了本方法用于檢測刺入牛血漿中朊病毒的多聚體形式(Prpse)的結(jié)果圖。圖9圖示了根據(jù)對照ELISA和本方法(多聚體檢測系統(tǒng))用于濃縮的正常牛血漿的的實驗結(jié)果。圖10a顯示了本方法用于檢測正?；蛘唣W病倉鼠的血漿樣本中朊病毒的多聚體形式(PrpSe)的分析結(jié)果。圖10b顯示了本方法用于檢測正常或者CJD(痙攣性假性硬化)人的血漿樣本中朊病毒的多聚體形式(PrP"的分析結(jié)果。圖11顯示了使用混合捕捉抗體的本方法用于檢測刺入人血漿中朊病毒的多聚體形式(PrpSe)的分析結(jié)果。圖12為顯示本方法用于檢測刺入牛血漿中朊病毒的多聚體形式(Prps,的結(jié)果圖。具體實施例方式在本發(fā)明的一個方面中，提供了示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，該方法包括以下步驟(a)使生物樣本接觸識別多聚體形成的多肽上的表位的捕捉抗體以捕捉單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式；(b)使捕捉的單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式接觸檢測抗體，所述檢測抗體用于識別與步驟(a)的表位相同的或重疊的表位；以及(c)檢測多聚體形式-檢測抗體復(fù)合體的形成。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種用于示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的試劑盒，該試劑盒包括(a)捕捉抗體，其用于識別在多聚體形成的多肽上的表位；和(b)檢測抗體，其包括(a)捕捉抗體，其用于識別在多聚體形成的多肽上的表位；和(b)檢測抗體，其用于識別相同的或者與被捕捉抗體識別的表位重疊的表位。本發(fā)明涉及通過包括抗原-抗體反應(yīng)的免疫測定法，示差^r測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法。本方法被命名為"多聚體檢測方法"(簡寫作MDS)。在這里使用的術(shù)語"多聚體形成的多肽"是指能夠形成聚集物形式的多肽，特別是構(gòu)象變化后引起下述多種疾病的多肽，所述疾病例如，阿耳茨海默(氏)病、痙攣性假性硬化、海綿狀腦病、帕金森(氏)病、亨廷頓病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥、肺氣腫、肝硬變、II型糖尿病、原發(fā)性全身性淀粉樣變性、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、額顳骨癡呆、老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病、遺傳大腦淀粉樣血管病、以及與血透析有關(guān)的淀粉樣變性病。因此，術(shù)語"多聚體形成的多肽，，將可與術(shù)語"聚集體形成的多肽"相互交換使用。通常，多聚體形成的多肽的單體形式(例如，非聚集物形式)是正常的，而多聚體形式(例如，聚集物形式)是傳染性的，會引起疾病，特別是，神經(jīng)變性疾病，例如，阿耳茨海默(氏)病、痙攣性假性硬化。根據(jù)優(yōu)選實施方式，多聚體形成的多肽包括與阿耳茨海默(氏)病有關(guān)的A(3肽和微管相關(guān)蛋白、與痙攣性假性硬化和海綿狀腦病有關(guān)的朊病毒、與帕金森氏病有關(guān)的a-突觸核蛋白、與原發(fā)性全身性淀粉樣變性有關(guān)的Ig輕鏈、與繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病有關(guān)的血清淀粉樣蛋白A、與額顳骨癡呆有關(guān)的微管相關(guān)蛋白、與老年全身性淀粉樣變性有關(guān)的曱狀腺運載蛋白、與家族性淀粉樣多神經(jīng)病有關(guān)的曱狀腺素運載蛋白、與遺傳性大腦淀粉樣血管病有關(guān)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、與與血透析有關(guān)的淀粉樣變性病有關(guān)的(32-微球蛋白、與亨廷頓病有關(guān)的亨廷頓(huntingtin)、與肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化有關(guān)的超氧化物歧化酶、與絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥、肺氣肺和肝硬化有關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制劑、以及與II型糖尿病有關(guān)的糊精。更優(yōu)選地，多聚體形成的多肽為引起痙攣性假性硬化和海綿狀腦病的朊病毒蛋白質(zhì)。當(dāng)將本方法應(yīng)用于朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)時，單體形式為Prpe(朊病毒的細(xì)胞或者正常形式)，而多聚體形式為PrP&(朊病毒的瘙癢病或者傳染性形式)。本方法使用兩種類型的抗體，即捕捉抗體和檢測抗體。正如這里所使用的，術(shù)語"捕捉抗體"意指能夠結(jié)合生物樣本中目的多聚體形成的多肽的抗體。術(shù)語"檢測抗體"意指能夠結(jié)合被捕捉抗體捕捉的多聚體形成的多肽的抗體。"抗體"指的是能結(jié)合抗原的免疫球蛋白蛋白質(zhì)。在這里使用的抗體意味著包括能夠結(jié)合目的表位、抗原或者抗原片段的完全抗體和任何抗體片段(例如，F(xiàn)(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。本發(fā)明的顯著特征為使用了能特異地識別多聚體形成的多肽上的表位的一組捕捉抗體和檢測抗體，其中通過捕捉抗體和4企測抗體特異識別的表位是相同的或者相互重疊。在這里使用的與捕捉和檢測抗體的表位"重疊，，的術(shù)語包括具有完全或者部分重疊的氨基酸序列的表位。例如，這如實施方式所示，對于308和3F4抗體的表位分別具有跨越人朊病毒序列的氨基酸106-126和109-112的氨基酸序列。這種表位可以被描述為完全重疊表位。根據(jù)特定和優(yōu)選實施方式，如果指明與人朊病毒序列有關(guān)，表位具有跨越氨基酸109-112、106-126、132-147、135-140、146-151、144-153、143-151、129-149或者112-125,更優(yōu)選氨基酸109-112、106-126、132-147、135-140、146-151、143-151,并且最優(yōu)選氨基酸109-112、106-126、132-147或者135-140的氨基酸序列。如美國專利號4,806,627所述，與PrP鵬-u2反應(yīng)的最優(yōu)選抗體為3F4(由Sigma銷售)。如HisakoFumkawa等人在J.Biol.Chem.，279:23661-23667(2004)中所述，與PrP,o6.i26反應(yīng)的最優(yōu)選抗體為308。根據(jù)優(yōu)選實施方式，被捕捉抗體特異識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。優(yōu)選地，被檢測抗體特異識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。根據(jù)本方法，由于缺乏被檢測抗體識別的額外表位，結(jié)合捕捉抗體的多聚體形成的多肽不能進一步與^^測抗體結(jié)合。應(yīng)首先選擇用于制備捕捉和/或檢測抗體的表位以使其在多聚體形成的多肽上僅被發(fā)現(xiàn)一次。例如，gly重復(fù)序列存在于朊病毒上的多個位置；因此，其不適合作為本發(fā)明的表位。優(yōu)選地，如果表示有關(guān)SEQIDNO:l中描述的人朊病毒序列，在氨基酸95-180選擇表位。更優(yōu)選地，在氨基酸100-160，并且最優(yōu)選109-153選4奪表位。根據(jù)特定和優(yōu)選實施方式，如果指明與人朊病毒序列有關(guān)，表位具有跨越氨基酸109-112、106-126、132-147、135-140、146-151、144-153、143-151、129-149或者112-125，更優(yōu)選氨基酸109-112、106-126、132-147、135-140、146-151、143-151，并且最優(yōu)選109-112、106-126、132-147或者135-140的氨基酸序列。如在美國專利號4,806,627中所述，與PrP鵬-u2反應(yīng)的最優(yōu)選抗體為3F4(由Sigma銷售)。如HisakoFumkawa等人在J.Biol.Chem"279:23661-23667(2004)中所述，與PrP賜-m反應(yīng)的最優(yōu)選抗體為308(由CaymanChemical銷售)。如YoichiMatsunaga等人在Proteins,44:110(2001)中所述，MAl-750(由AffinityBioReagents公司銷售)是與PrP132-I47反應(yīng)的最優(yōu)選抗體。如HirokoHayashi等人在J.Vet.Med.Sci.，66(6):515(2004)中所述，T2是與PrPm-M。反應(yīng)的最優(yōu)選抗體。最優(yōu)選地，特定識別PrP14(M51、PrP144-153、PrP,4W5,、PrP,29.i49和PrPu2-,25的抗體分別為1F5、SAF抗體(由CaymanChemical銷售)、6H4(由PrionicsAG銷售)、1E5/G6(由NovusBiologicals銷售)和7B6/D2(由NovusBiologicals銷售)。在將本方法用于牛生物樣本的情況下，識別氨基酸135-140(如果指明與牛朊病毒序列有關(guān)，SEQIDNO:2的氨基酸145-150)(例如，T2抗體)或者132-147(如果指明與牛朊病毒序列有關(guān)，SEQIDNO:2的氨基酸142-157)(例如，MA1-750抗體)的表位的抗體是最優(yōu)選的。例如，在對于牛樣本的本方法中，用于捕捉和檢測抗體的一系列抗體組MA1-750/MA1-750、MAl-750/T2、T2/T2或者T2/MA1-750是非常有用的。在本方法用于分析來自人的生物樣本(特別是，血漿)的情況下，優(yōu)選使用針對氨基酸109-112(例如，3F4抗體)、106-126(例如，308抗體)、135-140(例如，T2抗體)或者132-147(例如，MA1-750抗體)的表位的抗體，更優(yōu)選，針對氨基酸109-112(例如，3F4抗體)、106-126(例如，308抗體)和135-140(例如，T2抗體)的表位的抗體，并且最優(yōu)選，針對氨基酸109-112(例如，3F4抗體)和106-126(例如，308抗體)的表位的抗體。例如，在對于人樣本(特別是血漿)的本方法中，用于捕捉和檢測抗體的一系列抗體組3F4/3F4、3F4/308、308/3F4或者308/308是非常有用的。優(yōu)選地，捕捉抗體和檢測抗體彼此相同。也就是說，特異結(jié)合捕捉抗體和4企測抗體的表位優(yōu)選是相同的。根據(jù)優(yōu)選實施方式，捕捉抗體與固體基質(zhì)結(jié)合。這一類型的已知材料包括碳?xì)浠衔锞酆衔铮?，聚苯乙烯和聚丙烯、玻璃、金屬和凝膠。固體基質(zhì)可以為以下形式浸漬片、微量滴定板、顆粒(例如，微球)、親和層析柱和免疫印跡膜(例如，聚偏l，l-二氟乙烯膜)(參見美國專利號5,143,825、5,374,530、4,908,305和5,498,551)。最優(yōu)選地，固體基質(zhì)為微量滴定板。根據(jù)優(yōu)選實施方式，4企測抗體具有產(chǎn)生可^r測信號的標(biāo)記。該標(biāo)記包括，但是不限于，化學(xué)的(例如，生物素)、酶的(例如，堿性磷酸酶、過氧化物酶、P-半乳糖香酶和p-葡萄糖苷酶)、放射性的(例如，1125和C14)、熒光的(例如，熒光素)、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)標(biāo)記。在本領(lǐng)域中，已知多種用于標(biāo)記抗體的沖示i己禾口方法(Harlow禾口Lane,編4辱，Antibodies:ALaboratoryManual(1988)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。最優(yōu)選地，檢測抗體為用生物素或者辣根過氧化物酶標(biāo)記。在本發(fā)明中，根據(jù)常規(guī)技術(shù)，使用前述抗源表位作為免疫原制備能夠結(jié)合多聚體形成的多肽的抗體，所述常規(guī)技術(shù)例如融合法(Kohler和Milstein,EuropeanJournalofImmunology,6:511-519(1976》、重組DNA法(USP4，816,56)或者噬菌體抗體庫(Clackson等人，Nature,352:624-628(1991);以及Marks等人，J.Mol.Biol"222:58,1-597(1991))。在Harlow,E.和Lane,D.，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,纟丑約，1988;Zola,H.，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.,BocaRaton,Florida,1984;以及Coligan,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Wiley/GreeneNY,1991中，描述了抗體制備的一般程序。通過融合無限增殖細(xì)胞系和抗體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，制備用于單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系。這可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行?？梢酝ㄟ^將上述抗原注射適當(dāng)?shù)膭游铮占瘉碜詣游锏陌贵w的抗血清，以及通過任意的已知的親和技術(shù)分離特異性抗體，制備多克隆抗體。"生物樣本"為測試物質(zhì)的來自生物體的樣本。該生物樣本指任何細(xì)胞、組織或來自生物源的流體，或者任何根據(jù)本發(fā)明能夠被有利地評估的其它物質(zhì)，其包括取自人的樣本、取自動物的樣本、取自為人或者動物消費的食物樣本。優(yōu)選地，測試的生物樣本為包括血、血清、血漿、淋巴、乳、尿、糞便、眼分泌物、唾液、精液、腦提取物(例如，腦勻漿)、脊髓液(SCF)、闌尾、脾臟和扁桃體組織提取物的體液樣本。更優(yōu)選地，生物樣本為腦勻漿或者血漿，最優(yōu)選地為血漿。在將腦勻漿用作生物樣本的情況下，其優(yōu)點在于，本方法進一步包括在步驟(a)之前用胰蛋白酶處理生物樣本的步驟。所述腦勻漿樣本包括抑制目的聚集體形成的多肽與捕捉抗體和/或者檢測抗體結(jié)合的其它蛋白質(zhì)和物質(zhì)。通過胰蛋白酶消化防止這一基質(zhì)抑制作用。在下述實施例IV證明了胰蛋白酶處理的優(yōu)點。由于PK消化了PrpSc,其應(yīng)對假陰性數(shù)據(jù)的發(fā)生可能性負(fù)責(zé)，所以常規(guī)用于朊病毒;f企測方法的蛋白酶K(PK)處理是不令人滿意的。本方法的優(yōu)點之一是不需要常規(guī)用于區(qū)分PrPSe和PrPe的PK處理。本MDS方法本身顯示出對于區(qū)分PrPSe和PrPe而無需PK處理的充分潛能。在使用血漿作為生物樣本的情況下，正如實施例10所證明，可以完全不需要對蛋白水解酶處理，這是本發(fā)明的顯著優(yōu)點。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本方法進一步包括在步驟(a)之前用蛋白質(zhì)變性劑處理生物樣本。這種蛋白質(zhì)變性劑使聚集體形成的多肽的表位被暴露，以便顯著提高捕捉/檢測抗體與聚集體形成的多肽的結(jié)合。蛋白質(zhì)變性劑可以包括本領(lǐng)域已知的任何蛋白質(zhì)變性劑，例如，尿素、四曱脲、鹽酸胍、硫氰酸胍(guanidinethiocynide)和十二烷基硫酸鈉。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變性劑為尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍，最優(yōu)選地為鹽酸胍。所述蛋白質(zhì)變性劑的濃度，特別是，鹽酸胍的濃度在0.3-4M,優(yōu)選地為0.3-3M，更優(yōu)選地為0.5-2M的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選為約1M。所述蛋白質(zhì)變性劑的處理時間，特別是，鹽酸胍的處理時間在5-60min,優(yōu)選地為10-50min，更優(yōu)選地為10-40min，并且最優(yōu)選地為15-20min的范圍內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本方法進一步包括在步驟(a)之前加熱生物樣本。在使用腦勻漿作為生物樣本的情況下，在70-100。C的溫度，優(yōu)選在80-10(TC,更優(yōu)選在90-100。C，并且最優(yōu)選在約100。C進行加熱。在使用血漿作為生物樣本的情況下，在40-100。C的溫度，優(yōu)選在50-80°C,更優(yōu)選在60-80。C,并且最優(yōu)選在大約70。C進行加熱。優(yōu)選地，生物樣本包括除垢劑。用于本方法的除垢劑可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何除垢劑，優(yōu)選地為肌氨酰(N-十二烷基肌氨酸)、例如TritonX-1OO(聚氧乙烯烷基酚)的Triton系列、去氧膽酸鈉、例如zwittergent-16的兩性離子表面活性劑及它們的混合物，并且更優(yōu)選為肌氨酰(N-十二烷基肌氨酸)、TritonX-IOO、去氧膽酸鈉、zwittergent-16和它們的混合物。最優(yōu)選地，在將腦勻漿用作生物樣本的情況下，包含在生物樣本中的除垢劑為TritonX-l00和去氧膽酸鈉的混合物。最優(yōu)選地，包含在血漿樣本中的除垢劑為肌氨酰、TritonX-100、去氧膽酸鈉和zwittergent-16的混合物。這一除垢劑的濃度為至少0.5重量％,優(yōu)選為0.5-3重量％。在將腦勻漿用作生物樣本的情況下，除垢劑的濃度為1.0-3.5重量％,優(yōu)選為1.5-3.0重量％,更優(yōu)選為2.0-3.0重量％，并且最優(yōu)選為大約2.5重量％。所述血漿樣本包含比腦勻漿低的除垢劑的濃度，優(yōu)選地為0.2-2.5重量％,更優(yōu)選地為0.3-2.0重量％，更優(yōu)選為0.5-1.5重量％,并且最優(yōu)選為大約0.6-1.0重量％。當(dāng)使用血漿作為生物樣本的情況下，由于其部分地有助于改進本方法的最終信號的產(chǎn)生，所以肌氨酰除垢劑的使用是具有優(yōu)點的。根據(jù)優(yōu)選實施方式，當(dāng)使用血漿作為生物樣本時，本方法進一步包括在步驟(a)之前用對血纖維蛋白溶酶原的抑制劑處理生物樣本。在這里所使用的術(shù)語"對血纖維蛋白溶酶原的抑制劑"意指抑制血纖維蛋白溶酶原活化的物質(zhì)，例如，鏈球菌激酶、尿激酶或者組織激活劑。通常通過阻斷位于涉及在纖維蛋白溶酶和纖維蛋白單體之間的結(jié)合中的血纖維蛋白溶酶原上的賴氨酸的結(jié)合位置，完成這種抑制作用。更優(yōu)選地，所述對血纖維蛋白溶酶原的抑制劑包含(O-氨基羧酸(例如，4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸(氨基己酸，ACA)和7-氨基庚酸)、L-賴氨酸及其衍生物(N乙酰基-L-賴氨酸、L-賴氨酸-曱酯和N-乙酰基-L-賴氨酸-曱酯)、兩性離子[例如，反-(氨曱基)環(huán)己烷羧酸(AMCHA)、對苯曱基胺磺酸和兩性離子的Y-胍基丁酸)、千胺、苯曱脒、L-精氨酸及其衍生物(Nalpha-乙?；?L-精氨酸、Nalpha-乙?；?L-精氨酸曱酯和L-精氨酸曱酯)。進一步優(yōu)選地，所述抑制劑為氨基己酸或者反式-(氨甲基)環(huán)己烷羧酸，最優(yōu)選為反-(氨曱基)環(huán)己烷羧酸。通過血纖維蛋白溶酶原的抑制劑對樣本的預(yù)處理提高了對多聚體(特別是，PrPSe)和單體的示差檢測。可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進行多聚體形式4全測抗體復(fù)合體的檢測。多聚體形式-檢測抗體復(fù)合體的形成表明生物樣本中存在多聚體開^式?？梢圆鹏薏啪永齣口，如EnzymeImmunoassay,E.T.Maggio,編豐專，CRCPress,BocaRaton,Florida,1980和HarlowandLane,編輯，Antibodies:ALaboratoryManual(1988)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y中所述，使用多種可4企測信號的標(biāo)記/底物對的常規(guī)方法定量或者定性地進行這一步驟。在用堿性磷酸酶標(biāo)記檢測抗體的情況下，可以使用溴氯。引哚基磷酸酯(BCIP)、氮藍(lán)四唑(NBT)和ECF作為用于顯色反應(yīng)的底物；在用辣根過氧化物酶標(biāo)記的情況下，可以使用氯萘酚、氨乙基啼唑、二氨基聯(lián)苯胺、D-熒光素、光澤精(雙-N-曱基吖啶鑰硝酸鹽(bis-N-methylacridiniumnitrate))、試卣靈二節(jié)醚、魯米諾、AmplexRedReagent、(10-乙?；?3，7-二羥基吩噁溱)，TMB(3,3，5,5-四曱基聯(lián)苯胺)和ABTS(2,2-吖嗪-二[3-乙基苯噻唑啉磺酸酯])作為底物。其它標(biāo)記/底物對包括生物素/鏈霉抗生物素和螢光素酶/焚光素?；旌喜蹲娇贵w為與檢測抗體表位相同的或者重疊的反應(yīng)性表位，本發(fā)明也包括僅同時使用多種類型的抗體作為捕捉抗體。正如實施例XI所述，使用混合捕捉抗體例如3.08和3F4的本發(fā)明，可以示差檢測PrpSc和PrPc。根據(jù)圖1所示的本發(fā)明的特定實施方式，對本發(fā)明的步驟進行了更詳細(xì)的描述。在將包含例如PrPSe和PrPe的同種型PrP的生物樣本應(yīng)用于包被有捕捉抗體的微量培養(yǎng)板的情況下，PrP&和Prpe均與捕捉抗體結(jié)合。由捕捉抗體識別的表位(以淺的梯形表示)是朊病毒蛋白質(zhì)中的非重復(fù)序列。然后，HPR標(biāo)記的檢測抗體與由捕捉抗體捕捉的PrPSe和PrPe相接觸，該HPR標(biāo)記的4企測抗體可識別與捕4足抗體的表位相同的或者重疊的表位。由于Prpe上的表位已經(jīng)被捕捉抗體所覆蓋，所以檢測抗體不會與僅具有一種表位序列的Prpe相結(jié)合。相比之下，由于PrP&具有多個表位，所以檢測抗體與PrpSe上空的表位結(jié)合。在檢測抗體處理之后，清洗樣i量培養(yǎng)板并與HRP的底物(例如，TMB(3,3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺))進行孵育以誘導(dǎo)比色反應(yīng)。最后，測試在450nm的吸光度以確定是否形成了PrpSe-抗體復(fù)合體?；蛘?，設(shè)計本發(fā)明以進行基于凝集反應(yīng)的分析過程。在這種情況下，本方法包括如下步驟(a)使生物樣本接觸識別多聚體形成的多肽上的表位的捕捉抗體以捕捉所述的單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式，其中捕捉抗體與固體載體結(jié)合；以及(b)測定在結(jié)合了固體載體的捕捉抗體和多聚體形成的多肽之間發(fā)生的凝集，其中凝集的發(fā)生表明生物樣本中存在多聚體形式。由于本凝集過程是上述MDS過程的變形，所以省略了它們之間的相同描述以避免會使本說明書復(fù)雜的不適當(dāng)重復(fù)。例如，對于多聚體形成的多肽的描述，捕捉抗體和生物樣本是它們之間的共同之處。根據(jù)優(yōu)選實施方式，結(jié)合了捕捉抗體的固體基質(zhì)為例如凝膠、乳膠、聚苯乙烯和膠體金球的微球，更優(yōu)選為乳膠微球。這些載體的尺寸可以選自0.3nm至20)im直徑的范圍，并且最佳尺寸可以根據(jù)使用的凝集評價法而選擇。例如，對于凝集的宏觀評價，合意的是使用0.2至3(am直徑的載體，對其的宏觀判斷是容易的。根據(jù)圖2所示的特定實施方式，將對本凝集過程進行更詳細(xì)地描述。使用抗體包被作為固體基質(zhì)的微球以結(jié)合朊病毒蛋白質(zhì)上的表位(優(yōu)選為非重復(fù)表位)。在所述微球接觸包含PrpSe和Prpe的生物樣本的情況下，PrpSe和Prpe結(jié)合了與微球結(jié)合的抗體。而且，承載多個表位的PrpSe結(jié)合許多微球上的抗體以形成PrpS7微球的復(fù)合體，從而導(dǎo)致凝集。但是，由于Prpe有一個表位，所以Prpe不產(chǎn)生凝集。依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，可以容易地確定凝集的發(fā)生。總的來說，對本發(fā)明的突出優(yōu)點的描述如下(i)MDS要求無特定的多聚體抗體。例如，其不由特定的PrpSe抗體決定。在PrP&和Prpe之間具有交叉反應(yīng)性的抗體可以成功地應(yīng)用于本發(fā)明用以示差^r測生物樣本中的PrPSc;(ii)本發(fā)明不需要通常已被用于PrP&檢測的蛋白酶K(PK)處理。本MDS法本身顯示出無需PK處理的區(qū)分PrpSe和Prpe的充分潛能；(iii)本發(fā)明能夠通過免疫測定檢測血漿樣本中的聚集形式(特別是，PrPSe)。還沒有關(guān)于血漿中PrP"的成功檢測的建議；以及(iv)本發(fā)明能夠以方便和快捷的方式進行，其能夠使MDS自動化。以下特定實施方式為本發(fā)明的示例性說明，并且不應(yīng)被解釋為對所附權(quán)利要求所定義的發(fā)明范圍的限制。具體實施方式材料3F4和3F4-生物素抗體分別從Sigma(美國)和Abeam有限公司(英國)購得。308和MA1-750抗體從CaymanChemical7>司和AffinityBioReagents公司(美國)購得。T2-HRP和1F5抗體由國家動物健康研究所(NationalInstituteofAnimalHealth)(日本)提供，牛和倉鼠重組(23-231)朊病毒蛋白質(zhì)從PrionicsAG(CH)和AliconAG(CH)購得。小鼠和人重組(23-231)朊病毒蛋白質(zhì)由馬里蘭大學(xué)和國家動物健康研究所(曰本)提供。年齡相當(dāng)?shù)恼５暮宛W病倉鼠腦勻漿分別從SLC有限公司(日本)和巴爾的摩研究和教育基金會購得。HRP結(jié)合的抗小鼠IgG和增強化學(xué)發(fā)光試劑盒從AmershamBiosciences(英國)購得。PVDF膜從Bio-Rad^>司(美國)購得。Startingblock乂人PierceBiotechnology公司(美國)購得。X光膠片從富士公司(日本)購得。化學(xué)發(fā)光HRP底物SupersignalWestPico來自PierceBiotechnology公司(美國)。TMB來自Sigma(美國)。來自腦勻漿的純化小鼠PrPSe由動物健康國家研究所(日本)提供。胰蛋白酶從Fluka(美國)購得。蛋白酶抑制劑混合物來自Sigma(美國)。實施例I:重組朊病毒蛋白質(zhì)的蛋白印跡分析將0.2ng重組牛朊病毒蛋白質(zhì)(PrP23-231,來自馬里蘭大學(xué))裝入沒有變性劑的非變性凝膠中(12.5%SDS-PAGE)并在4。C將凝膠內(nèi)容物轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Bio-Rad)12小時以上。在TBS中用50%Startingblock(P正RCE)封閉PVDF印跡。然后，使用6H4抗體(PrionicsAG)作為一級抗體，并且使用HRP結(jié)合的小鼠抗體IgG(Amersham)作為用于檢測的二級抗體。通過在X光膠片(富士)曝光，使增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測以顯影印跡。；險測朊病毒多聚體，例如，二聚體、三聚體和更高分子帶。如圖3所示，結(jié)果顯示，重組牛朊病毒蛋白質(zhì)樣本中存在多種朊病毒多聚體和單體，并且能夠通過6H4抗朊病毒抗體4企測。實施例II:用于檢測PrPSe的MDS的可使用性評估制備包被MAl-750的板。使30昭MAI-750抗體(抗朊病毒蛋白質(zhì),AffinityBioreagents公司)懸浮在10|al的200mMMOPS中并以100jil的體積等分進免疫模量板(Nunc-468667)的每個孔中，隨后在4°C下聘育過夜。用PBS清洗培養(yǎng)板，并且在室溫下用在PBS中的卵清蛋白將其封閉1小時。在4%zwittergent(Anaphase公司，美國)中將10%牛腦勻漿連續(xù)稀釋4倍，等分入包被MAl-750抗體的培養(yǎng)板中，然后在37。C孵育1小時。MA1-750抗體特異地識別在PrPe上的表位Ser-Arg-Pro-Leu-IIe-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg,其為朊病毒中發(fā)現(xiàn)的非重復(fù)序列。用TBST清洗該培養(yǎng)板5次，并且用MAl-750-HRP(在TBST中，l:2000)在37。C醉育1小時。孵育后，用PBS清洗該培養(yǎng)板并且通過用HRP底物3，3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺(TMB,SIGMA公司)孵育30分鐘定量測定HRP活性。使用SpectraMaxPlus384(MoledularDevice公司)在450nm測定顯色信號。為了比較，使用從SPIbio公司(目錄號A05201)購得的用于PrPc的酶免疫測定試劑盒。在4%zwittergent(Anaphase公司，美國)中將10%牛腦勻漿連續(xù)稀釋4倍，等分入包被MAl-750抗體的培養(yǎng)板，然后在37。C孵育1小時。用TBST清洗該培養(yǎng)板5次，并且于37。C用包含在SPIbio's試劑盒中的抗朊病毒示蹤物(識別在PrPe的氨基末端的八-重復(fù)序列)孵育l小時。然后用SPIbio's洗滌緩沖液清洗該培養(yǎng)板，并且用200|ilEllman's試劑將育30分鐘用以顯色。使用SpectraMaxPlus384(MoledularDevice公司)在400證測定顯色信號。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在表l中，NSB(非特異性結(jié)合)表示無牛腦勻漿的實驗組，背景表示僅使用顯色底物無抗體孵育的實驗組。正如表1和圖4所示，揭示出本發(fā)明的MDS在最終顏色信號中完全排除Prpe的參與。這一結(jié)果歸因于MA1-750作為捕捉和檢測抗體的雙重利用，這是本發(fā)明的顯著特征。另外，MDS的這種區(qū)分潛能部分是由于以下事實被MA1-750識別的表位在朊病毒中是非重復(fù)序列。相反，SPIbio's試劑盒顯示出較高OD值，這表明Prpe對最終顏色信號結(jié)果的作用。因此，應(yīng)該理解，本發(fā)明的MDS可以特異地檢測樣本中的PrPSc。實施例III:通過凝集反應(yīng)檢測朊病毒蛋白質(zhì)的多聚體形式制備多聚體形式的重組牛朊病毒蛋白質(zhì)。將3.1(ag重組牛朊病毒蛋白質(zhì)溶解在700(il偶聯(lián)緩沖液(5mM磷酸氳二鉀，75mMNaCl,pH6.5),并且在室溫下與EDC[l-乙基-3-(3-二曱基氨丙基)碳二亞胺，SigmaE6383)溶液反應(yīng)24小時。用MA1-750抗體包被乳膠纟效球。將70MA1-750抗體與4ml偶聯(lián)緩沖液(5mM磷酸氫二鉀，75mMNaCl，pH6.5)混合，并且離心用于濃縮。將70iil乳膠微球(羧化物改性乳膠微球，SigmaL5530)離心用以沉淀，并且除去生成上層清液。向其中加入偶聯(lián)溶液，將70pl微球懸浮液與EDC溶液混合，并且與70pl濃縮MA1-750抗體孵育，隨后在室溫下孵育24小時。通過離心沉淀經(jīng)包被的微球，用洗滌緩沖液(IOmMTris，150mMNaCl，lmMEDTA,0.1%卵清蛋白，pH7.5)再次進行懸浮，并且再次沉淀。將沉淀的微球溶解在70|ilPBS中。然后，將10(xl包被MA1-750的乳膠微球與經(jīng)EDS處理或未經(jīng)EDS處理的10jal1%牛腦勻漿，或者45ng經(jīng)EDS處理或未經(jīng)EDS處理的重組牛朊病毒蛋白質(zhì)混合，而后，在焚光顯孩史鏡(x400，CarlZeissAxiovert100)下^見察生成物。結(jié)果，觀察到，在未經(jīng)EDC處理的牛腦勻漿中發(fā)生了非常輕微的凝集。這種輕微的凝集歸因于由存在于牛腦勻漿中的少量PrPSe形成的多聚體朊病毒。與此相反，觀察到重組朊病毒蛋白質(zhì)僅在經(jīng)EDC處理的多聚體朊病毒樣本中凝集。因此，可以認(rèn)為，本發(fā)明的凝集過程可進行樣本中PrpSc的示差檢測。實施例IV:倉鼠腦勻漿中Prpse多聚體的檢測倉鼠瘙癢病腦勻漿(IO重量％)是購買的預(yù)先制得的樣本。使用PBS和勻化器制備年齡相當(dāng)?shù)恼ＤX勻漿(IO重量％)。在37。C使用胰蛋白酶(5mg/ml)消化腦勻漿1小時，并且通過胰蛋白酶抑制劑混合物使胰蛋白消化停止。用8M的鹽酸胍(Sigma,Gdn-HCl)處理樣本而生成1.0M,隨后在環(huán)境溫度下孵育15分鐘。然后，用TBST、2%TritonX-100和0.5%脫氧膽酸鈉進一步稀釋該樣本以生成0.25MGdn-HCl。在100。C加熱該樣本5-10分鐘。在樣本達到環(huán)境溫度之后，將該樣本用于MDS。對于MDS組，使用包被在培養(yǎng)板上的T2作為捕捉抗體并用T2-HRP作為檢測抗體。將100pl樣本應(yīng)用于包被了T2的培養(yǎng)板上，并在37。C下孵育1小時同時震蕩。隨后用TBST清洗4次，將100|alT2-HRP(l嗎/ml)用于檢測在包被了T2的培養(yǎng)板上被捕捉的多聚體。在環(huán)境溫度下孵育該培養(yǎng)板1小時，并用TBST清洗4次。向每孔中加入100filTMB并且維持30分鐘以使信號顯影。加入50fil1NH2S04以使信號停止，并且在450nm用板式分光光度計(platespectrophometer)測定該培養(yǎng)板。正如圖5所示，在瘙癢病倉鼠腦勻漿中觀察到許多比正常樣本高的多的信號。蛋白酶K或者胰蛋白酶處理導(dǎo)致正常Prpc的完全消化。使用蛋白酶K或者胰蛋白酶消化使在正常和瘙癢病樣本間的信號分化變得更大?？梢杂^察到，蛋白酶K部分地消化了瘙癢病樣本，正如上述出版物所述，這是在蛋白水解酶K參與的朊病毒測定法中形成錯誤的陰性結(jié)果的原因。相反，顯示出胰蛋白酶處理沒有消化瘙癢病形式，從而致使PrpSe檢測的顯著改進。通過MDS在倉鼠瘙癢病腦勻漿中而不是正常倉鼠樣本，檢測到PrPSc(多聚體)。實施例V:血漿的制備從正?；蛘呱l(fā)性CJD患者抽取血樣并裝入放有檸檬酸鈉、EDTA和肝素的試管中，優(yōu)選放入肝素中。為了獲得血漿，采用正常血漿收集步驟。將試管1000xg和/或2800xg中離心10-15分鐘。分離澄清的上清液并在-80。C下儲存直至使用。從多于5只動物的庫中獲得年齡相當(dāng)?shù)恼：透腥攫W病的倉鼠血漿，并裝入有檸檬酸鈉的試管中。如上所述獲得血漿。對用于MDS血漿樣本處理，將血漿與鹽酸胍(Sigma，Gdn-HCl)混合以生成1-2M的最終濃度，并在室溫或37。C下孵育15-60分鐘。用包含除垢劑0.02%肌氨酰(Sigma),0.5%TritonX陽100(SamchunChemical),0.125%去氧膽酸鈉(Sigma)和0.5%或1%zwittergent-16(Anaphase公司，美國)的TBS或者PBS緩沖液稀釋樣本，并在室溫下孵育15分鐘或者在37。C孵育15-60分鐘以得到0.125-0.5M變性劑最終反應(yīng)濃度。然后將樣本加熱至70。C保持15分鐘，而后保持在室溫。實施例VI:對于總PrP濃度的PrpSe對照ELISA通過以下常規(guī)方法制備包被抗體的培養(yǎng)板。308(Cayman)和3F4(Sigma)的表位是重疊的，其中KTNMKHMAGAAAAGAWGGLG(106-126)和MKHM(109-112)分別為特異性表位。為了通過對照ELISA檢測人血漿中的總朊病毒蛋白質(zhì)，通過以l-5嗎/ml的濃度使用包被緩沖液(BupH碳酸鹽-碳酸氫鹽；PIERCE)，將308、3F4或者308與3F4的混合物包被在96孔聚苯乙烯微量滴定板(NUNC)上。在4。C孵育該培養(yǎng)板過夜并在室溫下用在TBS或者PBS(pH7.4)中的Startingblock(PIERCE)或者BlockAce(Serotec)封閉30-60分鐘。為了通過對照ELISA檢測小鼠和牛血漿中的總朊病毒蛋白，使用1F5抗朊病毒抗體作為捕捉抗體，T2-HRP作為檢測抗體。由于3F4和308不會與來自小鼠或者牛的朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合，所以使用能夠結(jié)合小鼠和牛朊病毒蛋白質(zhì)的1F5抗體。從野生型和PrP剔除小鼠獲得血漿樣本以檢測小鼠朊病毒，并從正常人獲得血漿樣本以;險測人朊病毒。將血漿樣本在包^皮有抗體的培養(yǎng)板上等分，并且在37。C下進行60分鐘或更長時間的孵育。而后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。將檢測抗體T2-HRP或者5G12-生物素(225-228)以1-5嗎/ml的濃度加入到孔中，隨后在37。C孵育1小時。再次清洗培養(yǎng)板并且用鏈霉抗生物素/生物素/HRlM全測系統(tǒng)檢測總PrP。將在TBST稀釋的100pl鏈霉抗生物素(2嗎/ml，Promega)加入至孔中，并且在環(huán)境溫度下孵育1小時。而后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS洗滌該培養(yǎng)板4次。將生物素-HRP(MolecularProbes)在10%Startingblock的TBST(Sigma)中稀釋至1嗎/ml，并向每孔加入100pl。在于環(huán)境溫度下孵育l小時之后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。向孔中加入TMB(100pi,Sigma),并對信號進行30分鐘顯色。加入lNH2SO4(50pl)以使信號顯色停止，并且在板式分光光度計中于450nm測定。由于使用了HRP，可以使用許多HRP底物用于光密度、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素、電化學(xué)斗全測法。正如圖6a所示，對照ELISA系統(tǒng)產(chǎn)生來自野生型小鼠的血漿樣本以濃度依賴的方式產(chǎn)生信號，而在無朊病毒蛋白質(zhì)的PrP剔除小鼠中無信號產(chǎn)生。而且，在以下實驗中，本發(fā)明的MDS分別使用MA1-750和T2-HRP作為捕捉和;險測抗體，由于來自野生和PrP剔除小鼠的血漿樣本不包含多聚體形式Prpsc,所以沒有觀察信號(見圖6b)。對照ELISA系統(tǒng)也顯示出來自正常人血漿(見圖6c)的濃度依賴性信號。實施例VII:用于檢測重組朊病毒蛋白質(zhì)中PrPSe的MDS使用MAl-750抗體作為捕捉抗體，并使用T2-HRP作為檢測抗體用以檢測來自牛和小鼠的重組朊病毒蛋白質(zhì)中的PrPSc。分別使用308和3F4-生物素抗體作為捕捉抗體和檢測抗體用以4全測人重組朊病毒蛋白質(zhì)中的PrPSe。用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS稀釋重組朊病毒蛋白質(zhì)，并且以3倍稀釋的濃度2、0.67、0.22、0.07、0.02、0.01和0嗎/ml將其等分在涂有捕捉抗體的培養(yǎng)板上，并在37。C孵育60分鐘或者更長時間。而后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。以1-5昭/ml的濃度將^r測抗體加入到孔中，隨后在37。C孵育1小時。再次清洗該培養(yǎng)板，并使用鏈霉抗生物素/生物素/HRP檢測系統(tǒng)檢測多聚體。將在TBST中稀釋的100pl鏈霉抗生物素(2pg/ml，Promega)加入到孔中，并在環(huán)境溫度下孵育l小時。而后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。將生物素-HRP(MolecularProbes)在10%Startingblock(PIERCE)的TBST(Sigma)中稀釋至1嗎/ml,并向每個孔中加入lOO)ll。在環(huán)境溫度下孵育l小時之后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。向孔中加入TMB(100Sigma)并使信號顯色30分鐘。加入1NH2SO4(50pl)使信號顯色停止，并在板式分光光度計中于450nm測定吸光度。由于使用HRP，所以可以使用許多HRP底物用于光密度、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素、電化學(xué)檢測法。由于使用HRP，所以可以使用許多HRP底物用于檢測光密度、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素、電化學(xué)檢測法中的變化。如圖7a-7c所示，通過MDS法以濃度依賴性方式檢測到牛、小鼠和人重組朊病毒蛋白質(zhì)樣本中的多聚體，其與實施例I的蛋白印跡結(jié)果一致。實施例VIII:來自刺入牛血漿的小鼠腦的純化PrpSc的檢測向來自瘙癢病小鼠腦的純化PrPSe(朊病毒的多聚體形式)刺入100%牛血漿，并且通過接下來的上述MDS流程應(yīng)用MDS。簡要地，將1.25、0.42、0.14、0.05、0.02和0%純化PrpSc稀釋至100%牛血漿中，生成大約3.125、1.04、0.35、0.12、0.04、0.01和0嗎/m。在37°C將100pl刺入血漿在包被有MAl-750的培養(yǎng)板上孵育1小時。用TBST清洗該培養(yǎng)板4次，加入T2-HRP檢測抗體，隨后在環(huán)境溫度孵育1小時。用TBST清洗該培養(yǎng)板4次，并且加入TMB以使信號顯色30分鐘。加入終止溶液(50jil1NH2S04),并且在450nm測試該培養(yǎng)板。正如在圖8中結(jié)果顯示，通過MDS以濃度依賴性方式檢測到100%牛血漿中的來自瘙癢病小鼠腦的純化PrPSc(朊病毒的多聚體形式)。無來自瘙癢病小鼠腦的純化PrPSe的牛血漿樣本不顯示任何信號。實施例IX:牛血漿的濃縮本實驗的目的是檢測濃縮后，牛血漿中任何朊病毒多聚體。使用Amino離心濃縮器將牛血漿濃縮至200、400和500%。通過接下來的上述流程，用對照ELISA和MDS分析濃縮樣本。將一組MA1-750和T2-HRP用作MDS，并且將一組1F5和T2-HRP用于對照ELISA。正如圖9所示，對照ELISA中檢測牛血漿中的蛋白質(zhì)傳染性因子；但是，MDS中在多種血漿濃度中沒有觀察到信號，這表明在正常牛血漿中沒有朊病毒蛋白質(zhì)以單體形式存在。實施例X:血漿中Prpse的檢測使用308抗體作為捕4足抗體，并且使用3F4-生物素作為^r測抗體。將血漿樣本均分至包被有308(Cayman)的培養(yǎng)板上，并且在37。C孵育60分鐘或者更長時間。然后，用含0.05%吐溫20(Sigma)的TBS清洗該培養(yǎng)板4次。將檢測抗體3F4-生物素以1-5嗎/ml的濃度加入至孔中，隨后在37。C進行1小時孵育。再次清洗該培養(yǎng)板，使用上述鏈霉抗生物素/生物素/HRlM企測系統(tǒng)檢測多聚體。因為使用了HRP，所以可以使用許多HRP底物用于檢測光密度、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素、電化學(xué)檢測法中的變化。正如圖10a和10b所示，來自倉鼠和人的血漿不顯示任何信號，這表明沒有朊病毒多聚體存在。另一方面，可以從來自瘙癢病倉鼠和人CJD患者的血漿中觀察到信號，這表明朊病毒多聚體的存在?？梢岳斫猓诒緦嵤├?，基于使用24(il血漿(收率24%)的結(jié)果，MDS的靈敏度可降低至5p1,可成功地檢測朊病毒的多聚體形式。在圖10中，緩沖液1和緩沖液2表示用于處理經(jīng)包被的培養(yǎng)板的不同封閉緩沖液。緩沖液1和2分別表示用BlockAce(25%，Serotec)和50%StartingBlock(Pierce公司)封閉的經(jīng)包被的培養(yǎng)板。在使用不同封閉緩沖液以處理用于示差檢測PrPSc多聚體和正常PrPc時，沒有觀察到許多差別。實施例XI:使用混合捕捉抗體檢測PrPSe以150pi的兩種不同濃度3或者5昭/ml，制備包被有308的培養(yǎng)板。用150lal3iag/ml制造包被有3F4的培養(yǎng)板。用150pi,2.5昭/ml的308和1.5jag/ml的3F4,或者3嗎/ml的308和1昭/ml的3F4制造混合包被有308/3F4的培養(yǎng)板。用25%BlockAce(Serotec)封閉所有培養(yǎng)板，并且用300piPBS清洗。將人血漿樣本(488.4(il)與11.4jil，200昭/ml的人重組PrP和71.4W，8MGdn-HCl混合，并且在環(huán)境溫度下孵育該化合物15分鐘。用含有228.5(il的12%TritonX-IOO、6%脫氧膽酸鈉和1%肌氨酰的PBS稀釋該樣本，隨后加入1485[ilPBS。在70。C加熱該樣本10分鐘，并且靜置15分鐘以使其冷卻。將未經(jīng)加熱步驟的樣本于室溫下保持10分鐘。預(yù)處理的樣本包含具有2.28昭PrP、0.25MGdn、1.2%TritonX-IOO、0.6%脫氧膽酸鈉和0.1%肌氨酰的21.4%血漿。然后，將200^1的樣本用于MDS,并且在37。C孵育1小時。在用TBST(Sigma)清洗來自孔的未結(jié)合樣本4次之后，加入150pl3F4-生物素(以10%Startingblock，在TBST中，2.5嗎/ml)，并在37。C孵育1小時。用300|ilTBST(Sigma)清洗該培養(yǎng)板4次，并向每個孔中加入150(ilKPLSA-HRP(在10%Startingblock的TBST中2(ig/ml),隨后在環(huán)境溫度下孵育1小時。用300|ilTBST(Sigma)清洗該培養(yǎng)板4次，向孔中加入TMB(150(il，Sigma),并使信號顯色30分鐘。加入50(il1NH2S04以使信號顯色停止，并且在板式分光光度計中，在450nm測定信號。正如圖ll所示，結(jié)果顯示在來自包被有308的培養(yǎng)板和混合包被有308/3F4的培養(yǎng)板的信號沒有差別。實施例XII:使用血纖維蛋白溶酶原抑制劑檢測PrpSe已經(jīng)顯示血纖維蛋白溶酶原結(jié)合朊病毒蛋白質(zhì)，特別是PrPSc。與朊病毒蛋白質(zhì)(2-20ng/ml)相比，血漿包含相對高濃度的血纖維蛋白溶酶原(300嗎/ml)。朊病毒可能作為與血纖維蛋白溶酶原的復(fù)合體存在于血漿或者生物樣本中。在PMCA中加入血纖維蛋白溶酶原抑制了PrPSc的擴增，這表明血纖維蛋白溶酶原可以干擾血漿中PrPSc(多聚體)的檢測。因此，用在人血漿中刺入人重組朊病毒蛋白質(zhì)進行MDS。在150(il5嗎/ml308抗體中制備包被有308的培養(yǎng)才反。用25%BlockAce(Serotec)封閉該培養(yǎng)板，并且用300|ilPBS清洗。在血纖維蛋白溶酶原抑制劑、以o、1、10和100mM氨基已酸或者(反式-(氨曱基)環(huán)己烷羧酸和71.4iil8MGdn-HCl存在下，將人血漿樣本(488.4[il)與有或者無11.4pi,200嗎/ml的人重組PrP混合，并且在環(huán)境溫度下孵育該混合物15分鐘。用含228.512%TritonX-IOO、6%脫氧膽酸鈉和1%肌氨酰的PBS稀釋該樣本，隨后進一步加入1485(ilPBS。在70。C加熱該樣本10分鐘，并靜置15分鐘用以冷卻。將未經(jīng)加熱步驟的樣本在室溫下保持IO分鐘。預(yù)熱的樣本包含具有2.28(igPrP、0.25MGdn、1.2%TritonX-扁、0.6%脫氧膽酸鈉和0.1%肌氨酰的21.4%血漿。然后，將200)il樣本應(yīng)用于MDS，并且在37。C孵育l小時。在用TBST(Sigma)清洗來自孔的未結(jié)合樣本4次之后，加入150(il3F4-生物素(在10%Startingblock的TBST中2.5嗎/ml)并且在37°C孵育1小時。用300piTBST(Sigma)清洗該培養(yǎng)板4次，并向每個孔中加入150plKPLSA-HRP(在10%Startingblock的TBST中2嗎/ml),隨后在環(huán)境溫度下孵育1小時。用300piTBST(Sigma)清洗該培養(yǎng)板4次。向孔中加入TMB(150)il，Sigma),并且顯色信號30分鐘。加入50|il1NH2S04以使信號顯色停止，并在板式分光光度計中在450腿觀'j試信號。實施例顯示本方法使用血纖維蛋白溶酶原抑制劑、氨基己酸(ACA)或者反式-(氨曱基)環(huán)己烷羧酸酸(AMCHA)，用于增強對于刺入人血漿中的人重組朊病毒蛋白質(zhì)的多聚體形式(PrpSc)的檢測的分析結(jié)果(見表2)。表2中的值為在450nm的光密度。在樣本制備緩沖液中所有濃度的ACA和AMCHA提高了人血漿中刺入人重組朊病毒蛋白質(zhì)的檢測。通過在樣本中由血纖維蛋白溶酶原代替PrpSc，血纖維蛋白溶酶原抑制劑、ACA、AMCHA或者其它將提高生物樣本中Prpse(多聚體)的檢測。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*在450nm的光密度**來自剌入血漿與僅為血漿的樣本的信號比率實施例XIII:通過使用其它抗體組檢測來自刺入牛血漿的小鼠腦的PrPSc將來自瘙癢病小鼠腦的純化PrP&刺入100%牛血漿，并且如實施例VIII所述，通過接下來的上述MDS流程將其應(yīng)用于MDS。簡要地，將0.0083、0.0028、0.0009、0.0003和0%純化PrpSc稀釋進100%牛血漿，生成大約0.0033、0.0011、0.0004、0.0001和0昭/ml。于37。C在包被有4E10的培養(yǎng)板上孵育100(xl刺入血漿1小時。4E10抗體由國家動物健康研究所(日本)提供。在用TBST清洗該培養(yǎng)板4次之后，加入4E10-HRP檢測抗體，隨后在環(huán)境溫度下孵育1小時。用TBST清洗該培養(yǎng)板4次，并且加入化學(xué)發(fā)光底物。在化學(xué)發(fā)光儀中測試該培養(yǎng)板。正如圖12所示，結(jié)果顯示通過MDS以濃度依賴性方式檢測到來自100%牛血漿中的瘙癢病小鼠腦的純化PrPSc(朊病毒的多聚體形式)。不含來自瘙癢病小鼠腦的純化PrPSe的牛血漿樣本不顯示任何信號。另外，針對朊病毒氨基酸187-197的4E10抗體用于MDS，表明MDS不是序歹'J和區(qū)i或特異系統(tǒng)(sequenceandregionspecificsystem)。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式已被描述，應(yīng)當(dāng)理解，落入本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)的變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求和其等效物確定。權(quán)利要求1、一種用于示差^f全測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，該方法包括如下步驟(a)使生物樣本接觸識別多聚體形成的多肽上的表位的捕捉抗體以捕捉單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式；(b)使捕捉的單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式接觸檢測抗體，所述檢測抗體用于識別與步驟(a)的表位相同的或重疊的表位；以及(c)檢測多聚體形式-檢測抗體復(fù)合體的形成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的多聚體形成的多肽選自包括A(3肽、p-淀粉狀蛋白、微管相關(guān)蛋白、朊病毒、a-突觸核蛋白、Ig輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、曱狀腺素運載蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、|32-微球蛋白、亨廷頓、超氧化物歧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和糊精的組。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的多聚體形成的多肽為朊病毒。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的單體形式為Prpe以及所述的多聚體形式為PrP"。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的由捕捉抗體識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的由檢測抗體識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的捕捉抗體和所述的檢測抗體相同。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的捕捉抗體與固體基質(zhì)結(jié)合。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的檢測抗體具有產(chǎn)生可斗企測信號的標(biāo)記。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的連接檢測抗體的標(biāo)記為化學(xué)的、酶的、放射性的、熒光的、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FRET標(biāo)記。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的生物樣本為腦勻漿或者血漿。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)使用腦勻漿作為生物樣本時，所述的方法進一步包括在步驟(a)之前用胰蛋白酶處理生物樣本。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括在步驟(a)之前用蛋白質(zhì)變性劑處理生物樣本。14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括在步驟(a)之前加熱生物樣本。15、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)使用血漿作為生物樣本時，所述的生物樣本包括肌氨酰除垢劑。16、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)使用血漿作為生物樣本時，所述方法包括不用蛋白酶水解處理步驟。17、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)使用血漿作為生物樣本時，所述方法進一步包括在步驟(a)之前用對血纖維蛋白溶酶原的抑制劑處理生物樣本。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的對血纖維蛋白溶酶原的抑制劑選自包括co-氨基羧酸、L-賴氨酸及其衍生物、兩性離子、千胺、苯曱脒、L-精氨酸及其衍生物的組。19、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述的捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:1的氨基酸109-112、106-126、132-147或者135-140的氨基酸序列的表位。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中當(dāng)通過牛朊病毒序列描述時，所述生物樣本為牛腦勻漿，并且所述捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:2的氨基酸145-150或者142-157的氨基酸序列的表位。21、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述生物樣本為人血漿，并且所述的捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:1的氨基酸109-112或者106-126的氨基酸序列的表位。22、一種試劑盒，該試劑盒是用于執(zhí)行如權(quán)利要求1-21任意一項所述的用于示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，其包括(a)捕捉抗體，其用于識別多聚體形成的多肽上的表位；以及(b)檢測抗體，其用于識別與由捕捉抗體識別的表位相同的或者重疊的表位。23、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述多聚體形成的多肽選自包括A(3肽、p-淀粉狀蛋白、微管相關(guān)蛋白、朊病毒、a-突觸核蛋白、Ig輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、曱狀腺素運載蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、(32-微球蛋白、亨廷頓、超氧化物歧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和糊精的組。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述多聚體形成的多肽為朊病毒。25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述的單體形式為PrPe以及所述的多聚體形式為PrPsc。26、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的由捕捉抗體識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。27、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的由檢測抗體識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。28、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的捕捉抗體和所述的檢測抗體相同。29、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的捕捉抗體與固體基質(zhì)結(jié)合。30、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的檢測抗體具有產(chǎn)生可^f全測的信號的標(biāo)記。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述的連接檢測抗體的標(biāo)記為化學(xué)的、酶的、放射性的、熒光的、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FRET才示"i己。32、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述的生物樣本為腦勻漿或者血漿。33、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括胰蛋白酶、蛋白質(zhì)變性劑、除垢劑或者它們的混合物。34、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述的捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:1的氨基酸109-112、106-126、132-147或者135-140的氨基酸序列的表位。35、根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中當(dāng)通過牛朊病毒序列描述時，所述生物樣本為牛腦勻漿，并且所述捕捉和/或者^r測抗體識別具有跨越SEQIDNO:2的氨基酸145-150或者142-157的氨基酸序列的表位。36、根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述生物樣本為人血漿，并且所述的捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:1的氨基酸109-112或者106-126的氨基酸序列的表位。37、一種用于示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，該方法包括如下步驟(a)使生物樣本接觸識別多聚體形成的多肽上的表位的捕捉抗體以捕捉所述的單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式，其中捕捉抗體與固體載體結(jié)合；以及(b)測定在結(jié)合了固體載體的捕捉抗體和多聚體形成的多肽之間發(fā)生的凝集，其中凝集的發(fā)生表明生物樣本中存在多聚體形式。38、根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述多聚體形成的多肽選自包括A(3肽、p-淀粉狀蛋白、微管相關(guān)蛋白、朊病毒、a-突觸核蛋白、Ig輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、曱狀腺運載蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、|32-微球蛋白、亨廷頓、超過氧化物歧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和糊精的組。39、根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述多聚體形成的多肽為朊病毒。40、根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的單體形式為Prpe以及所述的多聚體形式為PrPse。41、根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的由捕捉抗體識別的表位在多聚體形成的多肽中不重復(fù)。42、根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述的捕捉抗體識別具有跨越SEQIDNO:l的氨基酸109-112、106-126、132-147或者135-140的氨基酸序列的表位。43、根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中當(dāng)通過牛朊病毒序列描述時，所述生物樣本為牛腦勻漿，并且所述的捕捉和/或者檢測抗體識別具有跨越SEQIDNO:2的氨基酸145-150或者142-157的氨基酸序列的表位。44、根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中當(dāng)通過人朊病毒序列描述時，所述生物樣本為人血漿，并且所述的捕捉抗體識別具有跨越SEQIDNO:1的氨基酸109-112或者106-126的氨基酸序列的表位。45、根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述固體載體為微球。全文摘要本發(fā)明涉及用于示差檢測生物樣本中多聚體形成的多肽的單體形式中多聚體形式的方法，該方法包括如下步驟(a)使生物樣本接觸識別多聚體形成的多肽上的表位的捕捉抗體以捕捉單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式；(b)使捕捉的單體形式、多聚體形式或者單體和多聚體形式接觸檢測抗體，所述檢測抗體用于識別與步驟(a)的表位相同的或重疊的表位；以及(c)檢測多聚體形式-檢測抗體復(fù)合體的形成。文檔編號C12Q1/68GK101124342SQ200580048489公開日2008年2月13日申請日期2005年11月25日優(yōu)先權(quán)日2005年2月19日發(fā)明者吳炫正,安性洙,林君澤申請人:人民生物公司