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      固相肽合成方法及相關(guān)系統(tǒng)的制作方法

      文檔序號(hào):8946980閱讀:537來源:國知局
      固相肽合成方法及相關(guān)系統(tǒng)的制作方法
      【專利說明】固相化合成方法及相關(guān)系統(tǒng)
      [oow] 相關(guān)申請(qǐng)
      [0002] 本申請(qǐng)是2013年3月15日提交的名稱為"SolidPhaseP巧tideSynthesis ProcessesandAssociatedSystems"的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)13/833,745(其通過引用W 其整體并入本文用于所有目的)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0003] 一般性描述了用于進(jìn)行固相膚合成的系統(tǒng)和方法。
      【背景技術(shù)】
      [0004] 固相膚合成是用于在固體支持物上化學(xué)合成膚的方法。在固相膚合成中,氨基酸 或膚通常通過C-末端與固體支持物結(jié)合。通過偶聯(lián)反應(yīng)將新的氨基酸添加至結(jié)合的氨基 酸或膚。由于非期望反應(yīng)的可能性,通常使用保護(hù)基團(tuán)。迄今為止,固相膚合成已經(jīng)成為化 學(xué)膚合成的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。已經(jīng)通過自動(dòng)化固相膚合成儀的商業(yè)成功證明了固相膚合成的廣泛 效用。雖然固相膚合成已被使用了 30多年,但是還沒有開發(fā)出快速合成技術(shù)。因此,需要 改進(jìn)的方法和系統(tǒng)。

      【發(fā)明內(nèi)容】
      陽0化]一般性描述了固相膚合成方法及相關(guān)系統(tǒng)。某些實(shí)施方案設(shè)及可用于快速地進(jìn)行 固相膚合成而同時(shí)保持高產(chǎn)率的系統(tǒng)和方法。在一些實(shí)施方案中,可WW減少進(jìn)行固相膚 合成所需的時(shí)間量的方式來加熱、運(yùn)輸和/或混合試劑。在一些情況下,本發(fā)明的主題設(shè)及 相關(guān)的產(chǎn)品、特定問題的替代解決方案和/或一個(gè)或更多個(gè)系統(tǒng)和/或制品的多種不同的 用途。
      [0006] 在一些實(shí)施方案中,提供了用于向膚添加氨基酸殘基的方法。在某些實(shí)施方案中, 所述方法包括加熱包含氨基酸的流W使得所述氨基酸的溫度提高至少約TC;W及使經(jīng)加 熱的氨基酸暴露于固定在固體支持物上的多個(gè)膚,其中在使經(jīng)加熱的氨基酸暴露于所述膚 之前且在約30秒內(nèi)進(jìn)行所述加熱步驟。
      [0007] 在某些實(shí)施方案中,所述方法包括提供多個(gè)包含保護(hù)基團(tuán)的膚,每個(gè)膚均固定在 固體支持物上;進(jìn)行第一氨基酸添加循環(huán),其包括使氨基酸暴露于固定膚W使得向至少約 99%的所述固定膚添加氨基酸殘基;W及進(jìn)行第二氨基酸添加循環(huán),其包括使氨基酸暴露 于固定膚W使得向至少約99%的所述固定膚添加氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中,第一氨 基酸添加循環(huán)結(jié)束與第二氨基酸添加循環(huán)結(jié)束之間的總時(shí)間量為約10分鐘或更短,并且 保護(hù)基團(tuán)包括巧基甲氧幾基(fluoren^meth^oxycarbonyl)保護(hù)基團(tuán)和/或第一氨基酸 添加循環(huán)結(jié)束與第二氨基酸添加循環(huán)結(jié)束之間的總時(shí)間量為約5分鐘或更短。
      [0008] 在某些實(shí)施方案中,所述方法包括提供固定在固體支持物上的多個(gè)膚;W及使活 化氨基酸暴露于固定膚W使得至少一部分所述活化氨基酸與所述固定膚結(jié)合W形成新結(jié) 合的氨基酸殘基;其中至少約99%的所述固定膚在約1分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)添加了氨基酸 殘基。
      [0009] 在某些實(shí)施方案中,所述方法包括使包含氨基酸的第一流流動(dòng);使包含氨基酸活 化劑的第二流流動(dòng);合并所述第一流和第二流W形成包含活化氨基酸的混合流體;并且在 合并所述第一流和第二流W形成混合流體之后的約30秒內(nèi)將所述混合流體暴露于固定在 固體支持物上的多個(gè)膚。
      [0010] 在某些實(shí)施方案中,所述方法包括提供多個(gè)包含保護(hù)基團(tuán)的膚,每個(gè)膚均固定在 固體支持物上;使去保護(hù)試劑暴露于固定膚W從至少一部分的所述固定膚中除去保護(hù)基 團(tuán);除去至少一部分的所述去保護(hù)試劑;使活化氨基酸暴露于所述固定膚W使得至少一部 分的所述活化氨基酸與所述固定膚結(jié)合W形成新結(jié)合的氨基酸殘基;W及除去至少一部分 不與所述固定膚結(jié)合的活化氨基酸;在一些實(shí)施方案中,在氨基酸暴露步驟期間,至少約 99 %的固定膚添加了氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中,進(jìn)行所有的去保護(hù)試劑暴露步驟、去 保護(hù)試劑除去步驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量 為約10分鐘或更短,并且所述保護(hù)基團(tuán)包括巧基甲氧幾基保護(hù)基團(tuán)和/或進(jìn)行所有的去保 護(hù)試劑暴露步驟、去保護(hù)試劑除去步驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟的組 合所花費(fèi)的總時(shí)間量為約5分鐘或更短。
      [0011] 當(dāng)結(jié)合附圖考慮對(duì)本發(fā)明的多種非限制性實(shí)施方案的W下詳細(xì)描述時(shí),本發(fā)明的 其他優(yōu)點(diǎn)和新的特征將變得明顯。在本說明書和通過引用并入的文獻(xiàn)包含沖突和/或不一 致的公開內(nèi)容的情況下,應(yīng)W本說明書為準(zhǔn)。
      【附圖說明】
      [0012] 將通過參考附圖舉例的方式來描述本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案,其是示意性的且 并不意在按比例繪制。在圖中,所示的每一個(gè)相同的或幾乎相同的組件通常由單個(gè)數(shù)字表 示。為了清楚的目的,在不必進(jìn)行說明就可使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解本發(fā)明的情況下,并 非在每幅圖中的每個(gè)組件都被加W標(biāo)記,也不必示出本發(fā)明每個(gè)實(shí)施方案中的每個(gè)組件。 在附圖中:
      [0013] 圖1是根據(jù)一組實(shí)施方案之用于進(jìn)行膚合成的一個(gè)系統(tǒng)的示意圖;
      [0014] 圖2A-2D是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)膚合成系統(tǒng)的一個(gè)示例性示意圖,度)一個(gè) 示例性膚合成系統(tǒng)的照片,(C)合成的膚Fmoc-ALFALFA-CONHz的色譜圖W及值)反應(yīng)器的 一個(gè)示例性示意圖;
      [001引圖3A-3C是根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)用不同的活化氨基酸暴露時(shí)間合成的LYRAG-CONHz膚的色譜圖,度)用不同的活化氨基酸暴露時(shí)間合成的Fmoc-ALF-CONH2膚的色 譜圖,和(C) 一個(gè)示例性的合成時(shí)間線;
      [0016] 圖4A-4D是根據(jù)某些實(shí)施方案的通過W下條件合成的ACP(65-74)膚的色譜圖和 質(zhì)譜:(A)在60°C下使用HATU合成和度)在60°C下使用皿TU合成,(C)在室溫下使用皿TU 合成,W及做使用相同的合成時(shí)間線在分批條件下使用皿TU合成;
      [0017] 圖5A-5B是根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)合成的化IA(AlOL)膚的色譜圖和質(zhì)譜W及 度)合成的HIV-IPR(81-99)膚的色譜圖和質(zhì)譜; 陽0化]圖6A-6E是根據(jù)某些實(shí)施方案的在如表1所示的多種條件(A) 5、做7、似8和 值)4下合成的GCF膚的總離子流色譜,W及膽)是可靠(authentic)的Gly-D-切S-L-Phe 樣品的一個(gè)示例性總離子流色譜;
      [0019] 圖7A-7E是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)來自S個(gè)膚片段的親和體(affibody)蛋白 之化學(xué)連接的一個(gè)示例性方案,度)第一親和體片段的色譜圖和質(zhì)譜,(C)第二親和體片段 的色譜圖和質(zhì)譜,值)第=親和體膚片段的色譜圖和質(zhì)譜,W及巧)純化的親和體的色譜圖 和質(zhì)譜;
      [0020] 圖8A-8F是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A-B)分別使用FmocN-末端保護(hù)基團(tuán)的N-末 端親和體片段和使用BocN-末端保護(hù)基團(tuán)的常規(guī)手動(dòng)排布的總離子色譜圖,(C-D)分別使 用FmocN-末端保護(hù)基團(tuán)的中間親和體片段和使用BocN-末端保護(hù)基團(tuán)的常規(guī)手動(dòng)排布 的總離子色譜圖,W及巧-巧分別使用FmocN-末端保護(hù)基團(tuán)的C-末端親和體片段和使用 BocN-末端保護(hù)基團(tuán)的常規(guī)手動(dòng)排布的總離子色譜圖;
      [0021] 圖9A-犯是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)純化的第一親和體片段的總離子色譜圖,度) 純化的第二親和體片段的總離子色譜圖,(C)純化的第=親和體片段的總離子色譜圖,值) 來自第一片段和第二片段之連接的純化的親和體片段的總離子色譜圖,W及巧)純化的親 和體的色譜圖和質(zhì)譜;
      [0022] 圖10是根據(jù)一組實(shí)施方案的在膚的合成期間記錄為時(shí)間之函數(shù)的紫外吸光度 圖;
      [0023] 圖11是根據(jù)一組實(shí)施方案的流量相對(duì)于洗涂時(shí)間的圖;
      [0024] 圖12A-G是根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)入口(左)和出口(右)的照化做墊片 (spacer)的照片,(C)反應(yīng)器主體單元的照片,值)組裝式反應(yīng)器的照片,W及巧)示出了 反應(yīng)器主體、玻璃料和墊片之反應(yīng)器的示意圖,(巧反應(yīng)器的剖面圖,W及(G)用反應(yīng)器所 使用的合成時(shí)間線;
      [00巧]圖13是根據(jù)一組實(shí)施方案的用于進(jìn)行膚合成之一個(gè)示例性系統(tǒng)的示意圖;
      [0026] 圖14是根據(jù)某些實(shí)施方案的合成的膚ALFALFA-C0NHNH2的一個(gè)示例性總離子色 譜圖;
      [0027] 圖15示出了使用本文描述的某些膚合成系統(tǒng)所制成的膚的兩個(gè)示例性色譜圖;
      [0028] 圖16A-H是根據(jù)一組實(shí)施方案的用第二代方案在W下條件下合成的ACP化5-74) 的粗LCMS色譜圖:(A)在60°C下使用HATU,度)在60°C下使用皿TU,(C)在室溫下使用 皿TU和值)在室溫下使用可比較的手動(dòng)分批方法,W及用第一代方案在W下條件下合成的 ACP巧)(65-74)的粗LCMS色譜圖:似在60°C下使用HATU,(巧在60°C下使用皿TU,(G)在 室溫下使用皿TU和(H)在室溫下使用可比較的手動(dòng)分批方法;
      [0029] 圖17包括根據(jù)一些實(shí)施方案合成的生物素化膚的色譜圖;
      [0030] 圖18A-D是根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)用第二代方案合成的化IA(AlOL)芋螺毒 素(conotoxin),度)用第二代方案合成的HIV-IPR(81-99),(C)用第一代方案合成的 化IA(AlOL)芋螺毒素和值)用第一代方案合成的HIV-IPR(81-99)的色譜圖;
      [00川圖19A-F是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A-C)用第二代方案在氯S苯甲基 (Chlorotrytyl)酷阱官能化的聚苯乙締上合成的親和體片段和值-巧用第一代方案在修 飾的Wang樹脂上合成的親和體片段的色譜圖;
      [0032] 圖20包括根據(jù)一組實(shí)施方案合成的谷脫甘膚類似物之文庫的色譜圖;
      [0033] 圖21A-C是根據(jù)某些實(shí)施方案合成的富含半脫氨酸的膚的色譜圖;
      [0034] 圖22A-B是根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)使用自動(dòng)化方法合成的(ALF)7和做使用 手動(dòng)的方法合成的(ALF)7的色譜圖。
      [0035] 圖23A-D是根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)自動(dòng)化流動(dòng)平臺(tái)的示意圖,度)通過自動(dòng)化 流動(dòng)平臺(tái)來滲入氨基酸殘基而使用的合成時(shí)間線,(C)示出ALFALFA的色譜圖,值)示出 ACP化5-74)的色譜圖和似示出(AL巧7的色譜圖;
      [0036] 圖24A-B示出了(A)使用包括除去步驟的添加循環(huán)合成的膚的色譜圖和做使用 缺少一個(gè)或更多個(gè)除去步驟的添加循環(huán)合成的膚的色譜圖;
      [0037] 圖25A-F示出了根據(jù)一組實(shí)施方案的(A)DARPin合成的一個(gè)合成方案,度-E)片 段DARPin的色譜圖和(巧DARPin的色譜圖; 陽03引圖26A-F示出了根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)芽抱桿菌RNA酶度arnase)合成的一個(gè) 合成方案,度-巧片段芽抱桿菌RNA酶的色譜圖和(巧芽抱桿菌RNA酶的色譜圖;W及
      [0039] 圖27A-C示出了根據(jù)某些實(shí)施方案的(A)人膜島素A鏈的色譜圖,做人膜島素B 鏈的色譜圖和(C)進(jìn)化的邸TI-II整聯(lián)蛋白結(jié)合膚的色譜圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0040] 一般性地描述了用于進(jìn)行固相膚合成的系統(tǒng)和方法。固相膚合成是其中向已被固 定在固體支持物上的膚添加氨基酸殘基的已知方法。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的系統(tǒng)和 方法可用于快速地進(jìn)行固相膚合成而同時(shí)保持高產(chǎn)率。某些實(shí)施方案設(shè)及可用于W減少進(jìn) 行固相膚合成所需的時(shí)間量的方式來加熱、運(yùn)輸和/或混合試劑的方法和系統(tǒng)。
      [0041] 某些實(shí)施方案設(shè)及向固定膚添加氨基酸的方法。圖1是可用于進(jìn)行本文所描述的 某些發(fā)明過程的示例性系統(tǒng)5的示意圖。在某些實(shí)施方案中,本文所描述的系統(tǒng)和方法(例 如,在圖1中的系統(tǒng)5)可設(shè)及基于流動(dòng)的合成(與此相反的是用于許多傳統(tǒng)的固相膚合成 系統(tǒng)的基于分批的合成)。在一些運(yùn)樣的實(shí)施方案中,可進(jìn)行持續(xù)的膚合成,其中將(一種 形式或另一種形式的)流體基本上持續(xù)地運(yùn)輸經(jīng)過固定膚。例如,在某些實(shí)施方案中,可將 試劑和漂洗流體交替且持續(xù)地運(yùn)輸通過固定膚。
      [0042] 在一些實(shí)施方案中,膚20可被固定在固體支持物15上。固體支持物15固定可 包含在容器(例如反應(yīng)器10)內(nèi)。在一些實(shí)施方案中,如圖1中所示,多個(gè)試劑儲(chǔ)存器 (reservoir)可位于反應(yīng)器10的上游并與其流體地連接。在一些實(shí)施方案中,試劑儲(chǔ)存器 25容納氨基酸(例如,預(yù)活化的氨基酸和/或未完全活化的氨基酸)。在一些情況下,試劑 儲(chǔ)存器26容納能夠完成氨基酸活化的氨基酸活化劑(例如,堿性液體、碳二亞胺和/或脈 鐵(uronium)活化劑)。在某些實(shí)施方案中,試劑儲(chǔ)存器27容納去保護(hù)試劑,例如贓晚或= 氣乙酸。試劑儲(chǔ)存器28可容納可用于例如試劑除去步驟的溶劑,例如二甲基甲酯胺值MF)。 雖然為了簡(jiǎn)單起見在圖1中示出了單一儲(chǔ)存器,但是應(yīng)當(dāng)理解在示出單一儲(chǔ)存器的圖1中, 可使用多重儲(chǔ)存器(例如,每個(gè)包含不同種類的氨基酸、不同種類的去保護(hù)試劑等)來代替 單一儲(chǔ)存器。
      [0043] 在某些實(shí)施方案中,膚20包含保護(hù)基團(tuán),例如,在膚的N-末端。如本文所使用的 術(shù)語"保護(hù)基團(tuán)"具有其在本領(lǐng)域中的普通含義。保護(hù)基團(tuán)包括連接至或被配置成連接至 分子(例如,膚)內(nèi)的反應(yīng)性基團(tuán)(即,受保護(hù)的基團(tuán))W使得所述保護(hù)基團(tuán)阻止或W其他 方式抑制受保護(hù)的基團(tuán)參與反應(yīng)的化學(xué)部分。可通過將保護(hù)基團(tuán)連接至分子來進(jìn)行保護(hù)。 當(dāng)將保護(hù)基團(tuán)從分子中除去時(shí),例如,通過除去保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)轉(zhuǎn)化,可發(fā)生去保護(hù)。
      [0044] 在一些實(shí)施方案中,多個(gè)包含保護(hù)基團(tuán)的膚可W與固體支持物結(jié)合W使得每個(gè)膚 固定于固體支持物上。例如,所述膚可通過其C-末端與固相支持物結(jié)合,從而固定所述膚。
      [0045] 在一些實(shí)施方案中,向固定膚添加氨基酸殘基的方法包括使去保護(hù)試劑暴露于所 述固定膚W從至少一部分固定膚中除去至少一部分保護(hù)基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中,可配置 去保護(hù)試劑暴露步驟W使得保留側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán),而N-末端保護(hù)基團(tuán)被除去。例如,在某些 實(shí)施方案中,使用來保護(hù)膚的保護(hù)基團(tuán)包括巧基甲氧幾基(Fmoc)。在一些運(yùn)樣的實(shí)施方 案中,包含贓晚(例如贓晚溶液)的去保護(hù)試劑可暴露于固定膚W使得從至少一部分的固 定膚中除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中,用來保護(hù)膚的保護(hù)基團(tuán)包括叔下氧幾基 度OC)。在一些運(yùn)樣的實(shí)施方案中,包含=氣乙酸的去保護(hù)試劑可暴露于固定膚W使得從至 少一部分的固定膚中除去Boc保護(hù)基團(tuán)。在一些情況下,保護(hù)基團(tuán)(例如,叔下氧幾基,即 Boc)可與膚的N-末端結(jié)合。
      [0046] 在一些實(shí)施方案中,向固定膚添加氨基酸殘基的方法包括除去至少一部分的去保 護(hù)試劑。在一些實(shí)施方案中,可W除去至少一部分可在去保護(hù)步驟期間形成的任何反應(yīng)副 產(chǎn)物(例如,除去的保護(hù)基團(tuán))。在一些情況下,可通過用例如儲(chǔ)存在任選的儲(chǔ)存器28中的 流體(例如,液體如含水溶劑或無水溶劑、超臨界流體等)洗涂膚、固體支持物和/或周圍 區(qū)域來除去去保護(hù)試劑(W及在某些實(shí)施方案中的副產(chǎn)物)。在一些情況下,除去去保護(hù) 試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物可能會(huì)改善隨后步驟的性能(例如,通過防止副反應(yīng))。在某些實(shí)施方 案中,隨后步驟的性能并不依賴于至少一部分(例如,基本上全部)去保護(hù)試劑和/或反應(yīng) 副產(chǎn)物的除去。在一些運(yùn)樣的情況下,除去步驟是任選的。在其中除去步驟為任選的實(shí)施 方案中,可W減少除去步驟(例如,減少除去步驟的時(shí)間、減少在除去步驟中使用的溶劑的 量)和/或消除除去步驟。減少或消除一個(gè)或更多個(gè)除去步驟可減少總的循環(huán)時(shí)間。應(yīng)當(dāng) 理解的是,如果減少或消除了任選的除去步驟,則添加循環(huán)中的隨后步驟可用來除去至少 一部分的去保護(hù)試劑和/或反應(yīng)副產(chǎn)物,例如,由于系統(tǒng)中的流體流動(dòng)。
      [0047] 在某些實(shí)施方案中,向固定膚添加氨基酸殘基的方法包括使活化氨基酸暴露于所 述固定膚W使得至少一部分的所述活化氨基酸與所述固定膚結(jié)合W形成新結(jié)合的氨基酸 殘基。例如,所述膚可暴露于與膚的去保護(hù)N末端反應(yīng)的活化氨基酸。在某些實(shí)施方案中, 如在下面更詳細(xì)地討論的,可通過混合含氨基酸的流與活化劑流來活化氨基酸W用于與去 保護(hù)的膚進(jìn)行反應(yīng)。在一些情況下,可保護(hù)活化氨基酸的胺基W使得添加氨基酸導(dǎo)致具有 受保護(hù)N-末端的固定膚。
      [0048] 在一些實(shí)施方案中,向固定膚添加氨基酸殘基的方法包括除去至少一部分未與固 定膚結(jié)合的活化氨基酸。在一些實(shí)施方案中,可除去可在活化氨基酸暴露步驟期間形成的 至少一部分的反應(yīng)副產(chǎn)物。在一些情況下,可通過用例如儲(chǔ)存在任選的儲(chǔ)存器28中的流體 (例如,液體如含水溶劑或無水溶劑、超臨界流體等)洗涂膚、固體支持物和/或周圍區(qū)域 來除去活化氨基酸和副產(chǎn)物。在一些情況下,除去至少一部分的活化氨基酸和反應(yīng)副產(chǎn)物 可提高隨后步驟的性能(例如,通過防止副反應(yīng))。在某些實(shí)施方案中,隨后步驟的性能并 不依賴于至少一部分(例如,基本上全部)活化氨基酸和/或反應(yīng)副產(chǎn)物的除去。在一些 運(yùn)樣的情況下,除去步驟是任選的。在其中除去步驟為任選的實(shí)施方案中,可減少除去步驟 (例如,減少除去步驟的時(shí)間、減少除去步驟中所使用的溶劑的量)和/或消除除去步驟。 減少或消除一個(gè)或更多個(gè)除去步驟可減少總的循環(huán)時(shí)間。應(yīng)當(dāng)理解的是,如果減少或消除 了可選的除去步驟,則添加循環(huán)中的隨后步驟可用來除去至少一部分的活化氨基酸和/或 反應(yīng)副產(chǎn)物,例如,由于系統(tǒng)中的流體流動(dòng)。
      [0049] 應(yīng)當(dāng)理解的是,W上提及的步驟是示例性的且氨基酸添加循環(huán)不必包括所有W上 提及的步驟。例如,氨基酸添加循環(huán)可W不包括去保護(hù)試劑除去步驟和/或活化氨基酸除 去步驟。通常,氨基酸添加循環(huán)包括導(dǎo)致氨基酸殘基添加至膚的任何系列的步驟。
      [0050] 在某些實(shí)施方案中,在氨基酸添加步驟期間,添加氨基酸可導(dǎo)致膚滲入單個(gè)額外 的氨基酸殘基(即,可向固定膚添加單個(gè)氨基酸殘基,W使得在添加步驟后給定的膚包含 單個(gè)額外的氨基酸殘基)。在一些運(yùn)樣的實(shí)施方案中,隨后的氨基酸添加步驟可用于通過單 獨(dú)地添加氨基酸殘基直至合成所需的膚來建立膚。在一些實(shí)施方案中,可向固定在固體支 持物上的膚添加一個(gè)W上的氨基酸殘基(例如,W膚的形式)(即,可向給定的固定膚添加 包含多個(gè)氨基酸殘基的膚)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法(例如,片段縮合、化學(xué) 連接)可實(shí)現(xiàn)向固定膚添加膚。也就是說,在氨基酸添加步驟期間,向固定膚添加氨基酸可 包括向固定膚添加單個(gè)氨基酸殘基或者向固定膚添加多個(gè)氨基酸殘基(例如,作為膚)。
      [0051] 在一些實(shí)施方案中,可W比常規(guī)方法顯著更快地向膚添加氨基酸。在某些實(shí)施方 案中,進(jìn)行步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量受保護(hù)基團(tuán)的影響。例如,在其中保護(hù)基團(tuán)包括巧 基甲氧幾基(Fmoc)的某些實(shí)施方案中,進(jìn)行所有的去保護(hù)試劑暴露步驟、去保護(hù)試劑除去 步驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量為約10分鐘 或更短、約9分鐘或更短、約8分鐘或更短、約7分鐘或更短、約6分鐘或更短、約5分鐘或 更短、約4分鐘或更短、約3分鐘或更短、約2分鐘或更短、約1分鐘或更短、約10秒至約10 分鐘、約10秒至約9分鐘、約10秒至約8分鐘、約10秒至約7分鐘、約10秒至約6分鐘、 約10秒至約5分鐘、約10秒至約4分鐘、約10秒至約3分鐘、約10秒至約2分鐘或約10 秒至約1分鐘。在某些實(shí)施方案(包括其中保護(hù)基團(tuán)包括叔下氧幾基度OC)、巧基甲氧幾基 (Fmoc)和/或其他類型的保護(hù)基團(tuán)的實(shí)施方案)中,進(jìn)行所有的去保護(hù)試劑暴露步驟、去保 護(hù)試劑除去步驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量為 約5分鐘或更短、約4分鐘或更短、約3分鐘或更短、約2分鐘或更短、約1分鐘或更短、約 10秒至約5分鐘、約10秒至約4分鐘、約10秒至約3分鐘、約10秒至約2分鐘或約10秒 至約1分鐘。
      [0052] 一般而言,通過將進(jìn)行去保護(hù)試劑暴露步驟所花費(fèi)的時(shí)間量加上進(jìn)行去保護(hù)試 劑除去步驟所花費(fèi)的時(shí)間量和進(jìn)行活化氨基酸暴露步驟所花費(fèi)的時(shí)間量W及進(jìn)行活化氨 基酸除去步驟所花費(fèi)的時(shí)間量來計(jì)算進(jìn)行所有的去保護(hù)試劑暴露步驟、去保護(hù)試劑除去步 驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量。
      [0053] 在其中如本文所描述的添加循環(huán)缺少一個(gè)或更多個(gè)除去步驟并且保護(hù)基團(tuán)包括 巧基甲氧幾基(Fmoc)的實(shí)施方案中,進(jìn)行所有的添加循環(huán)步驟(例如,去保護(hù)試劑暴露步 驟、活化氨基酸暴露步驟和活化氨基酸除去步驟;去保護(hù)試劑暴露步驟、去保護(hù)試劑除去步 驟和活化氨基酸暴露步驟;去保護(hù)試劑暴露步驟和活化氨基酸暴露步驟)的組合所花費(fèi)的 總時(shí)間量為約10分鐘或更短、約9分鐘或更短、約8分鐘或更短、約7分鐘或更短、約6分 鐘或更短、約5分鐘或更短、約4分鐘或更短、約3分鐘或更短、約2分鐘或更短、約1分鐘 或更短、約0. 75分鐘或更短、約10秒至約10分鐘、約10秒至約9分鐘、約10秒至約8分 鐘、約10秒至約7分鐘、約10秒至約6分鐘、約10秒至約5分鐘、約10秒至約4分鐘、約 10秒至約3分鐘、約10秒至約2分鐘或者約10秒至約1分鐘。在某些實(shí)施方案(包括其 中保護(hù)基團(tuán)包括叔下氧幾基度OC)、巧基甲氧幾基(Fmoc)和/或其他類型的保護(hù)基團(tuán)的實(shí) 施方案)中,進(jìn)行缺少一個(gè)或更多個(gè)除去步驟的添加循環(huán)中所有步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí) 間量為約5分鐘或更短、約4分鐘或更短、約3分鐘或更短、約2分鐘或更短、約1分鐘或更 短、約10秒至約5分鐘、約10秒至約4分鐘、約10秒至約3分鐘、約10秒至約2分鐘或約 10秒至約1分鐘。
      [0054] 一般而言,通過將進(jìn)行去保護(hù)試劑暴露步驟所花費(fèi)的時(shí)間量加上進(jìn)行去保護(hù)試劑 除去步驟(如果存在的話)所花費(fèi)的時(shí)間量和進(jìn)行活化氨基酸暴露步驟所花費(fèi)的時(shí)間量W 及進(jìn)行活化氨基酸除去步驟(如果存在的話)所花費(fèi)的時(shí)間量來計(jì)算進(jìn)行缺少一個(gè)或更多 個(gè)除去步驟的添加循環(huán)中所有步驟的組合所花費(fèi)的總時(shí)間量。
      [0055] 在某些實(shí)施方案中,第一氨基酸添加步驟(和/或隨后的氨基酸添加步驟)可W W相對(duì)高的產(chǎn)率添加氨基酸。例如,某些實(shí)施方案包括將氨基酸暴露于固定膚W使得向至 少約99%、至少約99. 9%、至少約99. 99%或基本上100%的固定膚添加氨基酸殘基。在某 些實(shí)施方案中,可進(jìn)行第二(W及在一些實(shí)施方案中,第=、第四、第五和/或隨后的)氨基 酸添加循環(huán),其可包括使氨基酸暴露于固定膚W使得向至少約99%、至少約99. 9%、至少 約99. 99 %或基本
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