專利名稱：一種肽的固相合成方法及其合成的肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種含不對稱二硫鍵的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。
背景技術：
二硫鍵(disulfide)在蛋白質(zhì)及多肽分子中對保持其生物活性和構象穩(wěn)定有著舉足輕重的作用。含有二硫鍵的小分子肽通過溶液法或固相合成法合成時，通常是將脫保護的線性肽鏈中的兩個半胱氨酸(Cys)殘基的巰基氧化成二硫鍵。兩個半胱氨酸形成一個二硫鍵的方法有很多，例如，中國專利申請CN102336808A報道了一種奧曲肽二硫鍵氧化環(huán)合的方法，其采用醋酸銨緩沖液作為氧化工作液，在pH 7. 5-8. 5下，將合成的奧曲肽前體直八肽氧化成環(huán)八肽，所述方法氧化條件溫和，副反應少，產(chǎn)物純度高，最后產(chǎn)品收率高，適用于規(guī)?；a(chǎn)。當多肽分子含多對Cys殘基時，二硫鍵的形成受許多因素影響，可能導致 形成多種異構體，產(chǎn)物的產(chǎn)率降低，且給分離純化帶來許多麻煩。現(xiàn)有技術中沒有不對稱二硫鍵的合成方法，而實際多肽藥物中有許多含有不對稱二硫鍵的藥物。因此，需要一種含不對稱二硫鍵的肽的合成方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種含不對稱二硫鍵的肽的合成方法，其包括以下步驟(I)合成與固相載體2-三苯甲基氯樹脂相連接的肽，所述肽包含三個或三個以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的殘基，其中兩個所述半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈各自被S-烷基-硫基保護基團保護，其中所述烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進一步取代，其中兩個保護基為相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保護基團保護，(2)使所述肽與S-烷基-硫基保護基團去除劑反應，(3)使所述肽在氧氣存在下且在無非均相催化劑存在下形成不對稱二硫鍵，(4)裂解肽樹脂得到含不對稱二硫鍵的肽。此外，本發(fā)明還提供一種合成的含不對稱二硫鍵的肽，其具有以下通式
權利要求
1.一種含不對稱二硫鍵的肽的合成方法，其包括以下步驟 (1)合成與固相載體2-CTC樹脂相連接的肽，所述肽包含三個或三個以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的殘基，其中兩個所述半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈各自被S-烷基-硫基保護基團保護，其中所述烷基為未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其鹵代變體或鹵素進一步取代，其中兩個保護基為相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的側(cè)鏈被三苯甲基_、叔丁基_、乙酰氨基甲基_、烷基化的乙酰氨基甲基_、烷基化的三苯甲基-保護基團保護， (2)使所述肽與S-烷基-硫基保護基團去除劑反應， (3)使所述肽在氧氣存在下且在無非均相催化劑存在下形成不對稱二硫鍵， (4)裂解肽樹脂得到含不對稱二硫鍵的肽。
2.權利要求I的合成方法，其中所述方法包括在步驟(4)后采用HPLC方法純化所述肽，最終得到精肽；優(yōu)選所述純化方法為將所述肽經(jīng)過濾后用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟乙酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中流動相A相為體積比為O. 1% TFA水溶液，B相為純乙腈。
3.權利要求I的合成方法，其中在步驟(I)中用于合成肽的偶聯(lián)劑包括選自以下的一種或多種混合酸酐、活化的酯或?；u、碳二亞胺、活化的苯并三嗪衍生物、苯并三唑的脲鎗或鱗鹽衍生物、BOP, PyBOP, PyAOP, HCTU, TCTU, HATU, TATU, TOTU, HAPyU,或其混合物；步驟(I)優(yōu)選在堿存在下發(fā)生反應，所述堿優(yōu)選為N，N- 二異丙基乙胺、N, N’ - 二烷基苯胺、2,4,6-三烷基吡啶或N-烷基嗎啉，其中所述烷基是直鏈或支鏈C1-C4烷基，更優(yōu)選為N-甲基嗎啉或2，4，6_三甲基吡啶，最優(yōu)選為2，4，6_三甲基吡啶；步驟(I)優(yōu)選使用偶聯(lián)添加齊U，特別是苯并三唑類的偶聯(lián)添加劑，優(yōu)選為N-羥基苯并三唑衍生物或N-羥基苯并三嗪衍生物，更優(yōu)選為N-羥基丁二酰亞胺、N-羥基-3，4- 二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1_羥基-7-氮雜苯并三唑和N-羥基苯并三唑，最優(yōu)選為N-羥基苯并三唑；步驟(I)優(yōu)選使用20%哌啶/N-甲基嗎啉溶液，20%哌啶/DMF溶液，進行堿不穩(wěn)定性N α的脫保護，尤其用于固相合成中N-末端的Fmoc或Boc保護。
4.權利要求I的合成方法，其中步驟(I)中的所述肽具有至少另一種側(cè)鏈保護基團，包括Trt、tBu、Pbf、OtBu, Acm, Boc ;優(yōu)選地，所述S-烷基-硫基保護基團為S-叔丁基硫基保護基團；優(yōu)選地，步驟(I)所得的肽的替代度范圍可小于O. 5mmol/g,優(yōu)選為O. 1-0. 5mmol/g，更優(yōu)選為O. 3mmol/g0
5.權利要求I的合成方法，其中所述肽中半胱氨酸或高半胱氨酸被至少3個殘基隔開，優(yōu)選被至少5個殘基隔開；優(yōu)選地，所述肽包括2-100個氨基酸殘基；優(yōu)選地，所述高半胱氨酸的側(cè)鏈包括2-15個亞甲基和I個巰基。
6.權利要求I的合成方法，其中所述S-烷基-硫基保護基團去除劑為三烷基膦或巰基試劑，優(yōu)選為三正丁基膦或硫醇類；其中所述三烷基膦或硫醇類的投料倍數(shù)優(yōu)選大于10倍，更優(yōu)選為10倍-100倍，最優(yōu)選為50倍。
7.權利要求I的合成方法，其中步驟⑵的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、異丙醇、N-甲基吡咯烷酮，或其混合物，優(yōu)選N，N-二甲基甲酰胺/異丙醇混合液(混合比優(yōu)選為10 D ;步驟(2)優(yōu)選在惰性氣體保護下進行反應，所述惰性氣體優(yōu)選為氮氣、氬氣，更優(yōu)選為氮氣。
8.權利要求I的合成方法，其中步驟(3)的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯亞砜，或其混合物，優(yōu)選DMF和DCM的混合液(混合比優(yōu)選為4 I);步驟(3)優(yōu)選在堿存在下發(fā)生反應，所述堿可為堿性鹽(如乙酸鈉)或胺，優(yōu)選為胺，更優(yōu)選為叔胺，最優(yōu)選為三乙胺；步驟(3)中所述的氧氣優(yōu)選是鼓泡到反應液體中的；步驟(3)的所述非均相催化劑可為炭；步驟(3)的反應時間優(yōu)選為10h-40h，更優(yōu)選為20h-35h，最優(yōu)選為 30h。
9.權利要求I的合成方法，其中步驟(4)是脫除所有側(cè)鏈保護基同時將粗肽從樹脂上切割下來得到含不對稱二硫鍵的肽，其中肽樹脂裂解所采用的裂解液優(yōu)選為三氟乙酸、三異丙基硅烷和水的混合試劑，所述混合溶劑的比例優(yōu)選為-JFA為85% -99% (V/V) ,TIS為10% -1% (V/V)、余量為水，更優(yōu)選比例為 90%-95% (V/V)、TIS 為 5%-3% (V/V)、余量為水，最優(yōu)選為TFA TIS :水=94 : 3 : 3 (V/V);或者，所述裂解液優(yōu)選為三氟乙酸、三異丙基硅烷、苯甲醚、苯甲硫醚的混合試劑，所述混合試劑的比例優(yōu)選為TFA TIS :苯甲醚苯甲硫醚=90 : 3 : 2 : 5。
10.一種根據(jù)權利要求1-9中任一項的方法合成的含不對稱二硫鍵的肽，其具有以下通式
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含不對稱二硫鍵的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。
文檔編號C07K1/04GK102875639SQ20121036482
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者王宇恩, 陳永漢, 劉劍, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司