專利名稱：病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子p的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一段水稻DNA片段的分離克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。所述的DNA片段包含一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因的啟動(dòng)子，它能夠在病原物的誘導(dǎo)下特異性地驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)；它也能夠在植物激素和化學(xué)信號(hào)分子的誘導(dǎo)下特異性地驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。將該片段與抗病基因融合后轉(zhuǎn)入水稻，遺傳轉(zhuǎn)化植株在病原物誘導(dǎo)下可以特異地表達(dá)抗病基因，其抗病性增強(qiáng)。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，會(huì)受到多種病原物如病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲(chóng)等的侵害。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病害；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗性基因?qū)胫参锸悄壳案牧嫁r(nóng)作物抗病性的主要途徑之一。但是目前的遺傳轉(zhuǎn)化體系存在一些不足，很重要的一點(diǎn)便是轉(zhuǎn)化載體中的啟動(dòng)子大多是組成型表達(dá)啟動(dòng)子。這不僅造成了植物體的負(fù)擔(dān)，使植物在不需要發(fā)生抗病反應(yīng)時(shí)表達(dá)額外的蛋白，造成了浪費(fèi)；嚴(yán)重的還造成了植物體生理和代謝的紊亂，致其產(chǎn)生變異或死亡(Ehsani等，2003；Karlowski等，2003；Miyao等，2003；Durrant和Dong，2004)。
為了解決以上問(wèn)題，申請(qǐng)人試圖使用特異性啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子是一段對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用的DNA片段。啟動(dòng)子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)間，空間和表達(dá)量起調(diào)控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)有所不同。真核生物有三種RNA聚合酶，每一種都有其識(shí)別的不同啟動(dòng)子。RNA聚合酶II負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)基因和部分snRNA基因的轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。人們比較了上百個(gè)聚合酶II識(shí)別的真核啟動(dòng)子的序列，發(fā)現(xiàn)了一些共同的結(jié)構(gòu)。如1)帽子位點(diǎn)，即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其堿基大多為A，兩側(cè)各有若干個(gè)嘧啶核苷酸，其中A為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。2)TATA框，又稱Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列為T(mén)ATAAAA或TATATAT，而在它的兩側(cè)由富含G和C堿基對(duì)的序列組成，一般都位于-35bp附近。TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇，它是RNA聚合酶和DNA鏈結(jié)合的部位。3)CAAT框，其一致序列為GGC(T)CAATCT。一般位于-75bp附近，該框的堿基一旦缺失或突變，將會(huì)造成轉(zhuǎn)錄效率的急劇降低，CAAT框可能控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。4)增強(qiáng)子(enhancer)，又稱為遠(yuǎn)上游序列，一般都在-100bp以上，它對(duì)依賴和不依賴TATA框的轉(zhuǎn)錄均有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。
特異性的啟動(dòng)子分為二類，一是受誘導(dǎo)表達(dá)的特異啟動(dòng)子，二是組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子對(duì)外界的某些物質(zhì)，如病原物，化學(xué)物質(zhì)或逆境作出反應(yīng)，啟動(dòng)植物體內(nèi)相應(yīng)的基因表達(dá)。組織特異型的啟動(dòng)子則驅(qū)動(dòng)基因在特定的組織中表達(dá)。特異性的啟動(dòng)子可避免基因過(guò)量表達(dá)對(duì)植物體產(chǎn)生傷害。因此，利用水稻來(lái)源的病原物誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性基因的表達(dá)，是改良水稻抗性的最佳選擇之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是從水稻中分離克隆一個(gè)抗病相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段，對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，利用這個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因的表達(dá)，從而改良水稻的抗病性。這個(gè)啟動(dòng)子被命名為POsDR3(promoter of Oryza sativa defense responsive gene 3)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是將所克隆的啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)基因水稻在病原物誘導(dǎo)下可以特異地表達(dá)抗病基因，使其抗病性增強(qiáng)。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用水稻抗病相關(guān)基因OsDR3啟動(dòng)子的DNA片段(POsDR3)。該片段包含對(duì)病原、多種激素和化學(xué)信號(hào)分子產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的元件。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ IDNO1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的POsDR3啟動(dòng)子作探針，從基因組文庫(kù)中篩選得到本發(fā)明的啟動(dòng)子或同源的啟動(dòng)子。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組中擴(kuò)增得到本發(fā)明的POsDR3啟動(dòng)子以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含POsDR3的序列，將這一序列與基因連接并與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明為植物對(duì)病害的抗病育種提供了一種新的方法。這種方法包括將POsDR3與抗性基因連接后轉(zhuǎn)入感病植物，通過(guò)該啟動(dòng)子在病原侵襲植物時(shí)驅(qū)動(dòng)抗性基因的表達(dá)，提高植物對(duì)病原菌的抗性。
將克隆的啟動(dòng)子連接抗性基因轉(zhuǎn)入植物，可以避免植物過(guò)量表達(dá)目標(biāo)基因造成的不利影響，這是傳統(tǒng)的組成型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因的過(guò)程中無(wú)法做到的。
本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的啟動(dòng)子或基于該啟動(dòng)子的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入其它的植株。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，申請(qǐng)人闡述了分離、驗(yàn)證和應(yīng)用POsDR3啟動(dòng)子的過(guò)程以及該啟動(dòng)子的特點(diǎn)及應(yīng)用。


序列表SEQ ID No1.本發(fā)明分離克隆的POsDR3啟動(dòng)子序列。
圖1.水稻品種明恢63中覆蓋POsDR3啟動(dòng)子區(qū)段的Shotgun亞克隆的重疊圖。箭頭的位置及長(zhǎng)度表示測(cè)序的方向和長(zhǎng)度，序號(hào)代表Shotgun亞克隆編號(hào)，拼接得到一長(zhǎng)2946bp的序列。
圖2.OsDR3基因啟動(dòng)子(POsDR3)的基本結(jié)構(gòu)。+1是預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；ATG是翻譯起始位點(diǎn)；預(yù)測(cè)的TATA框是RNA聚合酶和DNA鏈結(jié)合部位；預(yù)測(cè)的CAAT框控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率。
圖3.遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381的結(jié)構(gòu)。
圖4.分離的POsDR3啟動(dòng)子位于OsDR3基因(圖2)的-691至+37bp處。用POsDR3調(diào)控報(bào)告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)的表達(dá)。
圖5.遺傳轉(zhuǎn)化植株在接種白葉枯病菌菌株JL691和對(duì)照處理(接水)后不同時(shí)間點(diǎn)GUS基因的表達(dá)量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為來(lái)源于3株轉(zhuǎn)化植株(7G7-1、7G7-2和7G7-4)數(shù)據(jù)的平均數(shù)。0小時(shí)為接種或接水后立即取材的樣品。GUS基因的表達(dá)量通過(guò)測(cè)定每分鐘每毫克蛋白中由GUS催化產(chǎn)生的4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。
圖6.在12IPMKb質(zhì)粒載體中POsDR3啟動(dòng)子調(diào)控抗白葉枯病基因Xa26的表達(dá)。
圖7.報(bào)告基因GUS在水稻愈傷組織中表達(dá)模式說(shuō)明POsDR3啟動(dòng)子對(duì)植物激素和化學(xué)信號(hào)分子的誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)答。GUS基因的表達(dá)量通過(guò)測(cè)定每分鐘每毫克蛋白中由GUS催化產(chǎn)生的4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的前期研究工作結(jié)果顯示來(lái)源于水稻品種明恢63的cDNA克隆EI12I1是OsDR3基因的cDNA片段，OsDR3是一個(gè)抗病相關(guān)基因。不同白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr)可特異性的誘導(dǎo)OsDR3基因的表達(dá)(Wen等，2003；專利申請(qǐng)?zhí)?00410009452.2，水稻抗病相關(guān)基因OsDR3，發(fā)明人王石平、邱德運(yùn)、熊敏；申請(qǐng)日2004.8.19)，提示OsDR3基因的啟動(dòng)子是一種受不同病原菌誘導(dǎo)特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期研究工作結(jié)果的基礎(chǔ)上分離克隆POsDR3啟動(dòng)子以及驗(yàn)證其功能和應(yīng)用的方法和結(jié)果。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例一分離克隆POsDR3啟動(dòng)子1.從抗病水稻品種明恢63中分離克隆包含POsDR3啟動(dòng)子的克隆本發(fā)明以上述cDNA克隆EI12I1做探針，從明恢63BAC文庫(kù)(Peng等1998)中篩選到一個(gè)陽(yáng)性BAC克隆7G7。用限制性內(nèi)切酶HindIII消化BAC克隆7G7，將酶切片段與HindIII處理的pUC19載體(購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)大腸桿菌DH10B(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，制備亞克隆。亞克隆經(jīng)用cDNA克隆EI12I1的序列設(shè)計(jì)的PCR引物EI12I1F(5’-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3’)和EI12I1R(5’-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3’)擴(kuò)增檢測(cè)，獲得一個(gè)包含目標(biāo)啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性亞克隆7G7H14；該亞克隆的外源插入片段長(zhǎng)約3.6kb。
2.測(cè)序分析亞克隆7G7H14本發(fā)明采用Shotgun的方法進(jìn)行測(cè)序(Sambrook和Russell，2001)。其主要步驟如下將亞克隆7G7H14用超聲波打斷，通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離大約1kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端；將這些片段與限制性內(nèi)切酶SmaI處理的pUC18載體(購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，挑克隆檢測(cè)插入片段大小。選擇插入片段在1kb左右的克隆進(jìn)行測(cè)序。
采用M13-R和M13-F通用引物(購(gòu)自中國(guó)上海生工生物工程公司)、美國(guó)AppliedBiosystems公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)、分別從每個(gè)亞克隆的兩端測(cè)序。共計(jì)對(duì)17個(gè)亞克隆進(jìn)行了測(cè)序(圖1)。使用Sequencher 4.1軟件(美國(guó)Gene Codes Corporation)拼接序列。用該軟件自動(dòng)去除末端測(cè)序較差的序列和pUC18載體序列。在重疊序列長(zhǎng)度大于40bp、重疊序列的一致性大于95％的條件下進(jìn)行序列拼接，得到一段長(zhǎng)2946bp的序列。目標(biāo)基因區(qū)段的每一個(gè)堿基都參照重疊在該位點(diǎn)的多個(gè)Shotgun片段的序列來(lái)確定。
3.POsDR3啟動(dòng)子的分離和結(jié)構(gòu)分析采用基因預(yù)測(cè)軟件GenScan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)對(duì)亞克隆7G7H14的序列(2946bp)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。分析結(jié)果表明該亞克隆包含一個(gè)完整的基因，即OsDR3基因，在其上游600多個(gè)堿基處有另一個(gè)不完整的基因，因此推測(cè)OsDR3基因的啟動(dòng)子可能小于700bp。
根據(jù)預(yù)測(cè)的OsDR3基因啟動(dòng)子位置，本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶MscI和AccIII消化亞克隆7G7H14，獲得一個(gè)由728堿基組成的、包含OsDR3基因啟動(dòng)子的DNA片段。該DNA片段位于OsDR3基因的-691至+37處，被命名為POsDR3(promoter of Oryza sativa defenseresponsive gene3)(圖2)。
采用一系列啟動(dòng)子分析軟件，如Softberry網(wǎng)站(http://www.softberry.com)的TSSP軟件、PROSCAN軟件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)、PLACE(A Database of PlantCis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)、TESS軟件(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)、Match1.0軟件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以及AliBata2.1軟件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibata2/index.html)等分析OsDR3基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)在OsDR3啟動(dòng)子的-30bp處是TATA框，-179bp是與轉(zhuǎn)錄頻率有關(guān)的CAAT框(圖2)。
實(shí)施例二POsDR3啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用載體是pCAMBIA1381。pCAMBIA1381載體是國(guó)際上常用的植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列載體。該載體攜帶無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)(圖3)。pCAMBIA1381載體由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠贈(zèng)。
遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用常規(guī)重組質(zhì)粒構(gòu)建方法(Sambrook和Russell，2001)。主要步驟是將從亞克隆7G7H14上獲得POsDR3啟動(dòng)子用T4 DNA Polymerase抹平酶切片段末端；同時(shí)，用平端的限制性內(nèi)切酶SmaI酶切遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381；酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物；然后用去磷酸化酶Alk對(duì)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理；用包含POsDR3啟動(dòng)子的酶切片段和去磷酸化的pCAMBIA1381載體做連接反應(yīng)，使其驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)(圖4)。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)BspHI和EcoRI酶切篩選外源片段正向插入的陽(yáng)性克隆。獲得的重組質(zhì)粒被命名為D53I。將D53I質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)進(jìn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
2.POsDR3啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的D53I導(dǎo)入感病水稻品種牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。本發(fā)明共獲得獨(dú)立遺傳轉(zhuǎn)化水稻植株32株。采用剪葉法(Kauffman等，1973)，對(duì)所有轉(zhuǎn)化植株在成株期階段接種白葉枯病菌菌株JL691(Sun等，2004)進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與不接種的轉(zhuǎn)化植株相比，白葉枯病菌侵染后報(bào)告基因GUS的表達(dá)量迅速上升。本發(fā)明進(jìn)一步選擇單拷貝的、T0代獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株7G7-1、7G7-2和7G7-4定量分析報(bào)告基因的表達(dá)量。在分蘗早期將這3株轉(zhuǎn)化植株分蔸，各個(gè)一分為二。在分蘗晚期將其中一份用于接種白葉枯病菌JL691，另一份用于接水作為對(duì)照。GUS基因的表達(dá)量通過(guò)測(cè)定每分鐘每毫克蛋白中由GUS催化產(chǎn)生的4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。Mu的測(cè)定按照J(rèn)efferson和Bevan(1987)報(bào)道的方法。其主要步驟是取約100mg水稻葉片，加入500μl提取液在研碎中研磨，離心后收集上清液，在1ml預(yù)熱的提取液中加入20μg的總蛋白，在37℃下反應(yīng)10分鐘后取100μl加入到900μl反應(yīng)中止液中，然后在激發(fā)波長(zhǎng)365nm和發(fā)射波長(zhǎng)458nm下用分光光度計(jì)測(cè)定樣品含量。樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford(1976)報(bào)道的方法。
分析結(jié)果表明本發(fā)明的啟動(dòng)子在白葉枯病菌誘導(dǎo)15分鐘即可誘導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)，在2小時(shí)報(bào)告基因的表達(dá)量達(dá)到高峰，大約是對(duì)照材料的19倍(圖5)。說(shuō)明POsDR3是病原特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
實(shí)施例三POsDR3啟動(dòng)子的應(yīng)用為了檢驗(yàn)POsDR3啟動(dòng)子在水稻抗病中的應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明將前述pCAMBIA1381載體中的報(bào)告基因GUS用水稻抗白葉枯病基因Xa26(Sun等，2004；專利號(hào)ZL02139212.9，水稻抗白葉枯病基因Xa26(t)；發(fā)明人王石平、孫新立、曹應(yīng)龍、楊之芬、張啟發(fā)；授權(quán)公告日2005.5.18)替代，采用實(shí)施例二所述的方法將POsDR3啟動(dòng)子與攜帶Xa26基因的pCAMBIA1381載體連接。獲得的重組質(zhì)粒被命名為12IPMKb(圖6)。將12IPMKb質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001)進(jìn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Sun等，2004)。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)將EHA105菌株攜帶的12IPMKb質(zhì)粒導(dǎo)入感病水稻品種中花11(Oryza sativa ssp.japonica)，獲得19株獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株。轉(zhuǎn)化植株被命名為12IPMKb-1、2等。用Xa26基因的特異引物RKb-3race2(5’-TGGTCAAATACCGGAAGGAG-3’)和RKb-2R(5’-CAGTCCACCACATGGACAAG-3’)、采用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株，發(fā)現(xiàn)3株(12IPMKb-7、12IPMKb-16、12IPMKb-19)為陰性植株，其它16株是陽(yáng)性植株(表1)。在孕穗期采用剪葉法(Kauffman等，1973)對(duì)所有轉(zhuǎn)化植株接種國(guó)際上常用的白葉枯病菌菌株P(guān)XO61(Sun等，2004)，發(fā)現(xiàn)12株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的抗白葉枯病菌侵害能力顯著(P＜0.01)增強(qiáng)(表1)；與遺傳轉(zhuǎn)化的受體水稻品種中花11相比，這些轉(zhuǎn)化植株的病斑面積減小了57.8-81.5％。這些結(jié)果說(shuō)明用POsDR3啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因表達(dá)能有效地改良水稻的抗病性。
表1.T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株對(duì)白葉枯病菌株P(guān)XO61的反應(yīng)


1+代表陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株；-代表陰性轉(zhuǎn)化植株。
實(shí)施例四POsDR3啟動(dòng)子對(duì)植物激素和化學(xué)信號(hào)分子產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)1.報(bào)告基因GUS瞬時(shí)表達(dá)分析采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994)瞬時(shí)表達(dá)GUS。其主要步驟如下取3-5塊水稻品種牡丹江8的愈傷組織，經(jīng)過(guò)3天預(yù)培養(yǎng)后(N6培養(yǎng)基)，將愈傷組織在攜帶POsDR3GUS構(gòu)建物(質(zhì)粒D53I，圖4)的農(nóng)桿菌EHA105菌株懸浮液中浸泡30分鐘到1小時(shí)，在N6培養(yǎng)基上共培養(yǎng)16小時(shí)以上，然后用無(wú)菌水洗滌愈傷組織。將100μmol/l的乙烯、脫落酸、水楊酸、茉莉酸、或赤霉素分別加入含有愈傷組織的1.5ml離心管中，剛剛淹沒(méi)愈傷組織，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，并分別在15分鐘、30分鐘及1小時(shí)取樣。經(jīng)過(guò)處理的愈傷組織按Jefferson和Bevan(1987)的方法進(jìn)行GUS活性的定量分析。
2.多種激素和化學(xué)信號(hào)分子誘導(dǎo)POsDR3啟動(dòng)子的功能通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因GUS的瞬時(shí)表達(dá)，證實(shí)POsDR3啟動(dòng)子不僅受多種抗病途徑的信號(hào)分子(水楊酸、茉莉酸、乙烯)的誘導(dǎo)，也受其它激素(脫落酸、赤霉素)的誘導(dǎo)(圖7)。攜帶POsDR3GUS的組織在乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)后15分鐘到1小時(shí)均保持較恒定的、高水平的GUS活性，其活性是接水對(duì)照的大約14倍。POsDR3GUS在脫落酸誘導(dǎo)15分鐘后即呈高水平表達(dá)，誘導(dǎo)30分鐘時(shí)其表達(dá)到達(dá)頂峰(大約是對(duì)照表達(dá)量的14倍)，而誘導(dǎo)1小時(shí)后表達(dá)量降低。POsDR3GUS在水楊酸誘導(dǎo)15分鐘至1小時(shí)均呈上升表達(dá)，在1小時(shí)的最高峰時(shí)的表達(dá)量是接水對(duì)照的17倍。POsDR3GUS在赤霉素誘導(dǎo)15分鐘時(shí)表達(dá)量達(dá)到頂點(diǎn)(是對(duì)照的15.4倍)，但隨誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸下降。這些結(jié)果說(shuō)明POsDR3啟動(dòng)子不僅可通過(guò)調(diào)控抗性基因用于水稻的抗病性改良，還可以通過(guò)調(diào)控其它基因的表達(dá)，用于改良水稻對(duì)脫落酸和赤霉素反應(yīng)產(chǎn)生的各種生理活動(dòng)。
參考文獻(xiàn)Bradford MM(1976)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72248-254.
Durrant WE，Dong X(2004)Systemic acquired resistance.Annu.Rev.Phytopathol.42185-209.
Ehsani P，Meunier A，Nato F，Jafari A，Nato A，Lafaye P(2003)Expression of anti human IL-4 andIL-6 scFvs in transgenic tobacco plants.Plant Mol.Biol.5217-29.
Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.6271-282.
Jefferson RA，Bevan MW(1987)GUS fusionsbeta-glucuronidase as a sensitive and versatile genefusion marker in higher plants.EMBO J.63901-3907。
Karlowski WM，Hirsch AM(2003)The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene inducespleiotropic effects on plant growth and development.Plant Mol.Biol.52121-33.
Kauffman HE，Reddy APK，Hsieh SPY，Merca SD(1973)An improved technique for evaluatingresistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57537-541.
Miyao M，F(xiàn)ukayama H(2003)Metabolic consequences of overproduction of phosphoenolpyruvatecarboxylase in C3 plants.Arch.Biochem.Biophys.414197-203.
Peng KM，Zhang HB，Zhang Q(1998)A BAC library constructed to the rice cultivar′Minghui63′for cloning genes of agronomic importance.Acta Botanica Sinica 401108-1114.
Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York.
Sun X，Cao Y，Yang Z，Xu C，Li X，Wang S，Zhang Q(2004)Xa26，a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv，oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J.37517-527.
Wen N，Chu Z，Wang S(2003)Three types of defense-responsive genes are involved in resistanceto bacterial blight and fungal blast diseases in rice.Mol.Genet.Genomics 269331-339.
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子POsDR3及其在改良水稻抗性中的應(yīng)用<130>
<141>2006-04-26<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>728<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>promoter<222>(1)..(728)<223>
<400>1attggccaga tcgggttagg gagggggtcg ccatcgccgc ctgcactaga ttaatcgctc 60gccccggccc agaacgtcgc tctctccgtc cgtccccggc tcgccaccat ctcctcctcc120aagacgcaac ttcgagagtg agagagagag agaatcgaga gatccaatcc agtttgcgca180acgagtggca tggcatgcaa ccgatctaga acgtcaaata aaaacaacgc catgcgtaca240tacacgttca tgtgccgcgc gccggtgtag cgcagcgtag agagagagag agagagagag300tatggtagtc ttcctacgct cggtcagtga cagcgtcgcg gcgcataaag aaaggcatcc360actagcagga gccagcatac gctgccgcat atacaaacac gcatgtagcc aaggcgagga420gagagagaga gagagagaga gagagggaga tcattgaaag ctgcacccat ccgtttgttc480gccaccattt ccatcccctc catcatgagc tccaattagt cgcacaccga tcccctcctc540ttcttccccc ccttctcctc tctcctcttt ttttcctcat ccgtgcgcga tactgcgctt600agtttgtggg tggggggagt gatcatcacc aaagccacaa agggggcgcg gagagatatt660atatattctt tgggaaagcg ttggattagt ttttctcgct ttgggctttt tatccggagt720tggagtgt 728
權(quán)利要求
1.一種對(duì)病原菌、多種激素和化學(xué)信號(hào)分子產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的啟動(dòng)子POsDR3，它是SEQ IDNO1中所示的DNA序列。
2.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，它是水稻抗病相關(guān)基因OsDR3的啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1或2所述的DNA序列在增加水稻對(duì)病害抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子P
文檔編號(hào)C12N15/82GK101063133SQ200610018888
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者王石平, 蔡萌, 曹應(yīng)龍 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)