專利名稱：對多種核酸分子進行平行實時定量檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到核酸的檢測，基因診斷，基因序列分析，基因類型及多態(tài)性的分析，以及基因表達(dá)的分析等生物技術(shù)領(lǐng)域。特別是在基因檢測的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time quality PCR)和陣列化的核酸檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
自從1985年，Kary Mullis發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)一下子成為了分子生物學(xué)發(fā)展以來最具影響力的技術(shù)革命之一。它使得核酸檢測成為一種成熟的，高靈敏度，快速的檢測技術(shù)，并且很快的廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究和微生物病原體體的臨床檢測中，包括真菌、細(xì)菌、病毒等的檢測。Kary Mullis也因此于1993年獲得了諾貝爾獎。
但是，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后需要煩瑣的DNA電泳檢測，并且由此容易產(chǎn)生樣品相互之間的交叉污染。使得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對技術(shù)操作人員以及實驗室要求很高，而且檢測的錯誤率很高。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最終在臨床檢測的應(yīng)用受到了挑戰(zhàn)。
到九十年代的中后期，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time quality PCR)技術(shù)，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，減去了DNA電泳檢測，使得操作簡便了一些，并且省去了DNA電泳檢測的時間。同時也使得交叉污染的機率降低了，提高了檢測的準(zhǔn)確性，并且能夠更準(zhǔn)確的量化被檢測的核酸分子。這一技術(shù)的檢測線形范圍能達(dá)到7-9個數(shù)量級，靈敏度能檢測到低到幾個拷貝的核酸分子，精確性可以達(dá)到小于3％的偏差。它以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，并且開始被臨床檢測所接受。
臨床微生物的檢測是實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)現(xiàn)在在臨床檢測的最重要的領(lǐng)域，它比傳統(tǒng)的臨床微生物檢測技術(shù)大大的縮短了檢測時間，提高了檢測的靈敏度，而且操作更加簡便。目前，主要用于一些常見病毒，如HIV，HBV，HCV等的臨床檢測，或是難培養(yǎng)的細(xì)菌，如結(jié)核桿菌的檢測上。在生命科學(xué)研究，特別是基因表達(dá)的定量分析上，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)也有著非常廣泛的應(yīng)用。實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)同時也被應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測，公共衛(wèi)生檢測，生物武器檢測等分析上。
但是，很多核酸檢測需要檢測和定量的核酸分子不止一種。而實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)又恰恰難進行多種核酸的平行檢測和定量分析。很多生物技術(shù)公司，包括ABI，Invitrogen等，或是生物技術(shù)研究室都在試圖開發(fā)多通量的核酸平行檢測和定量分析技術(shù)。這些多種核酸的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，或是通過用多種不同光譜的熒光分子來標(biāo)記不同的探針分子來檢測不同的核酸分子，或者是在多個反應(yīng)管道中分別進行多個實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。而這些技術(shù)或是要求多種不同光波段的熒光分子，或是需要高密度的反應(yīng)管道，使得原先就已經(jīng)比較昂貴的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，其試劑和儀器成本成倍的增長。而且，它們的檢測通量受到了熒光分子種類和反應(yīng)管道體積的限制。
因此，本領(lǐng)域中迫切需要提供改進的、簡單的能同時對多種核酸分子進行實時定量檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者經(jīng)過深入研究，建立了能同時對多種核酸分子進行實時定量檢測的方法。
具體而言，本發(fā)明第一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用激發(fā)光源在固相載體與液體界面處產(chǎn)生倏逝場，使得與所述探針分子結(jié)合的所述擴增產(chǎn)物上的熒光基團被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號；g)檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
本發(fā)明另一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性，所述核酸探針分子上連接有第一熒光基團；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用第二熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物，其中所述第一熒光基團的發(fā)射譜與所述第二熒光基團的激發(fā)譜重疊，或所述第二熒光基團的發(fā)射譜與所述第一熒光基團的激發(fā)譜重疊；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用光激發(fā)所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；g)檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發(fā)射的熒光位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
本發(fā)明的方法是全新的，其通過一個反應(yīng)能高通量的對成百上千種的核酸分子進行檢測和定量的技術(shù)，它不需要多種熒光基團標(biāo)記，不需要多個反應(yīng)通道，從而在成本和檢測目標(biāo)分子通量上有很大的技術(shù)優(yōu)勢。


圖1為全反射產(chǎn)生倏逝場的原理圖。
圖2顯示了倏逝場強度與深度的關(guān)系隨入射角度(A)和折射率(B)的變化。
圖3為平面波導(dǎo)產(chǎn)生倏逝場的原理圖。
圖4為熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理圖。
圖5為多種核酸的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熒光變化曲線示意圖。
圖6A顯示了核酸探針分子通過化學(xué)鍵連接在玻璃表面。
圖6B顯示了核酸探針分子通過聚合物連接包埋在金屬氧化物表面。
圖7為通過全反射產(chǎn)生倏逝場對多種核酸分子進行平行定量分析方法的梗概圖。
圖8顯示了倏逝場激發(fā)與固定在載體表面的探針分子雜交的目標(biāo)核酸上的熒光基團。
圖9A顯示，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的溫度循環(huán)的進行，CCD檢測到的被倏逝場激發(fā)的各探針點雜交上的熒光信號。
圖9B為被倏逝場激發(fā)的各探針點實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熒光變化曲線。
圖9C為通過倏逝場方法的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的Ct值，定量四種剪切方式的起始相對拷貝數(shù)。
圖10為通過平面波導(dǎo)產(chǎn)生倏逝場對多種核酸分子進行平行定量分析方法的梗概圖。
圖11為通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移對多種核酸分子進行平行定量分析方法的梗概圖。
圖12為與固定在載體表面的探針分子雜交的目標(biāo)核酸通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)。
圖13A為隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的溫度循環(huán)的進行，CCD檢測到的通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)的各探針點雜交上的熒光信號。
圖13B為通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)的各探針點實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熒光變化曲線。
圖13C為通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的Ct值，定量各種被檢測細(xì)菌基因的起始相對拷貝數(shù)。
較佳實施方案本發(fā)明第一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用激發(fā)光源在固相載體與液體界面處產(chǎn)生倏逝場，使得與所述探針分子結(jié)合的所述擴增產(chǎn)物上的熒光基團被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號；g)檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
適用于本發(fā)明方法的樣品可以是各種形式，只要其中具有待檢測的目標(biāo)核酸分子即可。例如可以用本領(lǐng)域熟知或公開的方法(如限制性內(nèi)切酶消化或機械方法)得到核酸樣品，如總DNA、基因組DNA、cDNA、總RNA、mRNA等混合物。
本文所用的術(shù)語“核酸”、“核酸分子”可以互換使用，其指脫氧核糖核酸或核糖核酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非另有特別限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸。該術(shù)語“核酸”可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換使用。另外，本發(fā)明的核酸分子還涵蓋了核酸片段、核酸亞序列、核酸衍生物和核酸修飾物。所述的核酸長度可以各異，其可以是較大核酸分子的片段或較小的部分。較佳的是，待檢測的核酸長度至少為30個堿基對，更佳的是長度為至少50個堿基對，例如30-4000個、50-2000個或50-1000個堿基對。待檢測的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是單鏈或雙鏈形式。其可從任何來源衍生待擴增的核酸。
在本發(fā)明的一個較佳的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于平行檢測多種外顯子的不同拼接方式而表達(dá)出的多種mRNA及其量。在另一個較佳的實施方案中，本發(fā)明的方法可用來鑒定樣品中多種細(xì)菌的存在及其量。
在本發(fā)明方法中采用了一種固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對樣品中的所述多種核酸分子有特異性。本文所用的術(shù)語“固相載體”或“固體載體”是指核酸可固定于其上的對熒光基團的激發(fā)波長有低吸收的固體表面。例如，玻璃、尼龍膜、石英、陶瓷、金屬、塑料、有機聚合物等材料都能做為本發(fā)明的固體載體，只要該載體在對要檢測的熒光基團激發(fā)波長段的光低吸收，都能檢測到明顯的熒光信號。應(yīng)當(dāng)注意的是，對于載體并不必需是透明的，只要其對一定波長段的光低吸收，即對這一波段的光是透明的即可，其也可能在可見光的其他波段是不透明的。另外，固體載體的折射率需要大于所選液相的折射率，通常較佳的折射率需要大于1.33。在本發(fā)明中，優(yōu)選的固相載體是玻璃。在較佳的實施方案中，這些載體宜經(jīng)過化學(xué)方法修飾，從而帶有活性基團，能與核酸上的氨基、醛基、磷酸基、或是修飾的巰基等形成穩(wěn)定的連接，增強對核酸探針分子的固定能力。
本文所用的術(shù)語“固定”是指將核酸固定在固相支持物上，通過化學(xué)共價結(jié)合方式附著，或通過不可逆的被動吸附，或通過分子間的親和力(例如利用生物素?；姆肿咏宇^來固定于涂有親和素的表面)。這種固定的強度必須足以在DNA變性條件下，不會因用水或緩沖水溶液洗滌而被除去。一種較佳的固定方法是采用雙官能交聯(lián)劑處理玻片，以得到帶有反應(yīng)性交聯(lián)基團(如氨基、硫代或丙烯酸基團)的表面。所述交聯(lián)劑可以是，例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰酐、苯基二異硫氰酸鹽或馬來酸酐、或異雙官能團交聯(lián)劑，如間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N-琥珀酰亞胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-馬來酰亞胺丁酰氧-琥珀酰亞胺酯(GMBS)、琥珀酰亞胺-4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸鹽(SMPB)等。另外可參見文獻Nucleic Acids Research，29e69，2001.Analytical Biochemistry，24796-101，1997.Analytical Biochemistry，26623-30，1999.Nucleic Acids Research，304793-4802，2002。
固定于載體表面上的核酸探針分子可根據(jù)目標(biāo)基因的信息進行設(shè)計，從而使其能夠以特異性的方式分別與樣品中的多種目標(biāo)核酸分子或其擴增產(chǎn)物特異性結(jié)合。該探針的長度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需求進行合適的選擇，通常在6-2000個核苷酸(較佳10-50個核苷酸、更佳15-30個核苷酸)之間。另外，根據(jù)具體的用途，可能還需要采用修飾過的核酸探針。該核酸探針可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。
核酸探針在固相載體上宜為空間上分開的陣列，其通常是這樣構(gòu)成的，將固相載體(如玻片)分成不同的區(qū)域，使每個區(qū)域中只含有一種核酸探針分子。通過DNA陣列技術(shù)，可使多種DNA探針分子排列在固體載體上。
用于核酸檢測的核酸探針分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核酸(peptide nucleic acid)、長鏈DNA分子、RNA分子、或者它們的修飾物。這些核酸探針分子可以通過化學(xué)鍵連接、物理吸附、或是聚合物包埋、蝕刻或粘聯(lián)等方式固定在固體載體上。核酸探針還可通過接頭或間隔臂連接在固相載體上。排列在固體載體上的DNA探針分子通過堿基間的相互配對，與目標(biāo)分子(如擴增產(chǎn)物)相結(jié)合。通常目標(biāo)分子是被熒光基團標(biāo)記上的，它可通過擴增反應(yīng)使得熒光基團等標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸(dNTP)摻入到目標(biāo)核酸分子的擴增產(chǎn)物中，或是通過熒光基團等標(biāo)記的引物使擴增產(chǎn)物帶上熒光基團的方法。通過雜交后洗脫，雜交結(jié)合上去的目標(biāo)分子所帶的熒光信號被檢測到。
核酸分子能通過DNA聚合酶或是RNA聚合酶在體外進行復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的過程，從而線性或是指數(shù)性的擴增其拷貝數(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，擴增過程通常包括變性，退火，合成三個步驟，即雙鏈核酸分子的解鏈(變性)，被解鏈的核酸分子與引物分子結(jié)合(退火)，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以解鏈的核酸分子為模板合成與之互補的DNA或RNA分子。
可用于本發(fā)明的核酸擴增方法包括，但不局限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，隨機引物擴增反應(yīng)，復(fù)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增等。在一個較佳的實施方案中，宜采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”指一種適用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段的技術(shù)，其在例如美國專利No.4,683,195(1987年7月28日授權(quán))中有詳細(xì)的描述。通常，需要獲得感興趣區(qū)域兩端或其外延的序列信息，從而可以設(shè)計寡核苷酸引物；這些引物應(yīng)與待擴增模板相反鏈的序列基本上相同或相似。兩個引物的5′端核苷酸可以與擴增材料的兩端恰好重合。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可用來擴增全部基因組DNA中的、從全細(xì)胞RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。本文所用的PCR被認(rèn)為是擴增樣品中核酸分子的一個但并非唯一的例子，該方法中采用已知的核酸作為引物和核酸聚合酶來擴增或產(chǎn)生特定片段的核酸。
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，雙鏈的DNA分子在90℃以上變性成單鏈分子，然后在50-60℃與引物分子相結(jié)合，同時結(jié)合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此單鏈DNA分子為模版，脫氧核苷三磷酸(dNTP)為底物，復(fù)制出另一條與之互補的DNA，通常聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DNA聚合酶最適的合成溫度為70-78℃。通過復(fù)制，目標(biāo)DNA分子擴增了一倍。這樣多次的重復(fù)反應(yīng)n個循環(huán)后，目標(biāo)DNA分子擴增了近2n倍。具體可用于本發(fā)明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4 DNA聚合酶)、各種耐熱細(xì)菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tli、Tfl DNA聚合酶)以及它們遺傳修飾的衍生物(TaqGold，VENTexo，Pfu exo)。優(yōu)選的DNA聚合酶是Taq或Tfl DNA聚合酶。較佳地，用于本發(fā)明的核苷三磷酸分子是脫氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。
在核酸分子進行擴增反應(yīng)的過程中，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以脫氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)為底物進行合成，合成成新的擴增產(chǎn)物。因此，通過在擴增引物上標(biāo)記熒光基團或是在底物脫氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)上標(biāo)記熒光基團，就可使擴增的目標(biāo)DNA分子就會標(biāo)記上所需的熒光基團。
標(biāo)記熒光基團的技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中所熟知的。常見的熒光基團包括，但不局限于，有機熒光分子類，如熒光素，TAMRA，Cy3，Cy5，Cy5.5，羅丹明，Alexa Fluor系列等；熒光蛋白類，如GFP，CFP，BFP，YFP等；含稀土金屬離子的時間分辨熒光以及量子點(Quantum dot)四種。
在擴增反應(yīng)的退火過程中，前一輪擴增得到的待檢測核酸分子擴增產(chǎn)物在與擴增引物結(jié)合的同時，也會與固定在載體上的核酸探針分子相結(jié)合，從而使結(jié)合上的目標(biāo)核酸分子擴增產(chǎn)物上的熒光基團得以被本發(fā)明的特異性的方式激發(fā)。具體而言，目標(biāo)核酸分子擴增產(chǎn)物上的熒光基團可以被載體內(nèi)由光的全反射、或是平面波導(dǎo)所產(chǎn)生的倏逝場激發(fā)。
(i)光的全反射產(chǎn)生的倏逝場眾所周知，當(dāng)光從高折射率(n1，如玻璃)的介質(zhì)(光密介質(zhì))照射到低折射率(n2，液相如水)的介質(zhì)(光疏介質(zhì))，并且入射角大于臨界角(θc，θc＝sin-1(n2/n1)當(dāng)n2＜n1)時，光將在光密介質(zhì)中發(fā)生全反射，從而不能折射到光疏介質(zhì)中。然而，當(dāng)光發(fā)生全反射時，光波會以電磁場的形式在入射點的地方滲透至光疏介質(zhì)中，滲透的電磁場的強度隨著滲透深度的加深而成指數(shù)衰減(圖1)，其滲透的深度為dp＝(λ/2πn1][1/(sin2θ-n22/n12)]1/2(λ，光在真空中的波長；θ，入射角度)其深度通常在100到300納米之間。根據(jù)公式，它與入射角，入射光波長，折射率有關(guān)(圖2)。這種通過全反射滲透到光疏介質(zhì)的電磁場就被稱為倏逝場。倏逝場和其他光源一樣，也能激發(fā)熒光基團。如果光密介質(zhì)表面鍍有納米量級(約100-200納米)的金、銀、銅等貴重金屬膜或顆粒，將可以一定程度的增強倏逝場激發(fā)熒光的強度，增強程度為幾倍到幾十倍不等，增強程度與金屬種類和厚度等因素有關(guān)(參見文獻Analytical Biochemstry，334303-311，2004.Journal of Fluorescence，14425-441，2004.Current Opinion in Biotechnology，1655-61，2005)。因此，在本發(fā)明的一個較佳的實施方案中，光密介質(zhì)(即固相載體)表面可以鍍有小于1000納米厚(通常約50-500納米，更佳約100-200納米)的金屬膜，或者直徑小于1000納米(通常約50-500納米，更佳約100-200納米)的金屬顆粒，其中所述金屬選自金、銀、銅或其它貴金屬。
由于倏逝場滲透的深度非常小，只有幾百納米，因此倏逝場只能激發(fā)貼近于介電層100-200納米內(nèi)的熒光基團，而絕大部分在光疏介質(zhì)中的熒光基團不會受到激發(fā)。倏逝場激發(fā)的熒光信號強度相當(dāng)于結(jié)合到載體表面的目標(biāo)DNA分子的量。溶液中目標(biāo)DNA分子的濃度越高，與DNA探針結(jié)合上的分子也越多，激發(fā)的熒光信號也越強。
(ii)平面波導(dǎo)產(chǎn)生的倏逝場平面波導(dǎo)一般為100-300納米的高折射率膜，例如五氧化二鉭(Ta2O5)，二氧化鈦(TiO2)，氧化鋅(ZnO)，氧化鋯(ZrO2)，氧化鈮(Nb2O5)，氧化鉿(HfO2)等金屬氧化物膜。其沉積在透明的低折射率的固體基材(如玻璃，透明聚合物等)上。激光通過棱鏡或是光柵等方法耦合進該高折射率膜后，光在這一平面薄膜內(nèi)傳輸。同時，它將在高折射率膜和低折射率層之間產(chǎn)生很強的隨著滲透的深度的加深而成指數(shù)的衰減的倏逝場。倏逝場滲透的深度為dp＝(λ/2πn1)[1/(sin2θ-n22/n12)]1/2(λ，光在真空中的波長；θ，入射角度)該深度同樣在大約100納米(圖3)。在這平面波導(dǎo)層上固定上核酸探針分子后，倏逝場將激發(fā)雜交上的熒光探針分子，如果在平面波導(dǎo)層上鍍有納米量級(約100-200納米)的金、銀、銅等貴重金屬膜或顆粒，將可以一定程度的增強倏逝場激發(fā)熒光的強度，增強程度為幾倍到幾十倍不等，增強程度與金屬種類和厚度等因素有關(guān)。同樣的，由于平面波導(dǎo)產(chǎn)生的倏逝場穿透深度在納米級，絕大部分在反應(yīng)液這一光疏介質(zhì)中的熒光基團不會受到激發(fā)，從而就能檢測平面波導(dǎo)層上的特定位置的熒光強度。根據(jù)該熒光強度與核酸分子濃度的對應(yīng)關(guān)系或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，就能檢測溶液中各個目標(biāo)核酸分子的濃度。
本發(fā)明另一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；
b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性，所述核酸探針分子上連接有第一熒光基團；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用第二熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物，其中所述第一熒光基團的發(fā)射譜與所述第二熒光基團的激發(fā)譜重疊，或所述第二熒光基團的發(fā)射譜與所述第一熒光基團的激發(fā)譜重疊；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用光激發(fā)所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；g)檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發(fā)射的熒光位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
與探針分子結(jié)合的目標(biāo)核酸分子擴增產(chǎn)物上的熒光基團也可以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Flourescent resonance energy transfer，F(xiàn)RET)來激發(fā)。如圖4所示，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當(dāng)兩種不同的熒光生色團在空間上距離較近，且其中一種生色團(供體)401的發(fā)射譜與另一種生色團(受體)407的激發(fā)譜有重疊時，當(dāng)供體被激發(fā)時(如402所示)，受體409會因供體激發(fā)能的轉(zhuǎn)移408而被激發(fā)。理論上講，只要兩個光譜有重疊，就會發(fā)生FRET，只是能量轉(zhuǎn)移的效率與光譜重疊的積分、熒光量子效率和供體受體的距離等因素有關(guān)。(可參照文獻Proc Natl Acad Sci USA 58719-726，1967)能量轉(zhuǎn)移50％時的距離R0＝[8.8×1023×κ2×n-4×QYd×J(λ)]1/6，κ為極化方向因子，供體受體方向隨機是通常為2/3，n為折射率，水溶液通常為1.34，QYd為供體的熒光量子效率，J(λ)為供體的發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜重疊的積分強度。其直觀表現(xiàn)就是供體產(chǎn)生的熒光強度較其單獨存在時要低的多410，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強409，能量轉(zhuǎn)移效率與兩個生色團激發(fā)譜和發(fā)射譜的重疊程度、供體與受體躍遷偶極的相對取向、供受體間的距離有密切關(guān)系。發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移時，分子間距離小于10nm。常用的FRET熒光基團對對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，其包括，但不局限于，CFP-YFP，CFP-dsRED，BFP-GFP，GFP-dsRED，YFP-dsRED，Cy3-Cy5，Alexa488-Cy3，F(xiàn)ITC-羅丹明(TRITC)，YFP-TRITC，YFP-Cy3，F(xiàn)luorescein-Tetramethylrhodamine，IAEDANS-Fluorescein，EDANS-Dabcyl，F(xiàn)luorescein-QSY 7 andQSY 9，Alexa Fluor 350-Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 546，Alexa Fluor488-Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor568，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor555-Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 546-Alexa Fluor647，Alexa Fluor 555-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 568-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor594-Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 350-QSY 35，Alexa Fluor 488-QSY 35，Alexa Fluor546-QSY 35，Alexa Fluor 350-dabcyl，Alexa Fluor 488-dabcyl，Alexa Fluor 546-dabcyl，Alexa Fluor 488-QSY 7 and QSY 9，Alexa Fluor 546-QSY 7 and QSY 9，Alexa Fluor555-QSY 7 and QSY9，Alexa Fluor 568-QSY 7 and QSY 9，Alexa Fluor 568-QSY 21，Alexa Fluor 594-QSY 21，Alexa Fluor 647-QSY 21等。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠明了還能夠?qū)⑵渌麱RET熒光基團對用于本發(fā)明的方法中。
因此，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法檢測時，只需要固定在固體載體上的探針分子404連接上熒光基團，而擴增的目標(biāo)核酸405分子標(biāo)記上另一種熒光基團。并且這兩種熒光基團，其中一種生色團(供體)401的發(fā)射譜與另一種生色團(受體)407，409的激發(fā)譜有相當(dāng)程度的重疊時，光激發(fā)供體402，而檢測受體熒光411，那么只有雜交上的核酸分子406的熒光才能被檢測到，大量的在溶液中的以及未被雜交上的探針上的背景熒光不被激發(fā)407，或是激發(fā)的光由于不發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，發(fā)射的波長不同403，可以被濾鏡過濾而不被檢測到。這樣，熒光信號強度相當(dāng)于結(jié)合到載體表面的目標(biāo)DNA分子的量。溶液中目標(biāo)DNA分子的濃度越高，與DNA探針結(jié)合上的分子也越多，激發(fā)的熒光信號也越強。
上述兩個方法中的熒光信號和強度可用常規(guī)的儀器來進行檢測，例如可以采用電荷耦合器(Charge-Coupled Device，CCD)，光電倍增管(PMT)，光電探測器，或者光功率計等檢測設(shè)備。熒光標(biāo)記優(yōu)選的檢測系統(tǒng)是電荷耦合儀(CCD)照相機，它可任選地與放大裝置(如顯微鏡)連接。
通常，本發(fā)明以上兩種方法可以基于想類同的光學(xué)平臺配置，它們包含如下配置激發(fā)光源包括穩(wěn)定的汞燈、氙燈、汞氙復(fù)合電弧燈光源；從紫外到紅外波段不同波長的激光光源，包括氣體激光，半導(dǎo)體激光。
中性密度濾光片用以控制激發(fā)光的強度。
透鏡組用來整合光的條帶，控制光的入射。
濾鏡組為選定的熒光基團組合配置合適的濾鏡組，包括激發(fā)，發(fā)射，二色分光等。它可以削減光譜串色，提高要檢測熒光的信號噪聲比。
檢測設(shè)備其特征是能感應(yīng)某一位置光強度，核心成分可從高靈敏度PMT或冷CCD，光電探測器，或者光功率計中選擇。
本發(fā)明實際上涉及一種實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，該技術(shù)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積，實時監(jiān)測整個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進程，最后通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)核酸分子的擴增產(chǎn)物進行定量分析的方法。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不再以指數(shù)方式生成目標(biāo)核酸擴增產(chǎn)物(或稱為摸板)，從而進入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的最終擴增產(chǎn)物，用此終點法對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線(圖5)。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)早期，產(chǎn)生熒光信號的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光信號的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。盡管本發(fā)明實施例中設(shè)定Ct值為擴增反應(yīng)開始時信號值的3倍，然而，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)具體需求選擇和確定合適的Ct值。
本發(fā)明研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明中，隨著溶液中目標(biāo)DNA分子的擴增，熒光標(biāo)記的目標(biāo)DNA分子的濃度呈指數(shù)方式增加，與固定在載體表面的DNA探針分子結(jié)合上的也增多，相應(yīng)探針位置上激發(fā)的熒光信號也增強。因此，能夠在整個核酸擴增反應(yīng)過程進行了多種探針的實時監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號。隨之可以繪制成多條S型曲線，得出多個探針分子的Ct值，從而判斷和檢測目標(biāo)核酸的種類和拷貝數(shù)。這種核酸擴增反應(yīng)可以包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，隨機引物擴增反應(yīng)，或是其他聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)的擴增技術(shù)，以及包含有這些擴增反應(yīng)過程的反應(yīng)。其特征為包括核酸的變性和退火的過程，并能增加特定多核苷酸鏈的反應(yīng)。
為了更詳細(xì)的敘述本發(fā)明，根據(jù)附圖進行如下具體說明。然而，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)?；蛘?，可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進行。
實施例1作為實施例1，對適用本發(fā)明的核酸檢測方法，以對所定基因(以下稱為目標(biāo)基因)的多種選擇性拼接形式表達(dá)量的平行定量分析為例進行說明。
真核生物的基因表達(dá)通常有著多個外顯子的不同拼接方式而表達(dá)出多種mRNA的形式。為了檢測目標(biāo)基因的多種選擇性拼接形式各自的表達(dá)量，本發(fā)明者根據(jù)目標(biāo)基因的選擇性拼接段設(shè)計出針對于特定拼接形式的探針分子，各種探針分子通過化學(xué)連接方法固定在玻璃表面(圖6A)。當(dāng)然，它們也能通過化學(xué)鍵連接，物理吸附，或是聚合物包埋等方式固定在其他透明的折射率比反應(yīng)溶液高的其他固體載體上，如石英，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，PMMA等。
同時，可以在目標(biāo)基因選擇性拼接段的兩端的非選擇性拼接段，設(shè)計出針對于各種拼接形式的都能擴增的引物。通過一步或是兩步RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄擴增目標(biāo)基因的多種拼接形式。
具體以檢測肝細(xì)胞中Rab5A基因四種選擇性拼接方式的表達(dá)量為例，設(shè)計并合成如下兩條引物Cy3-5′-CATCAAGACATACAGTTTGGGTTAG-3′(SEQ ID NO1)Cy3-5′-CACAGTCCAGTGTGAGGGGAG-3′(SEQ ID NO2)針對于四種選擇性拼接方式Sp1，Sp2，Sp3，Sp4設(shè)計并合成如下四種特異性探針Rab5A-Sp15’-GTACCATTGGGGCTGCTTTTCTAA-3′-C6-SH(SEQ ID NO3)Rab5A-Sp25’-CAACCTCTGCCTCATGGGTTCA-3′-C6-SH(SEQ ID NO4)Rab5A-Sp35’-CATGAATTTCAAGAGAGTACCATTGGG-3′-C6-SH(SEQ IDNO5)Rab5A-Sp45’-CCTTTTCTTTCAGCTGCTTTTCTAACC-3′-C6-SH(SEQ ID NO6)然后通過將所述特異性探針固定在玻璃表面(具體的固定方法可參照文獻Analytical Biochemistry，26623-30，1999.中的方法)。
為更詳細(xì)的說明此發(fā)明，下面結(jié)合圖7和圖8對本發(fā)明實施例方法及過程進行詳細(xì)說明。如圖所示，各種核酸探針703，704，807通過DNA陣列的方法固定在K9玻璃709，809表面。固定探針的玻璃與一樣品槽701密合形成反應(yīng)艙。從要檢測的組織或細(xì)胞中分離純化總RNA后，將總RNA與反轉(zhuǎn)錄擴增的反應(yīng)液702混合，加滿了整個反應(yīng)艙，反應(yīng)液包括Tfl DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶對應(yīng)的擴增緩沖液，Cy3(801)標(biāo)記的擴增引物(如上)803，底物dNTP。整個反應(yīng)溫度受到一個加熱溫度控制平臺705的控制，從而進行多個循環(huán)擴增，包括目標(biāo)基因片段的反復(fù)變性(94℃)、退火(55℃)和反應(yīng)延伸(74℃)的過程，擴增產(chǎn)生的目標(biāo)基因片段802因為Cy3標(biāo)記的引物而帶上了Cy3熒光基團801。
在退火反應(yīng)過程中，擴增的目標(biāo)基因片段802與引物803結(jié)合的同時，也與固定的探針807通過堿基的相互配對而結(jié)合。這種結(jié)合信號被全反射產(chǎn)生的倏逝場806激發(fā)而被檢測到。即，在退火過程進行約一分鐘后，氬離子激光器706被打開，產(chǎn)生514納米的激光。激光通過一透鏡組707，整合成線狀后，通過棱鏡708，以大約75度的角度偶合進玻片709中，由于入射角大于折射臨界角(θc＝sin-1(1.34/1.52))，激光在玻片中產(chǎn)生多次的全反射，從而產(chǎn)生倏逝場。
有些探針分子因為目標(biāo)基因有相應(yīng)的拼接形式而與之雜交上807和808，倏逝場激發(fā)雜交上的目標(biāo)基因片段上的Cy3熒光基團805，使它產(chǎn)生552納米左右的發(fā)射波長804，此發(fā)射波長通過一中心波長550納米的濾鏡711后，被CCD(712)接收，通過CCD可檢測到各探針點位置上的熒光信號強度。陣列上各點的信號大小不一，對應(yīng)于目標(biāo)基因的各種拼接形式的濃度不一樣(圖9A)。隨著擴增反應(yīng)多個循環(huán)進行，陣列上各點的信號值隨之增大，當(dāng)某一點的信號值達(dá)到一域值，即擴增反應(yīng)開始時信號值的3倍，記錄這時的循環(huán)數(shù)Cti(i為探針編號)(圖9B)。根據(jù)各個探針的Cti可以定量目標(biāo)基因的各種選擇性拼接形式的相對拷貝數(shù)。由于每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，而且起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，因此，根據(jù)Ct值可以推算出目標(biāo)基因片段起始的相對拷貝數(shù)(圖9C)。
實施例2作為實施例2，對適用本發(fā)明的核酸檢測方法，以對所定組織中多種基因表達(dá)量的定量分析為例進行說明。
從要檢測的組織或細(xì)胞中分離純化mRNA后，以寡核苷酸T7-Oligo(dT)16為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶及相應(yīng)反應(yīng)緩沖液里，mRNA反轉(zhuǎn)錄成帶T7序列的cDNA。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA的3’端通過RNA連接酶與寡核苷酸T3序列相連形成cDNA摸板。
如圖10所示，在一塊約1mm厚的玻璃片或是透明塑料片1010表面的兩頭分別都刻蝕出一條約0.5mm寬的光柵908，光柵周期約700納米，深度約10-20納米。再在整個玻璃表面，包括光柵部分都鍍上一層約100-200納米厚的五氧化二鉭(Ta2O5)層1009，形成平面光波導(dǎo)層。在五氧化二鉭的表面通過靜電相互作用結(jié)合上一層多聚(L-賴氨酸)-接枝-聚乙二醇(PLL-g-PEG)的共聚合物，從而活化其表面(圖6B)。
為更詳細(xì)的說明此發(fā)明，通過圖10和圖8對本發(fā)明實施例方法及過程進行說明。如圖所示，根據(jù)各種要檢測基因的表達(dá)序列的特異性片段設(shè)計并合成相應(yīng)的探針片段(探針為cDNA片段，長度一般在200-2000bp不等。引物以下已指出，用T7和T3引物，其序列分別為T7，5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO16)；T3，5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’(SEQ ID NO17))。以與mRNA的3’端特異的cDNA探針為例。將cDNA探針1003，1004，807通過DNA陣列的方法，可以固定在結(jié)合有PLL-g-PEG共聚合物的五氧化二鉭(Ta2O5)平面光波導(dǎo)層1009，809表面(圖6B)，并在兩條光柵位置中間。固定探針的鍍有五氧化二鉭平面光波導(dǎo)層的玻璃片與一樣品槽1001密合形成反應(yīng)艙。將連接好的cDNA摸板與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液1002充滿整個反應(yīng)艙，反應(yīng)液包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的DNA聚合酶，如Taq酶，以及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，Cy5(801)標(biāo)記的T7，T3引物803，底物dNTP。整個反應(yīng)溫度受到一個加熱溫度控制平臺1005的控制，從而進行多個循環(huán)擴增，包括表達(dá)基因片段的反復(fù)變性(94℃)、退火(55℃)和反應(yīng)延伸(74℃)的過程，擴增產(chǎn)生的表達(dá)基因片段802因為Cy5標(biāo)記的引物而帶上了Cy5熒光基團801。
在退火反應(yīng)過程中，擴增的表達(dá)基因片段802與引物803結(jié)合的同時，也與固定的探針807通過堿基的相互配對而結(jié)合。這種結(jié)合信號被平面光波導(dǎo)產(chǎn)生的倏逝場806激發(fā)而被檢測到。即在反應(yīng)延伸(74℃)過程進行約三分鐘后，氦氖激光器906被打開，產(chǎn)生633納米的激光。激光通過一透鏡組1007，整合成線狀后，以約15度角照射到光柵1008，通過光柵后偶合進五氧化二鉭1009層，形成平面波導(dǎo)，并在五氧化二鉭表面產(chǎn)生的倏逝場。
有些cDNA探針分子因為目標(biāo)基因有較高表達(dá)而與之雜交上807，倏逝場激發(fā)雜交上的目標(biāo)基因片段上的Cy5熒光基團805，使它產(chǎn)生約665納米的發(fā)射波長804，此發(fā)射波長通過一670納米的濾鏡1011后，被CCD(912)接收，從而可檢測到各探針點位置上的熒光信號強度。陣列上各點的信號大小不一，對應(yīng)于表達(dá)基因的表達(dá)量的不一樣。隨著擴增反應(yīng)多個循環(huán)進行，陣列上各點的信號值隨之增大，當(dāng)某一點的信號值達(dá)到一域值，即擴增反應(yīng)開始時信號值的2倍，記錄這時的循環(huán)數(shù)Cti(i為探針編號)。根據(jù)各個探針的Cti而定量表達(dá)基因的表達(dá)量。
實施例3作為實施例3，對適用本發(fā)明的核酸檢測方法，以鑒定細(xì)菌種類和定量分析為例進行說明。
核酸序列分析是對細(xì)菌鑒定的常用方法。通常，通過分析細(xì)菌相對較保守的基因序列，如16S-rRNA，23S-rRNA，GyrB，rpoD等基因，而檢測鑒定細(xì)菌的屬種。以分析16S-rRNA基因序列為例。在16S-rRNA基因的兩個進化保守的區(qū)段，設(shè)計適當(dāng)引物，使其能對廣普的細(xì)菌進行擴增。再在兩個保守區(qū)段的中間易變區(qū)段設(shè)計出針對某種要檢測細(xì)菌的特異探針。
在此實例中，設(shè)計并合成如下細(xì)菌16S-rRNA的通用引物序列5′-羅丹明紅-X-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3′(M＝A+C)(SEQ ID NO7)5′-羅丹明紅-X-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3′(SEQ ID NO8)并針對以下七種病原體細(xì)菌合成專一性的DNA探針金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SH-C6-5’-CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG-3′-FITC(SEQ IDNO9)單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)SH-C6-5’-AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG-3′-FITC(SEQID NO10)大腸桿菌(Escherichia.Coli)SH-C6-5’-CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG-3′-FITC(SEQ ID NO11)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)SH-C6-5’-AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT-3′-FITC(SEQ IDNO12)腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)SH-C6-5’-GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG-3′-FITC(SEQ ID NO13)屎腸球菌(Enterococcus faecium)SH-C6-5’-CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA-3′-FITC(SEQ ID NO14)綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)SH-C6-5’-GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG-3′-FITC(SEQ ID NO15)為更詳細(xì)的說明此發(fā)明，通過圖11和圖12對本發(fā)明實施例方法及過程進行說明。如圖，將上述各種探針1101，1102，1204用FITC熒光基團1203，1206標(biāo)記上后，通過化學(xué)連接(如實施例1所述)固定在玻璃載體1103，1207表面，載體可以是金屬，陶瓷，聚合物材料等任何固體材料上。固定探針的玻璃與一樣品槽1105密合形成反應(yīng)艙。取待測樣品，進行基因組DNA的分離純化。將分離好的基因組DNA與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液1104加入并充滿整個反應(yīng)艙，反應(yīng)液包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的Taq DNA聚合酶，以及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，羅丹明紅-X熒光基團1211標(biāo)記的以上引物1209，dNTP底物。整個反應(yīng)溫度受到一個加熱溫度控制平臺1111的控制，從而進行多個循環(huán)擴增，包括目標(biāo)基因片段的反復(fù)變性(94℃)，退火(60℃)以及反應(yīng)延伸(74℃)的過程，擴增產(chǎn)生的目標(biāo)基因片段1210因為羅丹明紅-X標(biāo)記的引物而帶上了羅丹明紅-X熒光基團1211。
在退火過程中，目標(biāo)基因片段1205與固定的探針1204通過堿基之間的相互配對而結(jié)合。在退火過程進行約一分鐘后，氬離子激光器1108被打開，產(chǎn)生488納米的激光。激光通過一透鏡組1107，聚焦后照射在固體載體表面，同時，激光掃描整個探針固定的區(qū)域。樣品中含有的細(xì)菌的DNA分子1205被擴增標(biāo)記上羅丹明紅-X熒光基團后，與對應(yīng)的探針分子1204相結(jié)合。488納米的激光1201激發(fā)探針分子上的FITC基團1203而產(chǎn)生518納米的發(fā)射波長，它被結(jié)合上的擴增DNA上的羅丹明紅-X基團1202所吸收，羅丹明紅-X基團產(chǎn)生590納米的發(fā)射波長1208而呈紅色。如果在樣品中沒有的細(xì)菌，其相應(yīng)的探針分子1206不結(jié)合上有羅丹明紅-X基團的分子，被激發(fā)后，產(chǎn)生518納米的藍(lán)光1215。溶液中為雜交上的含有羅丹明紅-X基團1211的引物1209和被擴增1210的DNA分子不被激發(fā)。CCD(1110，1214)通過一中心波長為600納米的濾鏡1109，1213后被檢測成相，由于雜交上的探針分子1204發(fā)出的590納米的紅光1208能夠透過600納米的濾鏡1213，而沒被雜交上的探針分子1206發(fā)出的518納米的藍(lán)光1215，被散射的488納米的激光1212都不能透過。因此，CCD成像的各探針點位置上的信號強度，即為雜交上的DNA的量，其對應(yīng)于相應(yīng)的細(xì)菌DNA擴增的量(圖13A)。
隨著擴增反應(yīng)多個循環(huán)進行，陣列上各點的信號值隨之增大，當(dāng)某一點的信號值達(dá)到一域值，即擴增反應(yīng)開始時信號值的3倍，記錄這時的循環(huán)數(shù)Cti(i為探針編號)(圖13B)。根據(jù)各個探針的Cti而定量各種目標(biāo)檢測細(xì)菌基因的相對拷貝數(shù)。由于每種模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，而且起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，因此，根據(jù)Ct值可以推算出目標(biāo)基因片段起始的相對拷貝數(shù)(圖13C)。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作參考。
序列表<110>裴道彩<120>對多種核酸分子進行平行實時定量檢測的方法<130>061242<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1catcaagaca tacagtttgg gttag 25<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2cacagtccag tgtgagggga g 21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>3gtaccattgg ggctgctttt ctaa 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>4caacctctgc ctcatgggtt ca 22<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>5catgaatttc aagagagtac cattggg27<210>6<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>6ccttttcttt cagctgcttt tctaacc27<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7gaagagtttg atcmtggctc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8actgctgcct cccgtaggag20<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>9cggacgagaa gcttgcttct ctgatgttag cg 32<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>10aacggaggaa gagcttgctc ttccaaagtt agtgg 35<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>11caggaagcag cttgctgctt tgctgacg 28<210>12<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>12agaacgctga aggaggagct tgcttctctg gat 33<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>13gcagcacaga gaagcttgct tctcgggtg 29<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>14ctttttccac cggagcttgc tccaccggaa a 31<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>核酸探針<400>15gaagggagct tgctcctgga ttcagcgg 28<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>16taatacgact cactataggg20<210>17<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>17attaaccctc actaaag 1權(quán)利要求
1.一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用激發(fā)光源在固相載體與液體界面處產(chǎn)生倏逝場，使得與所述探針分子結(jié)合的所述擴增產(chǎn)物上的熒光基團被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號；g)檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體選自玻璃、尼龍膜、石英、陶瓷、金屬、塑料或有機聚合物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體上鍍有小于1000納米厚的金屬膜，或者直徑小于1000納米的金屬顆粒，其中所述金屬選自金、銀、銅。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述倏逝場是通過在所述固相載體內(nèi)發(fā)生的光的全反射，或者通過平面波導(dǎo)產(chǎn)生的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述平面波導(dǎo)為在所述固相載體上的金屬氧化物膜，所述金屬氧化物選自五氧化二鉭、二氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈮或氧化鉿。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟d)中，通過使用有熒光基團標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸、有熒光基團標(biāo)記的引物或其組合使擴增產(chǎn)物被熒光基團標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探針分子通過化學(xué)鍵連接、物理吸附、聚合物包埋、蝕刻或粘聯(lián)的方式固定在載體表面。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸擴增反應(yīng)包括核酸變性、退火、和增加特定多核苷酸鏈的步驟。
9.一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種核酸探針分子，所述核酸探針分子對所述樣品中的可能存在的待檢測核酸分子有特異性，所述核酸探針分子上連接有第一熒光基團；c)使所述核酸探針分子與所述樣品液相接觸；d)對所述樣品中的核酸分子進行擴增，在擴增反應(yīng)時，用第二熒光基團標(biāo)記擴增產(chǎn)物，其中所述第一熒光基團的發(fā)射譜與所述第二熒光基團的激發(fā)譜重疊，或所述第二熒光基團的發(fā)射譜與所述第一熒光基團的激發(fā)譜重疊；e)使所述擴增產(chǎn)物與所述核酸探針分子相互結(jié)合；f)用光激發(fā)所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；g)檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發(fā)射的熒光位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一熒光基團和第二熒光基團在相距1-10納米時，一個熒光基團能吸收另一熒光基團發(fā)射光的能量而被激發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明提供了平行對多種核酸分子進行檢測并實時定量分析的方法，該方法中采用光的全反射或是平面波導(dǎo)所引起的倏逝場激發(fā)，或是通過熒光共振能量轉(zhuǎn)換來激發(fā)熒光基團，而反應(yīng)溶液中大量未結(jié)合的目標(biāo)分子或是熒光基團幾乎不被激發(fā)。本發(fā)明的方法不需要多種熒光基團標(biāo)記，不需要多個反應(yīng)通道，因此成本低、檢測的目標(biāo)分子通量高。
文檔編號C12Q1/68GK101033485SQ200610024468
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者裴道彩 申請人:裴道彩