專利名稱：小鼠皮膚冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種質(zhì)資源保存、轉(zhuǎn)基因、低溫冷凍保存、組織工程等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核移植技術(shù)的誕生對轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)和滅絕品種的恢復(fù)以及資源保存帶來了新的希望。核移植技術(shù)需要兩個細(xì)胞體系的支持，一是來自受體卵巢組織的卵母細(xì)胞，另一是來自供體的胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞。目前科學(xué)家們已經(jīng)成功地能將活體采樣得來的胎兒和成年動物的體細(xì)胞在體外培養(yǎng)而卵母細(xì)胞的獲得常常受到母畜繁殖周期的制約，在臨床上會出現(xiàn)供與需時間不相一致的矛盾。目前卵巢組織和體細(xì)胞的冷凍保存已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在包括人、鼠、兔、羊、牛、豬、絨猴和大象等物種的臨床研究和動物育種中。通?？勺鳛槔鋬霰Ｗo(hù)劑應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)有二甲基亞砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、甲醇等。但它們對不同物種和不同細(xì)胞的適應(yīng)性差異較大。有關(guān)組織細(xì)胞對各類保護(hù)劑的耐受性和保存效果的研究僅見于人、牛卵巢組織和牛胎兒皮膚細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是研究一種針對小鼠的皮膚冷凍保存方法，以建立冷凍保存體細(xì)胞的新方法。
將小鼠皮膚組織置于冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
本發(fā)明可通過以下三種具體方法實現(xiàn)方法一冷凍前，先將小鼠皮膚組織在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min，然后，將小鼠皮膚組織置于含10％～30％的甘油(GLY)的冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法或液氮冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
方法二冷凍前，先將小鼠皮膚組織在環(huán)境溫度為22℃條件下平衡20～25min，然后，將小鼠皮膚組織置于含10％～30％的丙二醇(PROH)的冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法或液氮冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
方法三冷凍前，先將小鼠皮膚組織在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min，然后，將小鼠皮膚組織置于含10％～30％的二甲基亞砜(DMSO)的冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法或液氮冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
以上方法均可獲得對小鼠組織冷凍保存，解凍后，皮膚組織生長能力。本發(fā)明無需特殊的冷凍儀器要求，簡單容易操作，體細(xì)胞組織樣本的收集非常方便，適合于珍稀動物或珍貴細(xì)胞的長期保存。
為了降低冷凍劑對細(xì)胞的毒性以及對冷凍前細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，特設(shè)定冷凍前，分別在4℃和22℃環(huán)境溫度下，將小鼠皮膚組織置于冷凍保護(hù)劑中平衡。
為了使冷凍前細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到充分的平衡，上述平衡時間為20～25min。
另，甘油濃度為10％，或二甲基亞砜濃度為10％，或丙二醇濃度為20％時生長效果最好。
具體實施例方式
1、新鮮皮膚樣本的獲取脫臼法處死，切開腹部皮膚，使皮下組織暴露出來。收集皮下組織和皮膚底層組織，置于盛有預(yù)熱的無菌PBS的培養(yǎng)皿中，漂洗4～5次，剪成1mm3大小的組織塊。隨機(jī)挑取10～20塊新鮮組織塊，用EDTA-牛血漿貼附在25mm2培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上直接進(jìn)行培養(yǎng)作為對照，Hoechst染色鑒定細(xì)胞生長情況。
2、皮膚組織的毒性試驗在4℃和22℃兩個不同條件下分別置于三個梯度濃度(10％、20％、30％)的三種不同冷凍保護(hù)劑(二甲基亞砜DMSO、甘油GLY、丙二醇PROH)中。20～25min后，用預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液分別漂洗三次。EDTA-牛血漿貼附在25mm2培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上直接進(jìn)行培養(yǎng)，Hoechst染色鑒定細(xì)胞生長情況。
結(jié)果觀察到組織在22℃平衡條件下，生長率比在4℃平衡條件下均高。小鼠組織在4℃平衡條件下，在甘油GLY中的生長情況較二甲基亞砜DMSO、丙二醇PROH好，差異顯著(P＜0.05)。各濃度之間以10％GLY，20％PROH生長效果最好，與其他濃度之間差異顯著(P＜0.05)。但在22℃平衡條件下，在DMSO中的生長情況最好，各濃度之間以10％DMSO，20％PROH生長效果最好，其余保護(hù)液較差。
3、皮膚組織的冷凍和解凍冷凍及解凍的過程如下隨機(jī)取3～5塊皮膚組織塊放入到事先裝有0.5ml不同濃度不同保護(hù)液的冷凍管中，然后分成四組進(jìn)行處理。第一組在室溫下平衡20～25min，第二組未經(jīng)平衡作為對照。第三和第四組均在室溫下平衡20～25min。第三組經(jīng)平衡后在干冰上降溫并冷凍保存，而第四組則直接投入液氮中保存，之后撈取并保存在-80℃條件下。干冰降溫過程是將冷凍管放在干冰面上方支架上慢速降溫至培養(yǎng)液凍結(jié)后轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。經(jīng)過1～2周的低溫保存后，將冷凍管取出直接放到37℃的水浴中解凍1-1.5min。用含10％FCS的新鮮預(yù)熱的DMEM漂洗3次，去除冷凍保護(hù)劑。在經(jīng)過解凍后，將這些組織用EDTA-牛血漿貼附在25mm2培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上添加培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
4、冷凍后皮膚組織的培養(yǎng)小鼠皮膚組織培養(yǎng)液組成為含10％FCS、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇、1％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM。Hoechst染色鑒定細(xì)胞生長情況。
皮膚組織置培養(yǎng)瓶中，每天換新鮮的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
在培養(yǎng)11天內(nèi)，成年小鼠(120日齡以上)皮膚組織生長能力差，不易擴(kuò)展，生長率平均為25.0％，冷凍后的情況與此相似。然而，幼齡小鼠(45日齡以下)的皮膚組織的生長率為100％。組織的生長率受皮膚擴(kuò)展能力和來源的影響。小鼠的結(jié)締組織(85.7％)比皮膚底層(66.7％)更容易培養(yǎng)。同樣，幼齡小鼠皮膚(100％)比成年小鼠(25.0％)的生長率高。小鼠新鮮的皮膚組織(57.1％)比耳組織(25％)的生長率高。但是，組織長出細(xì)胞的能力和開始生長細(xì)胞的時間有個體差異。
結(jié)果顯示，對小鼠皮膚組織來說，所有組織解凍后開始生長的時間比新鮮組織晚3-4天。在分別用干冰和液氮降溫時，GLY和DMSO作為保護(hù)劑的生長率均比較高。但是，10％GLY的保護(hù)效果明顯好于其它組和對照組，生長率(干冰和液氮)分別為33.3％和19.4％，差異非常顯著(P＜0.01)。此外，用液氮降溫冷凍的組織，保存在30％GLY，20％PROH和30％PROH中的組織均未見有細(xì)胞生長。結(jié)果還顯示冷凍前在保護(hù)液中平衡25min和不平衡時，用GLY，DMSO和PROH保護(hù)的組織生長情況之間存在顯著差異(P＜0.01)。
本發(fā)明比較了二甲基亞砜(DMSO)、甘油(GLY)、丙二醇(PROH)三種不同冷凍保護(hù)劑以不同梯度濃度，采用干冰和液氮降溫對小鼠組織冷凍保存的效果。并將新鮮組織塊直接暴露在DMSO，GLY和PROH中進(jìn)行毒性試驗。用本方法保存結(jié)果證明，用干冰冷凍和10％GLY做保護(hù)劑對保存小鼠皮膚組織最有效。
權(quán)利要求
1.小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于將小鼠皮膚組織置于冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護(hù)液是濃度為10％～30％的甘油，冷凍前，先在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述甘油濃度為10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護(hù)液是濃度為10％～30％的丙二醇，冷凍前，先在環(huán)境溫度為22℃條件下平衡20～25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述丙二醇濃度為20％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護(hù)液是濃度為10％～30％的二甲基亞砜，冷凍前，先在環(huán)境溫度為22℃條件下平衡20～25min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述小鼠皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述二甲基亞砜濃度為10％。
全文摘要
小鼠皮膚冷凍保存方法，涉及種質(zhì)資源保存、轉(zhuǎn)基因、低溫冷凍保存、組織工程等領(lǐng)域。將小鼠皮膚組織置于冷凍保護(hù)液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護(hù)液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置－80℃的冷凍器中。通過本發(fā)明可獲得對小鼠組織冷凍保存，解凍后，皮膚組織生長能力。本發(fā)明無需特殊的冷凍儀器要求，簡單容易操作，體細(xì)胞組織樣本的收集非常方便，適合于珍稀動物或珍貴細(xì)胞的長期保存。
文檔編號C12N5/06GK1821392SQ20061003861
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者李碧春 申請人:揚州大學(xué)