專利名稱：一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)。
二、技術(shù)背景不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，俗稱青菜、小白菜、油菜(北方)，系我國原產(chǎn)，占長江中下游各大、中城市蔬菜總復(fù)種面積的30～40％，并具有營養(yǎng)豐富、生長快速、適應(yīng)性廣、成本低等特點。近年來，北方地區(qū)種植面積增長迅速，日、美及歐洲一些國家也廣泛引種栽培。栽培品種中雜交一代的比重逐年增加，而游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以為雜優(yōu)育鐘快速提供純系(DH系)親本材料，同時，得到的DH群體可以成為共享的永久遺傳作圖群體。
小孢子是高等植物生活史中雄配子發(fā)育進程中的短暫而重要的階段，游離小孢子培養(yǎng)是在單細胞水平上獲得純系的培養(yǎng)方法。在蕓薹屬作物中，德國人Lichter(1982)首次從甘藍型油菜上成功進行游離小孢子培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)其胚胎誘導(dǎo)率及再生植株產(chǎn)量遠高于花藥培養(yǎng)。1989年，日本學(xué)者Sato首次獲得大白菜游離小孢子培養(yǎng)的再生植株。我國這方面的研究起步較晚，但隨著研究的深入，近年來，已開始利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行雙單倍體育種。栗根義等(1993)對大白菜游離小孢子培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)進行了研究，建立了較完善的技術(shù)體系，并利用該技術(shù)育成大白菜、甘藍、花椰菜系列新品種；曹鳴慶(1992)首次報道不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)獲得成功，盧鋼(2001)報道不結(jié)球白菜和蕪菁雜種小孢子培養(yǎng)獲得成功；但都沒有對不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行系統(tǒng)研究，培養(yǎng)效率低。為實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)雙單倍體(DH)純系，使這一新技術(shù)能成功應(yīng)用于育種實踐，尤其為構(gòu)建遺傳圖譜而建立雙單倍體(DH)群體，是不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的最主要目標。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中不結(jié)球白菜游離小孢子存在的培養(yǎng)效率低問題，提供一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，獲得了雙單倍體純系。
技術(shù)方案本發(fā)明一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，包括從取材、消毒、接種、高溫誘導(dǎo)、暗培養(yǎng)、植株再生與繼代培養(yǎng)、移栽、加倍等，到獲得雙單倍體純系。
取材選取無病害的供植體上2～3mm長的花蕾，外觀特征為花瓣、花藥長度比為1/2～4/5，鏡檢此時小孢子處于單核靠邊期，為培養(yǎng)的最佳時期，將花蕾保濕置于4℃冰箱中保存待用；消毒用75％的酒精消毒30s，然后用0.1％的HgCl2消毒5min，最后用無菌水沖洗3次待用；接種把消毒后的花蕾置于10ml離心管中加入B5液體培養(yǎng)基3～5ml用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，用400目慮網(wǎng)過濾，然后800rpm離心5min，棄上清，重復(fù)3次，最后加入含有質(zhì)量比13％蔗糖的NLN培養(yǎng)基，把小孢子分裝于培養(yǎng)皿中，密度1×105-6個/ml；高溫誘導(dǎo)將接種后的小孢子立即置于35℃高溫下黑暗處理24～48h；暗培養(yǎng)將高溫處理后的小孢子置于25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，15～20d后可以看到有胚狀體出現(xiàn)；植株再生與繼代培養(yǎng)胚狀體生長15d以后，挑選生長較好的子葉型胚及時轉(zhuǎn)于生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)(生長較慢的小胚及畸形胚可以轉(zhuǎn)入新的含有質(zhì)量比13％蔗糖的NLN培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng))，25d以后，轉(zhuǎn)于生根培養(yǎng)基中生根；移栽試管苗生根較好時，選擇天氣涼爽的秋季移栽于營養(yǎng)缽中，經(jīng)過煉苗以后，可以定植于大田；加倍可以采用在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量比濃度為0.1％的秋水仙素處理加倍，也可以采用質(zhì)量比濃度為0.1％的秋水仙素在移栽時浸泡幼根處理加倍。
有益效果本發(fā)明提供了一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)的小孢子獲得了雙單倍體純系。
用本發(fā)明的游離小孢子培養(yǎng)(IMC)技術(shù)創(chuàng)造新純系(1～2年)可代替?zhèn)鹘y(tǒng)多代自交(6～8年)方法，加速育種進程，育種周期縮短1/2(原10～12年，現(xiàn)5～7年)；獲得的純系是經(jīng)過單倍體加倍而得來的，在理論上是100％純合的；比花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)效率提高5～10倍；誘導(dǎo)基因型成功率68.5％，平均每花蕾誘導(dǎo)胚4～10個，最高可達92個以上。
具體實施例方式
實施例1 不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，包括1.基因型烏塌菜(N32)、暑綠(N20)、黃幫(N30)，分別來自湖北、江蘇和遼寧，其中烏塌菜是常規(guī)種，暑綠和黃幫是雜交種，均可在市場買到。
2.取材2004年4月5、20號2次選取長度為2～3mm的花蕾，將花蕾用保濕置于4℃冰箱中保存。
3.消毒用75％的酒精消毒30s，然后用0.1％的升汞消毒5min，最后用無菌水沖洗3次待用。
4.接種把消毒后的花蕾置于10ml離心管中，加入B5液體培養(yǎng)基5ml用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，用400目慮網(wǎng)過濾，然后800rpm離心5min，棄上清，重復(fù)3次。最后加入含有質(zhì)量比為13％蔗糖的NLN液體培養(yǎng)基，把含小孢子的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿中。
5.高溫誘導(dǎo)接種以后立即置于35℃高溫下黑暗處理24h。
6.暗培養(yǎng)高溫處理后置于25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，15～20d后可以看到有胚狀體出現(xiàn)，30d以后統(tǒng)計出胚數(shù)。
7.植株再生與繼代培養(yǎng)胚狀體生長15d以后，挑選生長較好的子葉型胚及時轉(zhuǎn)于生芽培養(yǎng)基(B5+0.2mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA)、中培養(yǎng)(生長較慢的小胚及畸形胚轉(zhuǎn)入新的含有質(zhì)量比為13％蔗糖的NLN培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng))，25d以后，轉(zhuǎn)于生根培養(yǎng)基(B5+0.02mg/L NAA)中生根；8.移栽試管苗生根較好時，9月15、25號分兩次移栽于營養(yǎng)缽中，煉苗10d以后，定植于大田；9.染色體加倍采用上述繼代過程中在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量比濃度0.1％的秋水仙素處理加倍，或者在移栽時浸泡幼根處理加倍。
實施結(jié)果如下
1.胚誘導(dǎo)率表1結(jié)果表明，3個基因型均能誘導(dǎo)出胚，不同基因型的胚誘導(dǎo)率差異顯著，暑綠(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)對外提供)平均每花蕾誘導(dǎo)出的胚數(shù)為4.4個，黃幫(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)對外提供)可達75.5個，烏塌菜(南方地方品種)為27.1個。
表1 三種基因型出胚情況

2.胚狀體成苗情況從表2可以看出，不同基因型胚狀體成苗率不同，其中N20和N32差異不大，分別為26.8％和26.4％，但是與N30的差異顯著，N30的胚狀體成苗率達到53.2％。
表2 三種基因型胚狀體成苗情況

實施例2 不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，基因型、取材、消毒、接種、高溫誘導(dǎo)、暗培養(yǎng)、植株再生與繼代培養(yǎng)、移栽同實施例1，采用質(zhì)量比濃度為0.1％的秋水仙素浸泡灌根處理8h使得染色體加倍，從表3可以看出，不同基因型單倍體試管苗加倍率亦不相同，其中N20與N32加倍率差異不大，分別為64.4％和59.5，而N30的加倍率為32.9％，與前兩者差異顯著。
表3 三種基因型單倍體試管苗加倍情況

權(quán)利要求
1.一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，包括取材選取處于單核晚期至雙核早期的干凈無污染花蕾，將花蕾保濕置于4℃冰箱中保存；消毒選取花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用質(zhì)量比為0.1％的HgCl2消毒5min，最后用無菌水沖洗3次待用；接種把消毒后的花蕾置于離心管中加入B5液體培養(yǎng)基用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，用400目慮網(wǎng)過濾，然后800rpm離心5min，棄上清，重復(fù)3次，最后加入NLN液體培養(yǎng)基，使小孢子密度達到1×105-6個/ml，獲得小孢子懸浮液；高溫誘導(dǎo)把小孢子懸浮液分裝于培養(yǎng)皿中，立即置于35℃高溫下黑暗處理24～48h；暗培養(yǎng)將上述高溫誘導(dǎo)處理后的小孢子懸浮液置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，15～20d后可以看到有胚狀體出現(xiàn)；植株再生與繼代培養(yǎng)胚狀體生長15d以后，挑選子葉型胚轉(zhuǎn)于生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，25d以后，轉(zhuǎn)于生根培養(yǎng)基中生根；移栽生根的試管苗移栽于營養(yǎng)缽中練苗，經(jīng)過練苗以后，定植于大田；染色體加倍采用在上述生芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量比濃度為0.1％的秋水仙素處理使得染色體加倍，或者在移栽時采用質(zhì)量比濃度為0.1％的秋水仙素浸泡幼根處理8h使得染色體加倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于，接種所用NLN液體培養(yǎng)基含有質(zhì)量比為13％的蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)。包括取材、消毒，接種小孢子密度為1×10
文檔編號C12N5/04GK1869202SQ20061004051
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者侯喜林, 耿建峰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)