專利名稱：一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高植物賴氨酸含量的方法及其專用載體，特別是涉及一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
必需氨基酸，是指人體自身不能合成或合成速度不能滿足人體需要，必須從食物中攝取的氨基酸。賴氨酸是八種必需氨基酸之一，被稱為“第一必需氨基酸”，是蛋白質(zhì)的重要組成部分。賴氨酸在生物機體的代謝中具有重要作用，賴氨酸缺乏會引起蛋白質(zhì)功能障礙，影響生物的生長發(fā)育。賴氨酸具有旋光性，生物體只能利用左旋體(L型)賴氨酸。
中國人的飲食結(jié)構(gòu)以谷物為主，攝入的蛋白質(zhì)也主要來源于谷類。但植物性蛋白中的賴氨酸含量普遍偏低，如每百克大米中的賴氨酸含量僅相當于牛肉的1/5，大豆的1/10；食用精米中的蛋白質(zhì)平均含量僅為6.3-7.1％，是谷類作物中最低的，其賴氨酸含量僅為總質(zhì)量的0.22-0.28％，是列于第一位的限制性氨基酸(Juliano BO，Gu C.Rice and Human Nutrition.BeijingChina Agricultural University Press，1995.31-40)。因此，提高水稻種子中的賴氨酸含量，可以大大改善水稻的營養(yǎng)品質(zhì)，從而帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益(王為民，趙倩等.水稻轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白質(zhì)基因(sb401)植株的獲得及種子中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量分析.作物學(xué)報，2005.31(5)603-607)。
利用傳統(tǒng)的水稻育種技術(shù)進行水稻的品種改良，雖可大幅提高水稻的產(chǎn)量，但其周期長，且難以解決諸如稻米中氨基酸營養(yǎng)組分不均衡和維生素A缺乏等問題。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣應(yīng)用，大大縮短了作物品質(zhì)改良的周期，而且通過導(dǎo)入多個優(yōu)良性狀基因，可使同一作物的多個性狀得到改良。
高等植物的賴氨酸合成代謝途徑和細菌、酵母相似，都是由天冬氨酸經(jīng)過一些天冬氨酸家族的不同代謝途徑合成的。植物中的賴氨酸分解代謝途徑示意圖如圖1A所示(α-AASAα-氨基脂肪半醛(α-amino adipic semialdehyde)；AAT天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Asp aminotransferase)；AS天冬氨酸合成酶(Asp synthase)；3-ASA3-天冬氨酸脂肪半醛(3-aspartic semialdehyde；)；ASN天冬酰胺酶(Asparaginase)；AK天冬氨酸激酶(Asp kinase)；CGS胱硫醚合酶(cystathionine γ-synthase)；GOGAT谷氨酸合成酶(Glu synthase)；HSD高絲氨酸脫氫酶(homoserinedehydrogenase))，在此合成途徑中有兩個受反饋抑制調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，即天冬氨酸激酶(Asp kinase，AK)和二氫吡啶羧酸合酶，其中，天冬氨酸激酶受蘇氨酸和賴氨酸反饋抑制，而且賴氨酸又是二氫吡啶羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)的反饋調(diào)節(jié)抑制因子(Zhu XH and Gad Galili.Increased Lysine Synthesis Coupledwith a Knockout of Its Catabolism Synergisticaily Boosts Lysine Content andAlso Transregulates the Metabolism of Other Amino Acids in Arabidopsis Seeds.Plant Cell，2003.15845-853)。遺傳學(xué)和分子學(xué)方面的研究證明，賴氨酸在植物體內(nèi)合成的主要限速步驟是賴氨酸對DHPS的反饋抑制，因此，在提高賴氨酸合成關(guān)鍵酶表達量的同時去除賴氨酸對DHPS的抑制，將有助于提高賴氨酸的含量。此外，細菌中的DHPS酶對反饋抑制不敏感，因此在植物中特異表達細菌的DHPS基因可以提高賴氨酸含量(Karchi，H.，Shaul，O.，and Galili，G.(1994).Lysine synthesisand catabolism are coordinately regulated during tobacco seed development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，2577-2581；Falco，S.C.，Guida，T.，Locke，M.，Mauvais，J.，Sandres，C.，Ward，R.T.，and Webber，P.(1995).Transgenic canolaand soybean seeds with increased lysine.Bio/Technology 13，577-582)。
高等植物和細菌、酵母賴氨酸代謝途徑的不同之處在于賴氨酸的分解代謝。在高等植物及動物中，賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(Lys ketoglutaratereductase/saccharopine dehydrogenase，LKR/SDH)催化分解賴氨酸為α-氨基脂肪酸和谷氨酸。LKR和SDH連接成為一個雙功能多肽，LKR首先將賴氨酸和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為酵母氨酸，SDH又將酵母氨酸轉(zhuǎn)化為α-氨基半醛(α-aminoadipicsemi-aldehyde)和谷氨酸。α-氨基半醛在以后的代謝中又被轉(zhuǎn)化為乙酰CoA和谷氨酸分子。然而在酵母、真菌和細菌中，LKR和SDH酶是兩個不同的多肽(酵母中的賴氨酸分解代謝途徑示意圖如圖1B所示)。植物中賴氨酸分解代謝途徑的意義還不完全清楚，但是一些研究提供的間接證據(jù)表明這條途徑對于種子發(fā)育過程中賴氨酸在體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)起到了作用。尤其是在植物的種子中，賴氨酸含量提高的同時，也會增加賴氨酸分解關(guān)鍵酶LKR/SDH的活性，致使賴氨酸在種子中不能得到有效積累(Zhu XH，Tang GL.Fabienne Granier.A T-DNA Insertion Knockout of the BifunctionalLysine-Ketoglutarate Reductase/Saccharopine DehydrogenaseGene ElevatesLysine Levels in Arabidopsis Seeds.Plant Physiol.，2001.1261539-1545)。
研究人員已對植物種子中的賴氨酸代謝進行了一些相關(guān)研究。如在轉(zhuǎn)基因煙草中組成型表達對賴氨酸反饋抑制不敏感的細菌DHPS基因，結(jié)果營養(yǎng)器官中游離賴氨酸的含量顯著提高，但是種子中卻沒有提高(Shaul O，Galili G.Increased lysinesynthesis in transgenic tobacco plants expressing a bacterialdihydrodipicolinate synthase in their chloroplasts.Plant J，1992.2203-209；Shaul O，Galili G.Concerted regulation of lysine and threonine synthesis intobacco plants expressing bacterial feedback-insensitive aspartate kinase anddihydrodipicolinate synthase.Plant Mol Biol，1993.23759-768)，同時還發(fā)現(xiàn)在上述轉(zhuǎn)基因植株的種子中，具有賴氨酸依賴性的LKR/SDH的活性也隨之顯著增強，表明在種子中存在誘導(dǎo)性的賴氨酸分解代謝途徑，其可能的作用是在種子發(fā)育過程避免過多的賴氨酸積累(Zhu XH，Tang GL，F(xiàn)abienne Granier.A T-DNA InsertionKnockout of the Bifunctional Lysine-Ketoglutarate Reductase/SaccharopineDehydrogenaseGene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds.PlantPhysiol.，2001.1261539-1545)。但是，同轉(zhuǎn)基因煙草相比，在轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和油菜種子的發(fā)育和發(fā)芽過程中，游離的賴氨酸沒有受到分解代謝較大影響而得到積累，而且，賴氨酸的分解產(chǎn)物也有過量積累(Falco SC，Guida T，Locke M，MauvaisJ，Sandres C，Ward RT，Webber P Transgenic canola and soybean seeds withincreased lysine.Biotechnol.1995.13577-582；Mazur B，Krebbers E，TingeyS.Gene discovery and product development for grain quality traits.Science，1999.285372-375)。另外，敲除LKR基因的擬南芥突變體的生長不受影響，而且賴氨酸也可得到一定程度的積累，表明賴氨酸分解代謝對于植物的正常生長和種子發(fā)育不是必須的，只是一系列調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個，而不是一個特定的阻止賴氨酸提高而造成潛在毒性的調(diào)節(jié)方式(Zhu XH，Tang GL，F(xiàn)abienne Granier.A T-DNA InsertionKnockout of the Bifunctional Lysine-Ketoglutarate Reductase/SaccharopineDehydrogenaseGene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds.PlantPhysiol.，2001.1261539-1545)。
由于稻米的蛋白質(zhì)含量主要受遺傳基因控制，因此利用基因工程將自然界植物體內(nèi)分子量較小、而且富含賴氨酸的蛋白質(zhì)基因?qū)胨?，是一條提高稻米賴氨酸含量的途徑(王為民，趙倩等.水稻轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白質(zhì)基因(sb401)植株的獲得及種子中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量分析.作物學(xué)報，2005.31(5)603-607)。這種方法在水稻和玉米中已有成功運用的先例，如1993年，劉博林從云南四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)種子中篩選出高賴氨酸植物品種，從中純化出一種賴氨酸含量為11％的蛋白質(zhì)，且富含蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等必需氨基酸，并獲得了此編碼高賴氨酸蛋白質(zhì)的cDNA克隆及其序列(Liu BL，Jing YX，Kuang TY.Screening oflysine-rich plant species and identification of the purified proteins.ActaBot Sin，1993.35(1)22-25)。1995年，Zheng等將菜豆種子蛋白質(zhì)基因?qū)胨局斜磉_，使得轉(zhuǎn)基因水稻種子總蛋白含量增加4％，賴氨酸含量也有所提高(ZhengZ，Kazuhiko S，Kunisuke T.The bean seed storage protein β-phaseolin issynthesized，processed and accumulated in the vacuolartype-II protein bodiesof transgenic rice endosperm.Plant Physiol，1995.109777-786)。1996年，Moom等在體外對谷蛋白基因進行修飾，插入合成甲硫氨酸、賴氨酸的序列，將修飾過的基因?qū)胨竞?，也可以提高賴氨酸的含?Moon E，Wu R.Genetic modification of arice glutelin cDNA and expression of the engi-neered glutelin gene intransgenic rice plant.InKhush GS eds.Rice Genetics IIIProc 3rdIntern RiceGenet Symp.IRRI，Philippines，1994.814-816)。1999年，張秀君將馬鈴薯花粉特異水溶性蛋白的cDNA導(dǎo)入玉米，獲得了賴氨酸含量提高10％以上的轉(zhuǎn)基因玉米(ZhangXJ，Liu JQ，Zhao Q，Yu JJ，Ao GM.Transfer of high lysine-rich gene into maizeby microprojecile bombardment and detection of transgenic plants.J AgricBiotech，1999.7(4)363-367)。2005年，王逸群等分別將從四棱豆中克隆出來的富含賴氨酸蛋白的基因?qū)霟煵莺凸榷拑捎盟局?，分別獲得了蛋白質(zhì)品質(zhì)得到改良的煙草和水稻(王逸群，鄭金貴等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)將高賴氨酸蛋白基因?qū)牍榷拑捎盟?Chin J Appl Environ Biol，2005，11(3)276-278；王逸群，鄭金貴等.轉(zhuǎn)基因煙草中賴氨酸含量的提高.Chin J Appl Environ Biol，2005.11(1)32-35)。上述提高植物賴氨酸含量的方法的局限性是不能得到游離的賴氨酸，而游離的氨基酸易于被人體吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用載體。
本發(fā)明所提供的專用載體，是含有水稻種子特異啟動子，細菌二氫吡啶羧酸合酶基因(DHPS)和水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因(OsLKR/SDH)干擾RNA編碼序列的植物表達載體；所述二氫吡啶羧酸合酶基因位于水稻種子特異啟動子下游，水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列位于組成型表達啟動子下游。
上述載體中的水稻種子特異啟動子可為水稻胚乳特異性啟動子GluA-3；組成型表達啟動子的選擇是多種多樣的，如CaMV35S啟動子、Actin啟動子或Ubiquitin等。
細菌二氫吡啶羧酸合酶基因可為大腸桿菌的二氫吡啶羧酸合酶基因。
水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列的正義鏈(不做模板的DNA鏈)可具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中序列1由300個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pHOS(購于Invitrogen公司，原名為GatewayTWvector pH2GW7載體，此處簡稱為pHOS)、pHDR1(植物RNAi表達載體，購于Invitrogen公司，原名為GatewayTWvector pH7GW1WG2(I)載體，此處簡稱為pHDR1)、pCAMBIA系列載體(購于CAMBIA公司)或其它衍生植物表達載體。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。
以pHOS為出發(fā)載體，構(gòu)建的植物表達載體為cDHPS-pHOS和RiLKR×sDHPS-pHOS。
以pHDR1為出發(fā)載體，構(gòu)建的植物表達載體為RiLKR-pHDR1。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法。
本發(fā)明所提供的方法，是將上述專用載體導(dǎo)入水稻組織或細胞，得到種子中游離賴氨酸含量得到提高的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。
本發(fā)明提供了一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法及其專用載體。該方法從水稻的賴氨酸代謝途徑出發(fā)，采用如下技術(shù)路線(見圖11)在水稻種子中特異性表達對賴氨酸反饋抑制不敏感的細菌DHPS基因，同時干擾抑制水稻賴氨酸分解關(guān)鍵酶OsLKR/SDH。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻?，將DHPS在種子中過量表達且OsLKR/SDH獲得干擾的轉(zhuǎn)基因株系中，葉片中的游離賴氨酸含量和野生型相比并沒有明顯提高，而種子中的游離賴氨酸含量提高了18倍；此外，轉(zhuǎn)入的外源基因?qū)λ镜纳L發(fā)育沒有任何影響?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明的方法及其專用載體將在水稻種子賴氨酸含量的提高中發(fā)揮巨大作用，并為水稻及其它植物的品種改良提供了一條新的途徑。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1A為植物中的賴氨酸分解代謝途徑示意1B為酵母中的賴氨酸分解代謝途徑示意2為用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用載體RiLKR×sDHPS-pHOS的構(gòu)建示意3為載體cDHPS-pHOS，RiLKR-pHDR1及RiLKR×sDHPS-pHOS的結(jié)構(gòu)示意4為水稻中的KLR/SDH同源基因在野生型水稻組織中表達特異性的RT-PCR半定量檢測結(jié)果圖5為cDHPS T0代轉(zhuǎn)基因水稻及野生型水稻葉片中的游離賴氨酸含量測定結(jié)果圖6為RiLKR/sDHPS T1代轉(zhuǎn)基因水稻及野生型水稻葉片中游離賴氨酸平均含量比較的直觀7為cDHPS T1代轉(zhuǎn)基因水稻及野生型水稻種子中游離賴氨酸平均含量比較的直觀8為野生型水稻和RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子中游離賴氨酸含量的HPLC檢測峰9為RiLKR/sDHPS T1代轉(zhuǎn)基因水稻及野生型水稻種子中游離賴氨酸平均含量比較的直觀10為野生型和三種轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子外觀的比較結(jié)果圖11為提高水稻種子中賴氨酸含量的技術(shù)路線簡圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由英俊和賽百盛合成。
試劑及儀器一般生化試劑購于北京化學(xué)試劑公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和膠回收試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒購于TIANGEN BIOTECH公司；限制性內(nèi)切酶購于TAKARA公司。層析儀型號為BioLogic DuoFlow Chromatography System，購自BioRad公司。C18反向柱采用Develosil Packed Column(φ4.6×250mm)，購自Develosil公司。
實施例1、用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建現(xiàn)參照圖2，構(gòu)建用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用植物轉(zhuǎn)化載體，具體過程包括以下步驟一、構(gòu)建賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因-二氫吡啶羧酸合酶基因DHPS的植物轉(zhuǎn)化載體根據(jù)大腸桿菌二氫吡啶羧酸合酶基因DHPS的cDNA序列(GenBank號為M12844序列表中的序列2)設(shè)計一對引物，引物序列如下P1(上游引物)5’-CACCCCAGGCGACTGTCTTCAATATTAC-3P2(下游引物)5’-GGCGCGACTTTTGAACAGAGTA-3’
提取大腸桿菌DH5α的基因組DNA并以此為模板，在引物P1和P2的引導(dǎo)下，PCR擴增DHPS基因的cDNA序列，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約900bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓撃康钠?，將其克隆到中間載體pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司)中，克隆體系和反應(yīng)條件為PCR產(chǎn)物2.3ul、pENTR/D-TOPO 0.25ul、Salt solution 0.45ul，室溫5min，冰浴5min。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析，獲得含有正確序列的二氫吡啶羧酸合酶基因DHPS的載體，命名為pDHPS-TOPO。再通過LR交換反應(yīng)將DHPS基因轉(zhuǎn)入植物表達載體pHOS(來源于Invitrogen公司的GatewayTWvector pH2GW7載體，此處簡稱為pHOS)，LR交換反應(yīng)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為LR buffer 2ul、pDHPS-TOPO 1ul(100-300ng)、pHOS 1ul(150～300ng)、LR Clonase Enzyme mix 1ul、ddH2O 5ul，25℃反應(yīng)1-3小時。將交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并抽提質(zhì)粒，進行測序，測序結(jié)果表明得到了插入序列正確的二氫吡啶羧酸合酶基因DHPS的植物轉(zhuǎn)化載體，命名為cDHPS-pHOS，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖3中的圖A，該載體含有煙草花葉病毒35S組成型表達啟動子(CaMV35S)啟動子。
二、構(gòu)建賴氨酸分解關(guān)鍵酶基因-賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因LKR/SDH的抑制表達載體在水稻基因數(shù)據(jù)庫中搜尋擬南芥LKR的同源序列(GenBank號為NM 119469)，然后通過與擬南芥、大豆和牽?；ǖ腖KR/SDH的序列比對找到它們之間的同源保守區(qū)，即LKR/SDH的保守區(qū)，具有序列表中序列1的核苷酸序列。提取水稻品種中花11號的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物P3(5’-CACCGGGAAAAGATTGCTTGCATT-3’)和P4(5’-AACAAAGCTATGGGGCAGTAAC-3’)的引導(dǎo)下，PCR擴增LKR/SDH保守區(qū)的cDNA序列，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)PCR擴增獲得了長度約300bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓撃康钠?，將其克隆到中間載體pENTR/D-TOPO中，進行測序，測序結(jié)果表明得到了插入序列正確的LKR/SDH的TOPO中間載體，命名為pLKR/SDH-TOPO，再通過與步驟一相同的LR交換反應(yīng)分別轉(zhuǎn)入植物RNAi表達載體pHDR1(購于Invitrogen公司，原名為GatewayTWvector pH7GW1WG2(I)載體，此處簡稱為pHDR1)中的兩個互為反向的attR1/attR2和attR2/attR1位點之間，將交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并抽提質(zhì)粒，進行測序，測序結(jié)果表明得到了插入序列正確的LKR/SDH的抑制表達載體，命名為RiLKR-pHDR1，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖3中的圖B。pHDR1表達載體的啟動子后面是兩個互為反向的克隆重組位點，中間間隔一段內(nèi)含子序列。通過LR交換反應(yīng)將水稻LKR/SDH的保守序列同時克隆到此載體的兩個重組位點，所轉(zhuǎn)錄出的RNA會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而對水稻中LKR/SDH的表達產(chǎn)生干擾，使LKR/SDH得到抑制。
三、用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用植物轉(zhuǎn)化載體的獲得用限制性內(nèi)切酶Sac I和Spe I對步驟一構(gòu)建的載體cDHPS-pHOS進行雙酶切，將載體中的CaMV35S切除，連入5’端添加有限制性內(nèi)切酶Apa I識別位點的水稻胚乳特異性啟動子GluA-3(Toshihiro Yoshihara a，b，Haruhiko Washida a，c，F(xiàn)umio Takaiwa.A 45-bp proximal region containing AACA and GCN4 motif is sufficient to conferendosperm-specific expression of the rice storage protein glutelin gene，GluA-3.Yoshihara et al./FEBS Letters，1996.383213-218)，得到載體sDHPS-pHOS。然后用限制性內(nèi)切酶Sac I和Apa I分別對連接有GluA-3的載體sDHPS-pHOS和步驟二構(gòu)建的LKR/SDH抑制表達載體RiLKR-pHDR1進行雙酶切，將兩種雙酶切產(chǎn)物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收約3100bp的RiLKR-pHDR1表達區(qū)片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的具有GluA-3啟動子的sDHPS-pHOS載體片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并抽提質(zhì)粒，進行測序，測序結(jié)果表明得到了插入序列正確的用于提高水稻種子中賴氨酸含量的專用植物轉(zhuǎn)化載體，命名為RiLKR×sDHPS-pHOS，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖3中的圖C(P-osLKR/SDH(Re)LKR/SDH基因保守區(qū)反向序列(Part of osLKR/SDH reverse sequence)；p-osKLRLKR/SDH基因保守區(qū)序列(part of osLKR/SDH sequence)；T35S，35S終止子(35s terminator)；attRLR重組交換反應(yīng)臂；DHPS二氫吡啶羧酸合酶基因(dihydrodipicolinatesynthase gene)；HygHygromysin gene)。
實施例2、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及檢測一、檢測水稻LKR/SDH在水稻組織中的表達情況據(jù)報道，多數(shù)植物的LKR/SDH在種子中特異性表達，而且其表達是受賴氨酸含量的提高而激活的，從而使植物種子中的賴氨酸含量達到一種平衡。為驗證實施例1獲得的LKR/SDH的水稻同源基因(命名為OsLKR/SDH)的表達特性，現(xiàn)分別提取野生型水稻幼胚、種子、愈傷、根、花和葉片的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，在引物P3和P4的引導(dǎo)下進行半定量RT-PCR檢測，以Actin為參照，檢測結(jié)果如圖4所示，該基因在野生型水稻的種子和愈傷組織中有較高的表達量，在葉片和花中有少量表達，而在根和胚中微量表達。
二、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將實施例1中構(gòu)建的三種載體cDHPS-pHOS、RiLKR-pHDR1和RiLKR×sDHPS-pHOS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGLO，篩選陽性重組子，然后將分別轉(zhuǎn)化有上述三種外源質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液與水稻中花11的愈傷組織共培養(yǎng)，經(jīng)過篩選、分化(具體方法參見文獻Tian WZ，Iann R，Elunialai S，Claude F，Roger NB.Improvement of plan tregeneration frequency vitro in indica rice.Acta Genet Sin，1994.21(3)215-221；JQ，Wei ZM，An HL，Xu SP，Zhang B.High efficiency ofgenetictransformation of rice using.Agrobncterium mediated procedure.ActaBot Sin，2000.42(11)1172-1178)，得到轉(zhuǎn)基因水稻幼苗，將cDHPS-pHOS轉(zhuǎn)基因植株命名為cDHPS(constitutive expressing DHPS plant)，RiLKR-pHDR轉(zhuǎn)基因植株命名為RiLKR(RNA interfere expressing of LKR/SDH plant)，RiLKR×sDHPS-pHOS轉(zhuǎn)基因植株命名為RiLKR/sDHPS(RNA interfere expressing of LKR/SDH andseed-specific expressing DHPS plant)。經(jīng)溫室土壤栽培約30-40天后，送至海南863基地培養(yǎng)，收獲轉(zhuǎn)基因水稻種子。
三、轉(zhuǎn)基因水稻的游離賴氨酸含量檢測1、轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的游離賴氨酸含量檢測1)cDHPS轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株葉片中的游離賴氨酸含量檢測參照《生物化學(xué)實驗操作指南》，用茚三酮測定法檢測cDHPS轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株葉片中的游離賴氨酸含量。先隨機抽取分屬于10個轉(zhuǎn)基因陽性株系的植株和2個野生型植株(對照，wt)，每個植株取2份樣品進行檢測，其中游離賴氨酸的提取方法包括以下步驟a)脫脂將材料研磨成粉后，加入60-90℃的石油醚浸泡8小時，浸泡過程中不斷攪動，然后用石油醚淋洗沉淀3次，干燥粉末；b)取脫脂后的葉片粉末0.05g，加入無水乙醇500μl，超聲提取半小時；c)8000g離心5分鐘，收集上清，將殘渣用500μl無水乙醇再提取一次；d)合并兩次提取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀(或60℃水浴)蒸干；e)蒸干產(chǎn)物用200μ1的0.1M pH10.4的硼酸鹽緩沖液溶解。將相同株系的游離賴氨酸含量測定結(jié)果取平均值，結(jié)果如表1所示，然后對各株系葉片中的游離賴氨酸含量進行比較，比較結(jié)果如圖5所示，上述結(jié)果表明cDHPS轉(zhuǎn)基因植株葉片中的游離賴氨酸含量相對于野生型植株明顯提高，含量最高可達野生型的2倍，平均提高幅度為44.59％。
表1 cDHPS TO代不同轉(zhuǎn)基因植株葉片中的游離賴氨酸含量


2)RiLKR轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株葉片中的游離賴氨酸含量檢測現(xiàn)用與步驟1)中相同的方法檢測RiLKR轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株葉片中的游離賴氨酸含量，結(jié)果游離賴氨酸含量沒有明顯提高，原因是水稻葉片中LKR/SDH的表達量很低，因此，在RiLKR轉(zhuǎn)基因水稻葉片中對賴氨酸表達的抑制作用不明顯，與預(yù)期結(jié)果相符。
3)RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株葉片中的游離賴氨酸含量檢測為使實驗數(shù)據(jù)更加準確，現(xiàn)采用精度更高的高壓液相層析儀(HPLC)對RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株葉片中的游離賴氨酸含量進行檢測，以野生型植株為對照(wt)，采取OPA柱前衍生的HPLC方法(牟德海.OPA柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸含量.色譜，1997.15(4)319-321)，參數(shù)如下流動相(A)10mmol Na2HPO4-NaH2PO4pH7.2(PB)，含0.3％THF(四氫呋喃)；(B)PB-甲醇-乙腈(50∶35∶15)。梯度在40min內(nèi)，B液的含量逐漸從0上升到100％。流速1mL/min；柱溫40℃監(jiān)測波長340nm。檢測結(jié)果如圖6所示，與野生型植株相比，RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的游離賴氨酸含量仍未見明顯提高，原因是在RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻中，DHPS的表達是受種子特異性啟動子GluA-3啟動的，該基因在葉片中沒有表達，因此游離賴氨酸含量沒有提高，與預(yù)期結(jié)果相符。
2、轉(zhuǎn)基因水稻種子中的游離賴氨酸含量檢測1)cDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子中的游離賴氨酸含量檢測現(xiàn)用與步驟1中相同的茚三酮法測定cDHPS轉(zhuǎn)基因T0代水稻的種子(稱為T1代種子)的游離賴氨酸含量。由于T1代種子中轉(zhuǎn)入的外源基因呈1∶2∶1比例分離，理論上有3/4的種子含有外源基因。為更準確地表示選取樣品中的轉(zhuǎn)基因種子的比例，隨機選取50粒T1代種子發(fā)芽培養(yǎng)，然后在檢測hygromycin引物P5(5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’和P6(5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’)的引導(dǎo)下，對這些水稻苗中的外源基因進行PCR檢測，可擴增出1000bp條帶的為轉(zhuǎn)基因陽性植株，計算轉(zhuǎn)基因陽性種子在全部種子中所占的比例，結(jié)果轉(zhuǎn)基因種子的陽性率為0.82；另外隨機選取同一株系的50粒種子，用與步驟1中相同的茚三酮法測定游離賴氨酸含量，結(jié)果取平均值，然后將所得的平均值除以轉(zhuǎn)基因種子陽性率，獲得的校正值可代表50粒T1代轉(zhuǎn)基因陽性種子的游離賴氨酸含量，同時用同樣的方法測定50粒野生型水稻種子的游離賴氨酸含量(wt)，結(jié)果如表2所示，測定結(jié)果的直觀圖見圖7，同野生型相比，cDHPS轉(zhuǎn)基因水稻的游離賴氨酸含量平均提高了60％。
表2 cDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子的游離賴氨酸含量

2)RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株種子中的游離賴氨酸含量檢測從10個RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因株系和2個野生型植株中分別隨機選取50粒種子測定陽性率，并用與步驟1相同的液相色譜法測定游離賴氨酸含量，同時測定轉(zhuǎn)基因水稻種子的千粒重。游離賴氨酸含量的色譜圖如圖8所示(A圖為野生型種子的游離賴氨酸含量，B圖為RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因種子的游離賴氨酸含量，C為A圖和B圖的疊加)，具體數(shù)據(jù)見表3，游離賴氨酸平均含量比較的直觀圖見圖9，RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻10個株系的游離賴氨酸平均含量為19.47μg/g，是野生型游離賴氨酸平均含量的9.14倍，最高可達野生型游離賴氨酸含量的18倍。RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子的千粒重統(tǒng)計結(jié)果見表3，同野生型植株相比，整體上有所下降，而且游離賴氨酸含量越高，千粒重越低，但種子的飽滿度和大小并無明顯變化(野生型和上述三種轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子外觀的比較見圖10)，原因可能是在轉(zhuǎn)基因種子成熟過程中，淀粉的含量降低而蛋白質(zhì)的含量相對增高，使得種子的比重略有降低，從而導(dǎo)致千粒重下降。
表3 RiLKR/sDHPS轉(zhuǎn)基因T1代種子游離賴氨酸含量及千粒重


序列表<160>2<210>1<211>300<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>1gggaaaagat tgcttgcatt tgggaaattt gctgggagag ctggactgat agacttctta60cacggtctcg gacaacggta cttgagcctt ggatactcga ccccatttct ctctctaggg120caatcacata tgtatccttc actcgctgca gccaaggctg cagtcattgc cattggtgaa180gagatagcaa catttggact tccatctgga atttgcccaa tagtatttgt attcactgga240actggaaatg tttctcaggg tgcgcaagag atattcaagt tactgcccca tagctttgtt300<210>2<211>879<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>2atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt60cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt120tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg180atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac240gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc300ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa360gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc420tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc480aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat540tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat600
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權(quán)利要求
1.用于提高水稻種子中賴氨酸含量的載體，是含有水稻種子特異啟動子，細菌二氫吡啶羧酸合酶基因和水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列的植物表達載體；所述二氫吡啶羧酸合酶基因位于水稻種子特異啟動子下游，所述水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列位于組成型表達啟動子下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述水稻種子特異啟動子為水稻胚乳特異性啟動子GluA-3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述細菌二氫吡啶羧酸合酶基因為大腸桿菌的二氫吡啶羧酸合酶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述水稻賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列的正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的載體，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體為pHOS、pHDR1、pCAMBIA系列載體或pBI121。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于所述出發(fā)載體為pHOS。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于所述植物表達載體為RiLKR×sDHPS-pHOS。
8.一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法，是將權(quán)利要求1所述的載體導(dǎo)入水稻組織或細胞，得到種子中游離賴氨酸含量得到提高的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高水稻種子中賴氨酸含量的方法及其專用載體。該專用載體是含有水稻種子特異啟動子，細菌二氫吡啶羧酸合酶基因和水稻賴氨酸－酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列的植物表達載體；所述二氫吡啶羧酸合酶基因位于水稻種子特異啟動子下游，所述水稻賴氨酸－酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因干擾RNA編碼序列位于組成型啟動子下游。用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因水稻株系中，種子中的游離賴氨酸含量和野生型相比提高了18倍；此外，轉(zhuǎn)入的外源基因?qū)λ镜纳L發(fā)育沒有任何影響。本發(fā)明的方法及其專用載體將在水稻種子賴氨酸含量的提高中發(fā)揮巨大作用，并為水稻及其它植物的品種改良提供了一條新的途徑。
文檔編號C12N15/53GK1834252SQ200610066719
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者王喜萍, 于鯤, 陳麗娜, 謝瑩, 夏勉, 鄧興旺 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司