專利名稱：高賴氨酸玉米Opaque7基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays L.)是世界上也是我國(guó)主要的糧食和飼料作物，從1995年開始， 我國(guó)玉米的總產(chǎn)量已經(jīng)超過小麥，成為僅次于水稻的第二大糧食作物。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，從1998 年開始，玉米的總產(chǎn)量已超過小麥和水稻成為全球第一大糧食作物。作為食品、飼料和燃料的重要來源，玉米的全球需求和消耗正在急劇增加。預(yù)計(jì)到2017年，全球玉米和小麥的年產(chǎn)量需要再增加2億噸才能滿足全世界的需求。為應(yīng)對(duì)世界糧食危機(jī)，保證我國(guó)的糧食安全，國(guó)務(wù)院提出了到2020年再增產(chǎn)糧食1000億斤的戰(zhàn)略目標(biāo)，其中需要新增玉米400億斤。隨著我國(guó)以及世界上一些其它新興國(guó)家飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品的需求大幅度增加。作為“飼料之王”的玉米對(duì)畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有舉足輕重的作用，這就對(duì)玉米的營(yíng)養(yǎng)成份的改良提出了更高的要求。玉米籽粒主要成份為淀粉、蛋白質(zhì)和油脂，其中對(duì)營(yíng)養(yǎng)成份起決定作用的是蛋白質(zhì)。玉米籽粒的蛋白含量主要是由玉米的儲(chǔ)藏蛋白控制的，玉米最主要的儲(chǔ)藏蛋白是醇溶蛋白，約占蛋白總量的60%左右，它是一類在種子發(fā)育過程中特異表達(dá)的蛋白，主要起貯存自由氨基酸的作用。醇溶蛋白又可以進(jìn)一步分為四類，分別是a、P、Y和S醇溶蛋白。 其中最大的一類是a醇溶蛋白，a醇溶蛋白基因家族根據(jù)所編碼蛋白的分子大小，又分為 22-kDa醇溶蛋白和19-kDa醇溶蛋白兩個(gè)部分。a醇溶蛋白約占醇溶蛋白的80%以上，是決定種子蛋白含量重要因素。雖然醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酸，但缺乏必需氨基酸尤其是色氨酸和賴氨酸，這些含量豐富的醇溶蛋白包含的氨基酸成分十分不均衡，造成以玉米為食物來源的人類和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)缺乏。人類必需的8種氨基酸中，以賴氨酸影響最大，但在普通玉米中缺乏也最多。高賴氨酸玉米與普通玉米最本質(zhì)的區(qū)別是胚乳中各種蛋白質(zhì)組成及蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異。高賴氨酸玉米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高的原因是其醇溶蛋白含量由普通玉米的55. 1%下降至22. 9% ;而谷蛋白、白蛋白、球蛋白含量提高，其中谷蛋白由普通玉米的31. 8%上升至50. 1%。由此表明，玉米種子中儲(chǔ)藏蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著地影響著玉米作為動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此對(duì)蛋白質(zhì)含量以及成分的改變是改造玉米籽粒的關(guān)鍵途徑。玉米在品質(zhì)性狀的改造上有賴于一些籽粒的突變體。在玉米中有一類與蛋白品質(zhì)相關(guān)的突變體，被稱為高賴氨酸突變體。這類突變體一般具有不透明或粉質(zhì)的籽粒，在玉米遺傳上被稱為Opaque或Floury突變體。這類突變體能夠顯著改善玉米籽粒中賴氨酸等必需氨基酸的含量，從而顯著提高玉米在蛋白水平的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。其中最為有名的是0paqUe2 突變體(似)，似已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在高賴氨酸玉米的育種實(shí)踐中。o7是另一種能顯著提高玉米籽粒賴氨酸含量的重要突變，已有研究表明，在蛋白水平上，突變體與其相應(yīng)的野生型相比，胚乳中總蛋白的含量較野生型相比降低了 20.7%，醇溶蛋白和非醇溶蛋白分別降低了 33. 4%和15. 1% ;與醇溶蛋白的降低相對(duì)應(yīng)，在氨基酸水平上，o7突變體與其相應(yīng)的野生型相比，賴氨酸(Iys)含量升高了 38.2%。如能將07突變體引入生產(chǎn)品種，則能進(jìn)一步提高籽粒的賴氨酸(Iys)含量，培育出高賴氨酸(Iys)含量的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米新品種。因此，07突變體可以改善玉米籽粒的蛋白品質(zhì)，對(duì)培育品質(zhì)更高的玉米有很好的應(yīng)用價(jià)值。07基因雖然已經(jīng)被克隆，但是07基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因?yàn)?7由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長(zhǎng)的時(shí)間。DNA分子標(biāo)記輔助育種是一項(xiàng)新的育種技術(shù)，該技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)控制目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在早期進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因識(shí)別難的問題，從而加速育種進(jìn)程，提聞?dòng)N效率。與常規(guī)育種相比，該技術(shù)可提聞?dòng)N效率2-3倍。DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是(I)獲得的分子標(biāo)記應(yīng)該是能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合07類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性標(biāo)記；(2)獲得的共顯性分子標(biāo)記與控制目標(biāo)性狀基因的連鎖情況，連鎖越緊密在其后代中錯(cuò)選的概率越低，如果該標(biāo)記來源于控制目標(biāo)性狀基因，則利用該分子標(biāo)記在其后代中錯(cuò)選的概率為零；(3)該標(biāo)記可以區(qū)分突變體與國(guó)內(nèi)所有主要育種親本。以往研究中并沒有獲得位于07基因上并且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，故無法對(duì)該基因所控制的目標(biāo)性狀進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助選擇，同時(shí)，以往也為獲得能夠區(qū)分突變體與國(guó)內(nèi)所有主要育種親本的分析標(biāo)記。所以，對(duì)于該種標(biāo)記的獲得和鑒定是對(duì)控制玉米籽粒高賴氨酸含量農(nóng)藝性狀的07基因進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的之二在于提供該分子標(biāo)記的用途。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記6837D，所述的特異性引物的堿基序列為
正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;
反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。一種上述的高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。本發(fā)明利用高賴氨酸玉米(07/07)與其他具優(yōu)良性狀的玉米雜交獲得Fl代，F(xiàn)l代自交后篩選具有目的性狀的高賴氨酸玉米F2，F(xiàn)2代多次自交，最終獲得穩(wěn)定的純合體。本發(fā)明提供I個(gè)位于07基因上并且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，以及利用這個(gè)共顯性DNA分子標(biāo)記對(duì)07基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的方法。利用這個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。利用這個(gè)分子標(biāo)記能區(qū)分突變體與國(guó)內(nèi)539種主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測(cè)到o7基因的存在。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高， 操作簡(jiǎn)單，為利用基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。


圖I o7/o7和野生型籽粒中醇溶蛋白、非醇溶蛋白和總蛋白的含量變化圖2 o7/o7和野生型籽粒中總的賴氨酸含量變化圖3為玉米籽粒純合突變體外形圖(o7/o7)；
圖4是玉米籽粒野生型(+/+)
圖5是用于進(jìn)行07基因克隆的BC群體構(gòu)建路線；
圖6標(biāo)記6837D在BC群體中的分離情況，其中1、2和4為o7/o7純合體；3、5、6和7 為07/+雜合體；H20為負(fù)對(duì)照，o7/o7為純和突變體，+/+為純和野生型；
圖I是本發(fā)明中分子標(biāo)記在玉米十號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的示意位置，其中CENlO代表第十號(hào)染色體著絲粒，TEL代表端粒；
圖8是標(biāo)記6837D在539種國(guó)內(nèi)不同育種自交系間的多態(tài)情況；_為H20是負(fù)對(duì)照、+ 為+/+是野生型對(duì)照，CK為o7/o7是突變體對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施事例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一利用突變體(o7/o7)培育高賴氨酸玉米
由于o7突變體與其相應(yīng)的野生型相比，胚乳中總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量分別降低了 20. 7%、33.4%和15. 1%，參見圖1，賴氨酸(Iys)含量升高了 38. 2%，參見圖2，因此利用該基因與其他優(yōu)良品種的雜交可以培育出高賴氨酸玉米。把突變純合體 (o7/o7)與其他具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的玉米雜交，然后Fl代自交，在F2代中分離出高賴氨酸玉米籽粒的隱性純合體。該隱性純合體經(jīng)多代自交，輪回選擇，逐代選擇籽粒發(fā)育好，賴氨酸含量高的種子，最終獲得穩(wěn)定的隱性純合體，高賴氨酸自交系或群體，即獲得高賴氨酸商品玉米。實(shí)施例二共顯性分子標(biāo)記的獲得及與07基因連鎖關(guān)系的確定
圖3和圖4為玉米籽粒野生型(+/+)與玉米籽粒純合突變體(07/07)外形圖。通過純合突變體(07/07)與純合野生型(+/+)雜交獲得Fl (07/+)，然后以Fl為母本，純合突變體為父本進(jìn)行回交構(gòu)建回交(BC)群體，參見圖5。BC群體中出現(xiàn)了基因型分離，包含07/+與 07/07兩種基因型，參見圖6，具有07/+基因型的與+/+基因型的籽粒均為非Opaque的野生型類型籽粒，具有07/07基因型的籽粒為Opaque的突變體類型。本發(fā)明通過經(jīng)典的遺傳定位獲知07基因定位在玉米第10號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上 (BinlO. 07)。通過在07位點(diǎn)附近為純合突變體和純合野生型的植株構(gòu)建的回交群體(BC)， 提取純合突變體、野生型以及BC群體各單株的基因組DNA，利用圖位克隆的方法克隆了該基因，獲得了該基因的DNA序列。經(jīng)過序列分析表明，該基因在基因組上與野生型相比缺失了 12個(gè)堿基。轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)表明，該基因即為07基因。本研究依據(jù)突變基因o7與野生型基因07的差別序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過擴(kuò)增特異性引物，共顯性分子標(biāo)記6837D。所述的特異性引物為
正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;
反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG ;
所得到共顯性分子標(biāo)記6837D能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的。由于該標(biāo)記位于07基因上，故該分子標(biāo)記與該基因完全連鎖，參見圖7。使用這個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇準(zhǔn)確度很高，在任何背景下，標(biāo)記6837D與07基因的交換率為0，使用這個(gè)標(biāo)記確定07基因的錯(cuò)選率為O。實(shí)施例三分子標(biāo)記在不同親本間的多態(tài)性鑒定
提取o7/o7突變體純和，野生型純和和B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539種育種中廣泛使用的自交系的基因組DNA，通過PCR反應(yīng)分析在不同品種間的多態(tài)性。結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的分子標(biāo)記6837D對(duì)o7與B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539中育種親本DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳分析表明，6837D在o7與B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539中育種親本都具有多態(tài)性，參見圖8。此結(jié)果證明，分子標(biāo)記6837D能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測(cè)到o7基因的存在，可用于與這些育種材料培育高賴氨酸玉米時(shí)o7基因的輔助選擇且錯(cuò)選率為O。
序列表
<110>上海大學(xué)
〈120〉高賴氨酸玉米基因0paque7的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
〈160〉 2
〈210〉 I
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
CCACG GAAGC CCGGG TCAGT20
〈210〉 2 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 2
GCGTC CACCT CGATC GGGG19
權(quán)利要求
1.一種高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標(biāo)記,其特征在于該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記6837D，所述的特異性引物的堿基序列為正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高賴氨酸玉米Opaque7基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記6837D，所述的特異性引物的堿基序列為正向引物從5′端至3′端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；反向引物從5′端至3′端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。利用這個(gè)與o7基因完全連鎖的分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中o7基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。同時(shí)，利用這個(gè)分子標(biāo)記能區(qū)分突變體與539種國(guó)內(nèi)主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測(cè)到o7基因的存在，且錯(cuò)選率為0。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，為利用o7基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102586241SQ20121005118
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者孫鑫, 宋任濤, 樊向瑜, 王剛, 王樹, 王桂鳳, 王飛, 詹紅蕊, 許政暟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)