專利名稱：一種富鋅亮菌多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥食兩用的菌類多糖及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及富含微量營養(yǎng)元素的菌類多糖及其制備方法和應(yīng)用，確切地說是富鋅亮菌多糖及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
亮菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]又名假蜜環(huán)菌，是我國首次發(fā)現(xiàn)的一種具有藥用兼食用的擔(dān)子菌。中醫(yī)認為，該菌性寒、味甘，有強筋壯骨、明目、利肺、益腸胃等保健功效，在我國民間多作為治療急慢性肝炎及膽道疾患的中草藥。從其中提取的亮菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)、護肝、抑瘤、升白等多種藥理活性。
鋅是人體必需的微量元素之一，它是許多金屬酶的組成成分或酶的激活劑；鋅參與細胞基因的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、蛋白質(zhì)生物合成、激素與受體結(jié)合等，促進生長發(fā)育與組織再生，促進維生素A的生理和代謝以及參與免疫功能等；尤其在有機化之后，形成的鋅-有機復(fù)合物對人體可產(chǎn)生各種特殊的生理功能和高度的生化效應(yīng)。目前已有報道，多種藥用菌對鋅具有富集作用且富鋅后其藥理活性增強。
隨著人類利用輻射的日趨廣泛，人體受輻射的機會增多，致使對輻射損傷的機制和防護藥物研究成為人們關(guān)注的焦點。研究表明，多種多糖具有抗輻射作用，是非常有前景的天然輻射防護劑。亮菌的固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵方法國內(nèi)已經(jīng)有報道，但利用固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵使亮菌富鋅并從中制備富鋅亮菌多糖，進一步研究其抗輻射的生物活性，迄今為止未見報道。制備富鋅亮菌多糖和研究其醫(yī)藥用途對研制、開發(fā)富鋅亮菌多糖功能性產(chǎn)品具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用亮菌富集鋅的特性制備富鋅亮菌菌索并從中提取富鋅亮菌多糖，進而深入研究其藥理作用，旨在拓展亮菌的應(yīng)用范圍，所要解決的技術(shù)問題是由出發(fā)菌株培養(yǎng)得到富鋅亮菌菌索并從中提取富鋅亮菌多糖，進一步研究此多糖所具有的抗輻射藥理活性。
本發(fā)明所稱的富鋅亮菌多糖是以亮菌菌株為出發(fā)菌株、經(jīng)液態(tài)富鋅靜置發(fā)酵培養(yǎng)制備富鋅亮菌菌索，從該富鋅亮菌菌索中提取得到的富鋅亮菌多糖。
所謂液態(tài)富鋅靜置發(fā)酵培養(yǎng)就是在富含鋅的液體培養(yǎng)基中進行靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。
本富鋅亮菌多糖的制備方法，以亮菌菌株為出發(fā)菌株，包括液態(tài)富鋅靜置發(fā)酵培養(yǎng)和富鋅亮菌多糖的提取、分離及干燥，其特征在于所述液態(tài)富鋅發(fā)酵培養(yǎng)是亮菌接種在滅菌的pH5～8的液體培養(yǎng)基中于24～30℃條件下培養(yǎng)15～25天制備富鋅亮菌菌索，所述的液體培養(yǎng)基為每1000ml中含以下組分及重量葡萄糖100～200g， 蔗糖 150～200g， 玉米粉 100～200g，乙醇 5～15ml， KH2PO40.5～3g，MgSO40.2～2g， ZnSO4400～800mg。
優(yōu)選每1000ml液體培養(yǎng)基中各組分重量為葡萄糖120～180g， 蔗糖 170～230g， 玉米粉 120～180g，乙醇 7～13ml，KH2PO40.6～2g，MgSO40.3～1g，ZnSO4500～700g。
最佳每1000ml液體培養(yǎng)中各組分重量為葡萄糖150g， 蔗糖200g，玉米粉150g，乙醇10ml，KH2PO41g，MgSO40.5g， ZnSO4600mg。
液態(tài)培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選pH6～7，最佳pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)的溫度優(yōu)選24～28℃，最佳25～27℃，培養(yǎng)時間優(yōu)選16～24天，最佳18～22天。液態(tài)靜置發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后便得到富鋅亮菌菌索。
所述的自富鋅亮菌菌索中提取富鋅亮菌多糖就是將富鋅亮菌菌索勻漿后用水提醇沉法進行提取，首先用75～85℃的水浸提至少2次，分離、合并水浸提液，濃縮水浸提液以提高多糖的濃度，然后在0～10℃條件下加入乙醇使多糖沉淀(濃縮液與乙醇的體積比為1∶2～1∶5)，分離、干燥，得富鋅亮菌多糖。優(yōu)選75℃水浸提，4℃時醇沉。
本培養(yǎng)方法富鋅率達90～95％，即液體培養(yǎng)基中的無機鋅絕大部分被亮菌菌索所富集。
本發(fā)明所稱的富鋅亮菌多糖為無定形灰色粉末，提取得率達14％，多糖含量為75～80％，有機鋅含量105～135mg/g。經(jīng)DNS(3、5-二硝基水楊酸)比色法和苯酚硫酸法測定，該提取物屬多糖類化合物，稱富鋅亮菌多糖(ZnATS)。當(dāng)用離子交換法吸附、分離、純化后得到兩種多糖組分，分別稱ZnATS-1、ZnATS-2。ZnATS-1呈灰色，ZnATS-2呈白色。
本ZnATS，無毒，安全性好。
毒性試驗取健康昆明小鼠30只，雌雄各半，體重18～22g，禁食(自由飲水)12h，次日上午、下午各灌胃ZnATS一次，濃度為200mg/ml，容量為0.5ml/10g體重，連續(xù)7d，正常飼養(yǎng)并觀察給藥間隔及給藥動物反應(yīng)和死亡情況。結(jié)果給藥后小鼠在30min內(nèi)活動減少，隨后恢復(fù)正常，攝食、糞便、毛發(fā)等均無明顯異常，亦無一小鼠死亡。結(jié)果顯示ZnATS給小鼠灌胃的最大耐受量＞14g/kg，提示ZnATS安全性好。
本發(fā)明用ZnATS對60Coγ射線致小鼠損傷動物模型進行了試驗，結(jié)果表明ZnATS對γ射線所致小鼠輻射損傷有明顯的保護作用。
1.ZnATS對受照小鼠存活率的影響實驗方法昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分7組，即空白對照組和輻射對照組、陽性對照組(參芪片，劑量8g/kg，濃度0.4g/ml)、ATS組、ZnATS高、中、低劑量受試組，每組15只。空白和輻射對照組每天灌0.4ml生理鹽水，其余各組灌相同體積的相應(yīng)藥物。另外，除空白對照組外，其余各組小鼠于ig后D7d進行60Coγ一次性照射，總劑量為8.0Gy。各組小鼠繼續(xù)ig14d，觀察輻射后30d內(nèi)小鼠的存活率。30d存活率＝(每組小鼠30d存活數(shù)/每組小鼠總數(shù))×100％；保護指數(shù)＝實驗組鼠平均存活天數(shù)/輻射對照組鼠平均存活天數(shù)。
實驗結(jié)果由表1可知，ZnATS高、中、低劑量組存活率分別為40％、33.3％和13.3％，分別比輻射對照組提高33.33％、26.63％和6.67％；平均存活時間分別延長10.67、9.94和5.00d，其中高、中劑量組與照射對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，且其保護系數(shù)K值分別達1.73和1.68，說明有保護意義(K＞1.20)。ZnATS與同劑量組的ATS比較，平均存活時間有所延長但無生物學(xué)意義(P＞0.05)。
表1ZnATS對8.0Gyγ射線受照小鼠平均壽命和30d存活率的影響(n＝15，x±s)

注與輻射對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01.
2.ZnATS對受照小鼠外周血血象的影響實驗方法昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分7組，即空白對照組和輻射對照組、陽性對照組(劑量8g/kg，濃度0.4g/ml)、ATS組、ZnATS高、中、低劑量受試組，每組10只?？瞻缀洼椛鋵φ战M每天灌0.4ml生理鹽水，其余各組灌相同體積的相應(yīng)藥物。另外，除空白對照組外，其余各組小鼠于ig后第7d進行60Coγ一次性照射，總劑量為4.0Gy。各組小鼠繼續(xù)灌胃，分別在照射前1d、照射后第3d、第7d、第10d、第14d取小鼠尾血，用常規(guī)顯微計數(shù)法測量外周血白細胞數(shù)。
實驗結(jié)果由表2可知，照射后，ZnATS 3個劑量組小鼠外周血白細胞數(shù)與空白組比較，白細胞總數(shù)明顯下降；繼續(xù)給藥灌胃，各組小鼠白細胞都在回升；且于照射后第10d、第14d與輻射對照組相比，有生物學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，其中，ZnATS高劑量組白細胞回升效果較陽性對照組好，而且ZnATS組小鼠白細胞回升速度較同劑量ATS組的快。說明中、高劑量ZnATS溶液能促進輻照后外周血中白細胞數(shù)的恢復(fù)，從而起到加速患者體質(zhì)恢復(fù)的功能。
表2ZnATS對4.0Gyγ射線受照小鼠外周血白細胞數(shù)的影響(n＝10，x±s)

注與輻射對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與亮菌多糖組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
3.ZnATS對受照小鼠骨髓DNA含量和體重的影響實驗方法另取昆明中小鼠，分組、給藥和輻射劑量同動物模型試驗2。每5天稱小鼠體重一次，計算小鼠輻射前后體重變化。并取處死后小鼠的一側(cè)股骨骨髓，用紫外分光光度計測量其DNA含量。
實驗結(jié)果ZnATS各劑量組的骨髓DNA含量與照射對照組比較，有極顯著性提(P＜0.01)；與同劑量組ATS的比較，有顯著性差異(P＜0.05)；說明ZnATS溶液能一定程度上能修復(fù)由輻射造成的對小鼠骨髓DN A的損傷。另外，小鼠體重在輻射后增加的幅度明顯減?。焕^續(xù)給藥后，各給藥組小鼠體重較輻射對照組有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表3。
表3ZnATS對4.0Gyγ射線受照小鼠骨髓DNA含量和bw的影響(n＝10，x±s)

注與輻射對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與亮菌多糖組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.014.ZnATS對受照小鼠骨髓微核和精子畸變的影響實驗方法取動物模型試驗3中的小鼠，將取處死后小鼠的另一側(cè)股骨骨髓，以小牛血清涂片，染色，采用雙盲法計數(shù)，每只小鼠計數(shù)1000個骨髓嗜多染紅細胞(PCE)的微核(MN)數(shù)，計數(shù)微核細胞數(shù)，以千分率表示。另取小鼠附睪，以生理鹽水制片，染色，顯微觀察1000個精子，計數(shù)畸變精子數(shù)，以千分率表示。
實驗結(jié)果由表4可知，小鼠受到照射后，有微核的骨髓嗜多染紅細胞數(shù)和有畸變的精子細胞數(shù)較正常組明顯增加。給藥后，ZnATS 3個劑量組的小鼠微核率和精子畸變率與照射對照組比較均有極顯著降低(P＜0.01)，使其更接近正常組水平；與同劑量組的ATS比較，也有顯著性差異(P＜0.05)；說明ZnATS溶液對由輻射造成的小鼠骨髓微核率和精子畸變率上升，有較好的對抗作用。
表4 ZnATS對4.0Gyγ射線受照小鼠骨髓微核和精子突變率的影響(n＝10，x±s)

注與輻射對照組比較較*＜0.05，**P＜0.0
電離輻射對機體造成的損傷是多方面的，如引起突變、造成衰老和縮短壽命，尤其是對造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的損傷。本實驗的ZnATS中、高劑量組能提高8.0Gy照射小鼠平均存活時間和30d存活率，可以顯著回升4.0Gy照射小鼠受照小鼠骨髓DNA含量和外周血白細胞數(shù)、降低骨髓微核率和精子畸變率；其中部分指標測定結(jié)果比陽性對照組和亮菌多糖組更接近正常組水平。表明ZnATS有明顯的抗輻射作用。
綜上所述，ZnATS能促進受輻射損傷的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能的恢復(fù)，并對它們具有一定的保護作用。ZnATS本身毒性低，代謝后成為機體的營養(yǎng)物質(zhì)，而有機鋅有利于機體的吸收，無蓄積作用。實驗結(jié)果表明，富鋅亮菌多糖類物質(zhì)是一種有潛在價值的抗輻射活性物質(zhì)，可用于相關(guān)人群對輻射傷害的預(yù)防或因輻射、放療引起的輻射損傷的臨床治療。也可用于相關(guān)人群的抗輻射膳食食品或保健食品。這就是說ZnATS在制備抗輻射藥品或保健品中的應(yīng)用。
ZnATS同ATS和其他多糖類物質(zhì)一樣具有良好的加工性，可與藥學(xué)上允許的多種輔料加工成口服制劑，如糖漿劑、片劑、膠囊膠、顆粒劑等。
本發(fā)明中培養(yǎng)基配方法簡單、原料便宜、操作穩(wěn)定、周期短，鋅富集率高，有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，規(guī)?；?。ZnATS的提取工藝也很簡單，ZnATS中有機鋅含量高。
具體實施例方式
(一)、培養(yǎng)基的配制取500ml蒸餾水，加入下表中各組分，然后用蒸餾水稀釋至1000ml，消毒滅菌，備用。

(二)、發(fā)酵培養(yǎng)與多糖的提取在無菌條件下以接種量為5g/L，將亮菌菌種接種在裝有上表中任一培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，在26℃條件下液態(tài)靜置發(fā)酵培養(yǎng)20天。培養(yǎng)結(jié)束后收集富鋅亮菌菌索，并用持續(xù)透析法將菌索中的無機鋅除去。具體方法為將富鋅亮菌菌索在含有0.02％疊氮化鈉的雙蒸水中反復(fù)透析，直到用茚三酮法檢驗透析液中無氨基酸為止。再將透析后富鋅菌索勻漿，用80℃的水浸提3次，分離得到水浸提液并濃縮，流水透析24h后再濃縮，在4℃條件下加入乙醇使多糖沉淀(濃縮液與乙醇的體積比為1∶3)，然后分離，復(fù)溶，用Sevag法除去蛋白質(zhì)，冷凍干燥后得富鋅亮菌多糖。該有機鋅含量為105～135mg/g。
(三)、富鋅亮菌多糖中鋅含量的測定用原子吸收分光光度法測定，具體方法如下電子天平稱取經(jīng)冷凍干燥的富鋅亮菌多糖樣品約2.0g左右，放入坩堝內(nèi)，加(1+10)磷酸0.5mL，小火炭化約2h，再在溫度為500℃馬福爐中灰化8h，灰化后待坩堝冷卻，加混合酸少許，再小火加熱至無黑色碳粒，取出后用1mol/L鹽酸定容至50mL容量瓶中，即樣液。吸取0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL鋅標準使用液分別置于50mL容量瓶中，以1mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻。將處理后的樣液、試劑空白液和各容量瓶的鋅標準液分別用美國熱力公司M6型原子吸收分光光度計進行測定，在波長213.90nm、狹縫0.20nm、燈電流2.60A、電壓455.00V、空氣流量5.0L/min、乙炔流量1.2L/min的條件下測定鋅元素的含量。
(四)、富鋅亮菌多糖制劑1、顆粒劑取富鋅亮菌多糖100g，甘露醇390g和適量甜味劑投入高速攪拌制粒機中，混合5min后加入5％羥丙甲纖維素繼續(xù)攪拌制濕粒，熱風(fēng)干燥后噴入適量香精混勻，18目篩整料。
2、膠囊劑取干淀粉25g、乳糖15g、滑石粉10g、十二烷基硫酸鈉1g，用倍量稀釋法混合均勻后加入100g富鋅亮菌多糖混合均勻，將該粉末直接裝膠囊。
3、片劑取富鋅亮菌多糖100g，微晶纖維素18g，淀粉75g混合均勻，10％PVP乙醇溶液適量制軟材，過篩制濕粒，干燥、整粒后加硬脂酸鎂混勻壓片。
4、糖漿劑取富鋅亮菌多糖100g，蔗糖650g，苯甲酸納2g，先加純化水溶解，然后用純化水稀釋至1000ml。
5、注射用凍干粉取富鋅亮菌多糖100g，注射用水200ml，經(jīng)無菌過濾后分裝于2ml安瓿瓶中，低溫冷凍干燥后無菌熔封。
權(quán)利要求
1.一種富鋅亮菌多糖，其特征在于本多糖是自亮菌菌株經(jīng)液態(tài)富鋅靜置發(fā)酵制備的富鋅亮菌菌索中提取得到的富鋅亮菌多糖，多糖含量75～80％，有機鋅含量105～135mg/g。
2.由權(quán)利要求1所述的富鋅亮菌多糖的制備方法，以亮菌菌株為出發(fā)菌株，包括液態(tài)富鋅靜置發(fā)酵培養(yǎng)和富鋅亮菌多糖的提取、分離及干燥，其特征在于(1)、所述液態(tài)富鋅發(fā)酵培養(yǎng)是亮菌接種在滅菌的pH5～8的液體培養(yǎng)基中于24～30℃條件下培養(yǎng)15～25天制備富鋅亮菌菌索，所述的液體培養(yǎng)基為每1000ml中含以下組分及重量葡萄糖100～200g，蔗糖150～250g，玉米粉100～200g，乙醇5～15ml，KH2PO40.5～3g，MgSO40.2～2g， ZnSO4400～800mg。(2)、所述的富鋅亮菌多糖的提取就是將菌索勻漿后用75～85℃的水浸提至少2次，分離、合并水浸提液，濃縮后于0～10℃條件下加入乙醇使多糖沉淀，分離后將沉淀干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于pH6～7的每1000ml液體培養(yǎng)基中各組分重量為葡萄糖120～180g，蔗糖170～230g，玉米粉120～180g，乙醇7～13ml， KH2PO40.6～2g，MgSO40.3～1g， ZnSO4500～700g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于pH6.5的每1000ml液體培養(yǎng)基中各組分重量為葡萄糖150g，蔗糖200g，玉米粉150g，乙醇10ml，KH2PO41g，MgSO40.5g，ZnSO4600mg。
5.由權(quán)利要求1所述的富鋅亮菌多糖的用途，其特征在于富鋅亮菌多糖在制備抗輻射藥品或保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
一種富鋅亮菌多糖，由亮菌在富含鋅的液體培養(yǎng)基中經(jīng)靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備的富鋅亮菌菌索中提取得到的多糖，為無定形灰色粉末，提取率達14％，其多糖含量75～80％，有機鋅含量105～135mg/g。實驗結(jié)果表明，本多糖無毒，能促進受輻射損傷的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能的恢復(fù)，具有抗輻射作用，可應(yīng)用于制備抗輻射藥品或保健食品。
文檔編號C12N1/14GK1970577SQ20061009812
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日
發(fā)明者沈業(yè)壽, 鄭媛 申請人:安徽大學(xué)